CN111849937A - 川桑n-乙酰-5羟色胺转移酶snat5及其应用 - Google Patents

川桑n-乙酰-5羟色胺转移酶snat5及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111849937A
CN111849937A CN201910342322.7A CN201910342322A CN111849937A CN 111849937 A CN111849937 A CN 111849937A CN 201910342322 A CN201910342322 A CN 201910342322A CN 111849937 A CN111849937 A CN 111849937A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hydroxytryptamine
acetyl
transferase
snat5
mulberry
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910342322.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111849937B (zh
Inventor
赵爱春
郑莎
张帅
朱映雪
刘长英
向仲怀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southwest University
Original Assignee
Southwest University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southwest University filed Critical Southwest University
Priority to CN201910342322.7A priority Critical patent/CN111849937B/zh
Publication of CN111849937A publication Critical patent/CN111849937A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111849937B publication Critical patent/CN111849937B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/10—Nitrogen as only ring hetero atom

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了川桑N‑乙酰‑5羟色胺转移酶SNAT5及其应用，川桑N‑乙酰‑5羟色胺转移酶SNAT5由全长为471bp的SNAT5基因编码156个氨基酸，PI＝5.26，将川桑N‑乙酰‑5羟色胺转移酶基因SNAT5克隆后构建原核表达系统，重组表达后进行酶活测定，测得具有较高的色胺转移酶的活性，因此川桑N‑乙酰‑5羟色胺转移酶SNAT5基因可以作为工程菌的目的基因，川桑N‑乙酰‑5羟色胺转移酶SNAT5也可以作为体外催化5‑羟色胺转化为N‑乙酰‑5羟色胺、色胺转化为N‑乙酰‑5羟色胺、或5‑甲氧‑色胺转化为褪黑素，具有很好的应用前景。

Description

川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5，还涉及N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的应用。
背景技术
褪黑素，学名N-乙酰基-5-甲氧基-色胺，是一种吲哚胺，色氨酸的代谢产物。目前已知它广泛存在于人体、动物体及植物体内，生理作用非常广泛。由于其首先在人体的松果体内被发现，因此又被称为松果体素。随后的研究发现，其广泛存在于人体内的各个部位，含量极少，只有pg(1×10-12g)/mL水平。目前已知的褪黑素的生理功能主要有调节生物体的昼夜节律，缓解睡眠障碍；抗氧化，褪黑素本身及其代谢产物不仅有强大的自由基清除能力，而且能够诱导生物体相关抗氧化酶活性增强，增强免疫作用，抗肿瘤，抗衰老，特别是对阿尔茨海默病有明显效果等优点。
长期以来褪黑素被认为是动物体内专有的，自从1995年在植物中检测到褪黑素之后，人们陆续在许多高等植物中也发现褪黑素存在。在动物中，褪黑素的生物合成途径已经非常清楚。在植物中褪黑素的合成途径包括3条：(1)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；色氨酸羟化酶将色胺转化为5-羟色胺；N-乙酰-5羟色胺转移酶将5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺；N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶将N-乙酰-5羟色胺转化成褪黑素。(2)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；N-乙酰-5羟色胺转移酶将色胺转化为N-乙酰-5羟色胺；N-乙酰色胺氧甲基转移酶将N-乙酰-5羟色胺转化成褪黑素。(3)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；色氨酸羟化酶将色胺转化为5-羟色胺；N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶将5-羟色胺转化成5-甲氧基-色胺；N-乙酰色胺转移酶将5-甲氧基-色胺转化成褪黑素。
N-乙酰色胺转移酶基因(SNAT5)可以将5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺，色胺转化为N-乙酰-5羟色胺，5-甲氧基色胺转化成褪黑素，因此N-乙酰色胺转移酶SNAT5是褪黑素合成中的重要酶促步骤。川桑中含有褪黑素，但是其含量极低，并不能大量提取获得。因此，研究褪黑素合成途径的N-乙酰色胺转移酶SNAT5及其基因，有利于体外合成途径的建立，为褪黑素规模化生产点奠定基础。
发明内容
有鉴于此，本发明采用分子生物学技术，克隆出褪黑素合成相关酶N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5的核苷酸序列、分析该基因的核苷酸和翻译的氨基酸序列，然后采用大肠杆菌原核表达系统进行褪黑素合成相关酶N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的功能验证。用发酵的产物纯化、得到相关的色氨酸脱羧酶直接体外合成N-乙酰-5羟色胺、N-乙酰-5羟色胺和褪黑素。即本发明的目的在于提供一种川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5；本发明的目的之二在于提供川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5基因；本发明的目的之三在于提供所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5在制备5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、或5-甲氧色醇转化为褪黑素的催化剂中的应用；本发明的目的之四在于提供所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5在原核生物中重建褪黑素合成途径中的应用；本发明的目的之五在于提供一种制备重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的方法；本发明的目的之六在于提供由所述的方法制得的重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5；本发明得目的之七在于提供所述重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5在制备5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、或5-甲氧色醇转化为褪黑素的催化剂中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5，所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，编码川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2、一种川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5，所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3、所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5在作为5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、或5-甲氧-色胺转化为褪黑素的催化剂中的应用。N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5可以在体外催化反应，也可以在宿主体内，宿主可以为原核细胞，还可以为真核细胞。
4、所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5在宿主细胞中重建褪黑素合成途径中的应用，所述SNAT5为5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、或5-甲氧-色胺转化为褪黑素的关键酶基因中的应用。
5、一种制备重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的方法，所述将如SEQ ID NO.3所示的川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5连入Pcold-tf质粒KpnⅠ和BamHI酶切位点，获得重组表达载体Pcold-tf-SNAT5，再将获得的重组表达载体转化表达菌株B21(DE3)，在28℃、IPTG终浓度为1mM条件下诱导表达，提取，纯化，获得重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5。
优选的，所述提取的方法是收集菌体，在功率为200W条件下超声破碎，超声总时间15min，每超声1s，暂停3s；然后在4℃、15000g条件下离心20min，收集上清。
优选的，所述纯化是使用镍柱纯化，用含咪唑浓度为100mM的洗脱液进行洗脱。
6、由所述的方法制得的重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5。本发明获得的重组酶当底物为色胺时候，其表达产物的酶促反应最适底物浓度为0.05μm，最适温度为37℃，最适pH为碱性(pH＝7.8)，最适反应时间为10分钟；当底物为5-羟色胺时候，其表达产物的酶促反应最适底物浓度为2.0μm，最适温度为37℃，最适pH为碱性(pH＝7.8)，最适反应时间为10分钟；当底物为5-甲氧基色胺时，其表达产物的酶促反应最适底物浓度为2.0μm，最适温度为28℃，最适pH为酸性(pH＝7.8)，最适反应时间为10分钟。
7、所述重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5在作为5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、或5-甲氧-色胺转化为褪黑素的催化剂中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5及其基因，将川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5进行原核表达和酶活性的测定，测得其具有较高的N-乙酰色胺转移酶的活性，其DNA碱基序列和氨基酸序列均与已报道的色氨酸脱羧酶基因序列有差异。因此，我们认为这是新的N-乙酰-5羟色胺转移酶基因，其原核表达的酶活性高，作为工程菌的目的基因，制备重组酶作为催化剂体外合成褪黑素前体或褪黑素，褪黑素前体最后经不同的途径合成褪黑素，作为抗肿瘤，抗衰老，特别是对阿尔茨海默病候选药物，具有很好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5基因扩增电泳图。
图2为Pcold-tf-MnSNAT5诱导上清经镍柱纯化后咪唑洗脱SDS-PAGE电泳图(1：蛋白质Marker；2：Pcold-tf空载(+IPTG)；3：重组子(-IPTG)；4：重组子(+IPTG)；5：上清经最适浓度咪唑浓度洗脱液)。
图3为底物色胺、5-羟色胺在N-乙酰-5-羟色胺转移酶的催化下生成物经UPLC-MS/MS鉴定的质谱图(A：N-乙酰-5-羟色胺标品；B：生成物(底物在SNAT5酶催化下生成物))。
图4为5-甲氧基-色胺在N-乙酰-5-羟色胺转移酶的催化下生成物经UPLC-MS/MS鉴定的质谱图(A：褪黑素标品；B：底物在SNAT5酶催化下生成物)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中商业N-乙酰-5-羟色胺(Sigma，市售价1388元/100mg)、褪黑素(Sigma，市售价2599元/100mg)和5-甲氧基-色醇(Sigma，市售价1050元/100mg)作为标品对照，检验N-乙酰-5羟色胺转移酶基因所表达的酶活性。
实施例1、川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5克隆
根据Morus.SNAT5 datebase上已报道的Morus.SNAT5 N-乙酰-5羟色胺转移酶基因(Morus015389)设计SNAT5基因扩增引物，SNAT5基因上游引物为：5'-ggggtaccatgcaatgtagtgattcttc-3'(SEQ ID NO.1)，SNAT5基因下游引物为：5'-cgggatcctcaaatgaagtacttcac-3'(SEQ ID NO.1)。以川桑的cDNA为模版，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物，进行PCR扩增。扩增获得SNAT5基因全长进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，测序后回收目的基因，然后与pMD19-T载体连接，转入E.coli.Trans1-T1感受态细胞，获得的阳性克隆送往华大基因公司测序。测序结果显示，SNAT5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸如SEQ ID NO.4所示。
实施例2、川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5重组载体构建及原核表达
将实施例1扩增的SNAT5基因目片段与Pcold-tf空质粒分别用KpnⅠ和BamHI进行双酶切，回收产物以T4DNA连接酶将其连接，获得重组载体Pcold-tf-SNAT5，再将获得的重组载体转化入大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，经鉴定正确的Pcold-tf-SNAT5送往华大基因公司测序，测序结果与第一次测序得到的序列一致从而获得了正确的序列。
提取Pcold-tf-SNAT5质粒，将其转入表达菌株B21(DE3)，在1.5ml的离心管加入450μl含有Amp抗性的LB培养基，按照1：100扩大培养到试管中，28℃，220rpm摇床培养至OD600＝0.6，取1ml菌液保存了作为诱导前阳性对照，加入IPTG进行诱导，IPTG中浓度为1mM，28℃下诱导8h，诱导后各取1ml菌液保存作为诱导后总蛋白，剩余菌液4℃，5000rpm离心10min收菌，弃上清，菌体用PBS洗两次；超声破碎，超声功率为200W，超声1s，暂停3s，超声总时间15min；4℃，15000×g，20min，取上清于新的离心管中。将之前保存的诱导前和诱导后的菌液10000rpm离心1min沉淀用PBS重悬，加入适量5×Loading buffer。取破碎离心后的上清加入适量5×Loading buffer。将加入的样品沸水浴，之后12000rpm离心2min，吸取上清进行检测目的蛋白的表达情况。
将含Pcold-tf-SNAT5质粒的菌株诱导8小时的上清进行镍柱纯化，分别用含咪唑浓度为：100mM，200mM，250mM，300mM的洗脱液进行洗脱，SDS-PAGE检测其咪唑洗脱浓度，结果为100mM的咪唑可以将大量的目的蛋白洗脱下来(图2)。
实施例3、重组N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5浓度及活性检测
取含Pcold-tf-SNAT5质粒的菌株诱导8小时的上清经镍柱纯化，后采用UPLC测定酶促反应的产物的物质量来表示酶活力，酶的活力单位定义为每分钟生成1nmol的物质的量为一个比活力即1U诱导菌液摇了8小时之后，5ml上清经纯化后，用10ml浓度为100mM的咪唑洗脱，洗脱后，洗脱液里面所含N-乙酰-5羟色胺转移酶的浓度为0.104mg/ml。
使用浓度为0.05μM的色胺为底物，在温度为37℃、pH为7.8条件下使用酶活力1.41U的N-乙酰-5羟基色胺转移酶反应20min，然后用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图3所示。结果显示，生成N-乙酰-5羟色胺总量为28.217nmol(6179.5ng)。
使用浓度为2.0μM的5-羟色胺为底物，在温度37℃，pH为7.8条件下使用酶活力为264U的N-乙酰-5羟基色胺转移酶反应20min，然后用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图3所示。结果显示，生成N-乙酰-5羟色胺总量为5279.9nmol(1156298.1ng)。
使用浓度为1.0μM的5-甲氧基色胺为底物，在温度为37℃、pH为7.8条件下使用酶活力为0.042U的N-乙酰-5羟基色胺转移酶反应10min，然后用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图4所示。结果显示，生成褪黑素总量为0.42nmol(97.86ng)。
上述结果表明，N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5经原核表达后具有N-乙酰色胺转移酶活性，可以直接作为体外合成褪黑素的催化剂，也可以构建原核生物中重建褪黑素合成途径以大规模合成褪黑素。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
序列表
<110> 西南大学
<120> 川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggggtaccat gcaatgtagt gattcttc 28
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgggatcctc aaatgaagta cttcac 26
<210> 3
<211> 471
<212> DNA
<213> 川桑(Morus alba)
<400> 3
atgcaatgta gtgattcttc cagcgaatca gagcggtttc gagttcgaag attagaattg 60
ttggacaaaa ataagggttt tatagagcta ctgcaacagc taactgtatg tgattctgtg 120
tctgacaaag aattcggaga gagatttcga gagctcagct cccttggaga taatcatttg 180
attggtgtta ttgaagatca gttcggaaag attgttgcaa ctgggagtgt attcattgag 240
aagaagttca taaggaattg tggcaaagtc gggcacattg aagatgtcgt ggtcgatggc 300
agcactcgtg ggatgcaact gggaaagaag attgttgaat tcctctcgga tcatgcccgt 360
tcagtcgggt gttacaaggt gattcttgac tgcagcattg agaatagatc attctatgaa 420
aaatgtggct tcaagcagaa agaaattcag atggtgaagt acttcatttg a 471
<210> 4
<211> 156
<212> PRT
<213> 川桑(Morus alba)
<400> 4
Met Gln Cys Ser Asp Ser Ser Ser Glu Ser Glu Arg Phe Arg Val Arg
1 5 10 15
Arg Leu Glu Leu Leu Asp Lys Asn Lys Gly Phe Ile Glu Leu Leu Gln
20 25 30
Gln Leu Thr Val Cys Asp Ser Val Ser Asp Lys Glu Phe Gly Glu Arg
35 40 45
Phe Arg Glu Leu Ser Ser Leu Gly Asp Asn His Leu Ile Gly Val Ile
50 55 60
Glu Asp Gln Phe Gly Lys Ile Val Ala Thr Gly Ser Val Phe Ile Glu
65 70 75 80
Lys Lys Phe Ile Arg Asn Cys Gly Lys Val Gly His Ile Glu Asp Val
85 90 95
Val Val Asp Gly Ser Thr Arg Gly Met Gln Leu Gly Lys Lys Ile Val
100 105 110
Glu Phe Leu Ser Asp His Ala Arg Ser Val Gly Cys Tyr Lys Val Ile
115 120 125
Leu Asp Cys Ser Ile Glu Asn Arg Ser Phe Tyr Glu Lys Cys Gly Phe
130 135 140
Lys Gln Lys Glu Ile Gln Met Val Lys Tyr Phe Ile
145 150 155

Claims (10)

1.一种川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5，其特征在于：所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
2.根据权利要求1所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5，其特征在于：编码川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.一种川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5，其特征在于：所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.权利要求1所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5在作为5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、或5-甲氧-色胺转化为褪黑素的催化剂中的应用。
5.权利要求3所述川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶基因SNAT5在宿主细胞中重建褪黑素合成途径中的应用，其特征在于：所述SNAT5为5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、或5-甲氧-色胺转化为褪黑素的关键酶基因中的应用。
6.一种制备重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的方法，其特征在于：所述将如SEQID NO.3所示的川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5基因连入Pcold-tf质粒KpnⅠ和BamHI酶切位点，获得重组表达载体Pcold-tf-SNAT5，再将获得的重组表达载体转化表达菌株B21(DE3)，在28℃、IPTG终浓度为1mM条件下诱导表达，提取，纯化，获得重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5。
7.根据权利要求6所述制备重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的方法，其特征在于：所述提取的方法是收集菌体，在功率为200W条件下超声破碎，超声总时间15min，每超声1s，暂停3s；然后在4℃、15000g条件下离心20min，收集上清。
8.根据权利要求6所述制备重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5的方法，其特征在于：所述纯化是使用镍柱纯化，用含咪唑浓度为100mM的洗脱液进行洗脱。
9.由权利要求6～8任一项所述的方法制得的重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5。
10.权利要求9所述重组川桑N-乙酰-5羟色胺转移酶SNAT5在作为5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、色胺转化为N-乙酰-5羟色胺、或5-甲氧-色胺转化为褪黑素的催化剂中的应用。
CN201910342322.7A 2019-04-26 2019-04-26 川桑n-乙酰-5羟色胺转移酶snat5及其应用 Active CN111849937B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910342322.7A CN111849937B (zh) 2019-04-26 2019-04-26 川桑n-乙酰-5羟色胺转移酶snat5及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910342322.7A CN111849937B (zh) 2019-04-26 2019-04-26 川桑n-乙酰-5羟色胺转移酶snat5及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111849937A true CN111849937A (zh) 2020-10-30
CN111849937B CN111849937B (zh) 2023-10-24

Family

ID=72951661

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910342322.7A Active CN111849937B (zh) 2019-04-26 2019-04-26 川桑n-乙酰-5羟色胺转移酶snat5及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111849937B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113604521A (zh) * 2021-06-30 2021-11-05 河北维达康生物科技有限公司 一种增强n-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
庄维兵: "褪黑素在植物生长发育过程中与植物激素的关系" *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113604521A (zh) * 2021-06-30 2021-11-05 河北维达康生物科技有限公司 一种增强n-乙酰基-5-羟基色胺产量的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111849937B (zh) 2023-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111849935A (zh) 川桑咖啡酸氧甲基转移酶comt3及其应用
CN111040980B (zh) 高产低分子量透明质酸的重组谷氨酸棒杆菌及其构建方法与应用
CN112063670A (zh) 一种腺苷酸环化酶制备环磷酸腺苷的方法
CN113736763B (zh) 黑芥子酶Rmyr及其在制备萝卜硫素、莱菔素中的应用
CN111849936A (zh) 川桑n-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶asmt12及其应用
CN111849950A (zh) 川桑色氨酸脱羧酶tdc及其应用
CN113234699A (zh) α-1,2-岩藻糖基转移酶及其应用
CN113637654B (zh) 一种重组磷脂酶d突变体及其在合成磷脂酰丝氨酸中的应用
CN111849937A (zh) 川桑n-乙酰-5羟色胺转移酶snat5及其应用
CN111849934B (zh) 粤桑大十n-乙酰-5羟色胺氧甲基转移酶及其应用
CN113462678B (zh) 一种谷氨酸脱羧酶突变体
CN112662644B (zh) 一种甘油磷酸二酯磷酸二酯酶突变体及其应用
CN112574980B (zh) 一种热稳定性和高酶活力的重组褐藻胶裂解酶及其应用
CN111849931A (zh) 川桑色氨酸羟化酶t5h2及其应用
CN112852691B (zh) 一种产mk-7的重组大肠杆菌及其构建方法和应用
CN101497863B (zh) 一种制备N-末端乙酰化的胸腺素α1的方法及其专用工程菌
CN114196640B (zh) 一种源于新型贝类的l-肌肽合成酶atpgd及其应用
CN112522222B (zh) 一种新的色氨酸羟化酶突变体及其应用
CN113980880B (zh) 基因工程菌及其应用和以葡萄糖为原料生产阿洛酮糖的方法
CN106995484B (zh) 一种利用定点突变和分子修饰技术改造的珍珠贝肉抗氧化肽及其构建和制备方法
CN112266923B (zh) 一种表达腺苷蛋氨酸合酶的枯草芽孢杆菌及应用
CN110438055B (zh) 一种含有苯丙酮酸脱羧酶突变体的全细胞催化剂及在生产苯乙醇中的应用
CN102190730A (zh) 一种生物素蛋白连接酶融合蛋白
CN113862290A (zh) 一种来源于甘草的异黄酮4′-o-甲基转移酶及其应用
CN107354137A (zh) 一种高活性的硒代蛋白及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant