CN111849811A - 一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系及其培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效快速分解复合菌系及其培养方法，其组成微生物的最适生长温度在30‑37℃之间，而分泌的木质纤维素分解的相关酶发挥作用的最适温度在50‑60℃之间，通过温度的调节，在微生物最适的生长温度富集产酶，而后通过低温激活后，提高酶的柔韧性，使木质纤维素分解酶以最低的能耗与底物结合并发挥催化作用，最后在高温阶段，酶在高温下发挥最大的作用，进而高效快速的分解木质纤维素类原料。

Description

一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系及其培养方法

技术领域

本发明涉及秸秆分解领域，尤其涉及一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系及其培养方法。

背景技术

我国作为农业大国，农作物秸秆的大量产生是不可避免的。据统计，我国每年的秸秆产量可达9亿t，加工副产物约5.8亿t。然而其综合利用率不到40％，剩余的60％被随意丢弃、堆放或燃烧，这无疑对环境造成不容忽视的影响。因此开发新的技术将作物秸秆转化为高附加值的产品，对促进社会经济的可持续发展和生态环境的改善具有重要意义，秸秆的成分是木质纤维素、糖类、淀粉、脂肪、蛋白质，其主要成分为木质纤维素，占秸秆的60％以上。木质纤维素是具有高结晶度、结构复杂、极难被分解的物质。微生物分解木质纤维素主要靠分泌的酶作用，包括纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶等等。研究发现，多种酶对木质纤维素的水解能力远远大于单组分的酶，只有多种酶的协同作用才能更好的水解木质纤维素，目前还没有发现可以分泌具有足够数量的包括所有必须酶的微生物，

目前很多的研究是将纯培养的微生物单独培养后再混合，虽然比单一组分的微生物的效果好，但把各个单菌简单的混合，会使得微生物之间产生了拮抗作用或产物抑制作用，削弱了分解过程中酶制剂的合成速率，进而影响了分解效率；木质素的高效分解需要多种菌的协同作用才可以完成，但是，微生物的最适生长温度一般在30-37℃之间，而木质纤维素的相关分解菌产生的酶发挥作用的最适温度在50-60℃之间，这使得在菌群最适生长温度培养菌分泌酶，酶不能发挥最大作用，但若在酶发挥作用的最适温度下，菌处于休眠状态，无法产酶，酶的浓度、所处温度具对底物分解速率起到催化作用，因此如何平衡菌群中酶的产生速率与所处温度是加快底物分解速率的关键。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效分解秸秆的复合菌系，以解决上述秸秆分解效率低的技术问题，同时提供一种高效分解秸秆的复合菌培养方法，平衡酶催化效率与菌群的产酶效率。

本发明为解决上述技术问题，采用以下技术方案来实现：一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系，菌系组成为：分泌淀粉酶和蛋白酶的枯草芽孢杆菌(保藏号ACCC10634)、分泌蛋白酶的蜡状芽孢杆菌(保藏号ACCC10607)、分泌木质素酶的铜绿假单胞菌(保藏号CGMCC 1.10712)、分泌纤维素酶的溶纸梭菌(保藏号ACCC00544)、分泌半纤维素酶的毕赤酵母(保藏号ACCC21000)，所述复合菌系各菌种的菌落形成单位数目比为：枯草芽孢杆菌:蜡状芽孢杆菌:铜绿假单胞菌:溶纸梭菌:毕赤酵母＝(12-15):(13-15):(15-18):(23-25):(24-26)，复合菌系中酶的浓度为5g/L；

通过控制菌落中产生各种酶的菌种来控制相应酶的产量，且上述菌落或其产生的产物之间不会出现拮抗作用而相互抑制，各微生物的生长处于协同共生的平衡状态，其所产生的酶也可以协同发挥作用，高效分解木质纤维素类原料。

优选的，将甘蔗渣、玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、纸壳中的一种以1:10的比例与复合菌系混合分解，分解时长为48小时；

复合菌系于2t发酵罐中发酵，有效体积为1.5t，将10％的甘蔗渣、玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、纸壳中的一种加入的发酵罐进行分解。

一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系培养方法，其特征在于：包括如下步骤，

S1、菌种培养

种子液培养基制备：蛋白胨12g，酵母浸粉7g，氯化钠10g，磷酸二氢钾0.42g，磷酸氢二钾0.21g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，酸碱度7.0，121℃灭菌15min，灭菌结束后，倒于平板上，冷却、凝固备用；

将保藏的菌种先经斜面活化，以恢复其最佳性能，为制作种子做准备，而后在超净工作台将斜面活化的种子划线培养，并置于32℃培养箱培养3天，将培养至对数生长期的菌种在无其他菌影响的环境下与种子液培养基转接入1L的三角瓶中，于32℃、200rpm条件下培养2天，得到种子液；

S2、种子液扩大培养：种子扩大培养首先在200L种子罐中进行，培养48h后，对种子质量进行检测，合格后放入扩大培养罐，进行复合菌系的发酵培养；

S3、复合菌系发酵

复合菌系的培养在发酵培养基中采用常温发酵、低温激活、高温水解的三段发酵方式。

优选的，所述S3中常温发酵条件为：发酵温度保持32℃，0-14小时，通气量为1m³/min；15-38小时，通气量为2m³/min；39-48小时，通气量为1.2m³/min。

优选的，所述S3中常温发酵条件为：在6℃下保持12h。

优选的，所述S3中高温水解条件为：以5℃/h为单位逐渐提高培养温度，最终升至55℃，培养48h。

此时各酶活需达到的最低要求为：淀粉酶活≥50IU/ml，蛋白酶活≥78IU/ml，木质素过氧化物酶活≥62IU/ml，内切葡聚糖酶活≥86IU/ml，外切葡聚糖酶活≥98IU/ml，纤维素总酶活≥90IU/ml，木聚糖酶活≥156IU/ml，β-D-木糖苷酶酶活≥112IU/ml，且总酶蛋白浓度达到5g/L；

采用三段式的培养方式，第一阶段，常温下培养微生物，使其快速生长产酶；第二阶段，低温下，降低分子热运动水平，提高酶的柔韧性，使木质纤维素分解酶以最低的能耗与底物结合并发挥催化作用；第三阶段；逐渐提高温度至高温，酶快速发挥作用，高效分解木质纤维素。

优选的，所述S3中发酵培养基成分包括玉米粉9kg，大豆蛋白粉4.5kg，麸皮3kg，葡萄糖1kg，七水硫酸镁0.3kg,氯化钠0.4kg，氯化钙0.8kg，磷酸氢二钾0.3kg，磷酸二氢钾0.15kg，硫酸锰0.3kg，氯化铁0.2kg，酸碱度7.2，在121℃灭菌30min，冷却至37℃时接入种子罐培养菌种；

复合菌系培养基，为菌群繁殖、分泌提供最佳的能量配比与繁殖环境。

本发明的有益效果是：

1、针对底物中较为难分解的木质纤维素，以特定的菌群在一定比例范围内复合形成复合菌系，复合菌系中多种菌群协同高效分解木质素，从而提高底物的分解效率，适用于甘蔗渣、玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、纸壳等难分解的木质纤维素含量较高的底物分解；

2、采用三段培养的方式培养复合菌系，通过不同阶段温度的调节，在微生物最适的生长温度富集产酶，而后通过低温激活后，提高酶的柔韧性，使木质纤维素分解酶以最低的能耗与底物结合并发挥催化作用，最后在高温阶段，酶在高温下发挥最大的作用，进而高效快速的分解木质纤维素类原料；

3、针对复合菌群的生长需求配置特定的复合菌群培养基，为复合菌群提供最佳的繁殖、分泌酶的环境。

附图说明

图1为本发明发酵过程中微生物数量的变化的曲线图；

图2为本发明三段发酵过程中各种酶酶活的柱状图；

图3为本发明复合菌系分解甘蔗渣过程中分解率变化的柱状图；

图4为本发明复合菌系分解甘蔗渣过程中各成分分解率变化的柱状图；

图5为本发明复合菌系分解小麦秸秆过程中分解率变化的柱状图；

图6为本发明复合菌系分解小麦秸秆过程中各成分分解率变化的柱状图；

图7为本发明复合菌系分解水稻秸秆过程中分解率变化的柱状图；

图8为本发明复合菌系分解水稻秸秆过程中各成分分解率变化的柱状图

图9为本发明复合菌系分解纸壳过程中分解率变化的柱状图；

图10为本发明复合菌系分解纸壳过程中各成分分解率变化的柱状图；

图11为本发明添加外源微生物对复合菌系分解玉米秸秆的影响柱状图；

图12为本发明添加外源微生物对复合菌系生物量的影响柱状图；

图13为本发明添加外源微生物对复合菌系酶活力的影响柱状图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.以下实施方式中所用培养基及培养条件为：

种子液培养基(150L)：蛋白胨1.8kg，酵母浸粉1.05kg，NaCl1.5kg，磷酸二氢钾63g，磷酸氢二钾31.5g，pH7.2。在121℃灭菌30min。培养条件为：在32℃培养48h。发酵0-14小时，通气量为100L/min；15-38小时，通气量为200L/min；39-48小时，通气量为120/min。

发酵培养基(1.5t)：玉米粉9kg，大豆蛋白粉4.5kg，麸皮3kg，葡萄糖1kg，MgSO4·7H2O0.3kg,NaCl0.4kg，CaCl20.8kg，K2HPO40.3kg，KH2PO40.15kg，MnSO40.3kg，FeCl30.2kg，pH7.2。在121℃灭菌30min，冷却至37℃时接入种子罐培养菌种。分为三段：(1)常温发酵：发酵温度保持32℃，0-14小时，通气量为1m³/min；15-38小时，通气量为2m³/min；39-48小时，通气量为1.2m³/min。(2)低温激活：6℃保持12h。(3)高温水解：逐渐提高培养温度，以5℃/h为单位，最终升至55℃，培养48h。

2.以下实施方式中所用检测方法为：

(1)总减重测定：在酶解玉米秸秆48h后，取出全部底物，测定玉米秸秆的总减重。培养混合物在12000×g离心10分钟，将离心得到的残余秸秆用盐酸和硝酸的混合液冲洗而消除菌体以去离子水洗至中性，于105℃烘干后称重，计算减重及减重率。

(2)将分解后残余的底物过1mm筛，准确称取0.5g，装入F57专用袋中，用ANKOM220型纤维分析仪测定中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)及酸性木质素的含量。其中半纤维素含量＝NDF-ADF，纤维素含量＝ADF-ADL-AIA，木质素含量＝ADL。

(3)酶活性测定：

以三段式产酶技术培养完成后，取培养液，在4℃、5000×g离心15min。取上清液测定淀粉酶、蛋白酶、木质素过氧化物酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素总酶活、木聚糖酶活和β-D-木糖苷酶，测定八种酶活性所使用的底物依次为1％可溶性淀粉、0.5％酪蛋白、2mM藜芦醇、2％羧甲基纤维素钠、1％微晶纤维素、50mg滤纸、0.5％燕麦木聚糖和1％水杨苷，将底物溶于pH为6.24的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液(1/15mol/L)，1个酶活力单位(IU)定义为每分钟粗酶液水解底物产生1μg产物所需的酶量。

a.蛋白酶活性测定方法：利用福林-酚试剂法进行蛋白酶活性的测定。试管中加入1mL酶粗提液,加入0.5％的酪蛋白溶液2mL，37℃水浴反应15mi后立即加入10％的三氯乙酸3mL终止反应，取出反应液常温离心(6000rpm,2min),去除沉淀后吸取上清液1mL，向其中加入浓度为0.55mol/LNa2CO3溶液5mL，再加入福林-酚试剂1mL，于37℃恒温水浴中显色15min，然后在680nm波长下比色测定。

b.木质素过氧化物酶活性测定方法：利用藜芦醇氧化速率法定。利用酶标仪，设置30℃反应条件，通过移液枪分别吸取2mM藜芦醇30μL、50mMpH＝2.5的酒石酸钠缓冲液139μL、30μL的粗酶液于酶标板上，再以1μL0.4mMH2O2启动反应，最后在波长310nm处测定并记录1min内体系吸光度的变化值。

c.淀粉酶、内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶、纤维素总酶活、木聚糖酶活和β-D-木糖苷酶活性测定方法：利用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定。取0.5mL底物溶液在55℃预热5min后，加入0.5mL上清液，在55℃反应30min，取出进行沸水浴5min。反应过程中释放的还原糖浓度通过DNS测定，在530nm波长处测定吸光值。

(4)生物量(OD)测定：以三段式产酶技术培养完成后，取培养液，在4℃、5000×g离心15min，取上清液在600nm测定OD值。

以下结合附图对实施例进行具体分析

实施例1

一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系，该种复合菌系包括分泌淀粉酶和蛋白酶的枯草芽孢杆菌、分泌蛋白酶的蜡状芽孢杆菌、分泌木质素酶的铜绿假单胞菌、分泌纤维素酶的溶纸梭菌、分泌半纤维素酶的毕赤酵母，所述复合菌系各菌种的菌落形成单位数目比为：枯草芽孢杆菌:蜡状芽孢杆菌:铜绿假单胞菌:溶纸梭菌:毕赤酵母＝12-15:13-15:15-18:23-25:24-26，复合菌系中酶的浓度为5g/L；

复合菌群的组成微生物的最适生长温度在30-37℃之间，而分泌的木质纤维素分解的相关酶发挥作用的最适温度在50-60℃之间，且以特定的比例对各菌种进行配比，分泌相应数量的酶，使各种酶协同分解底物，提高分解效率，同时产生的酶不会由于拮抗导致分解效率降低。

实施例2

如图1-2所示，木质纤维素类物料高效分解复合菌系的发酵方法：

菌种培养：

所述种子液培养基：蛋白胨12g，酵母浸粉7g，NaCl10g，磷酸二氢钾0.42g，磷酸氢二钾0.21g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH7.0，121℃灭菌15min。灭菌结束后，倒于平板上，冷却、凝固备用。

先将保藏的复合菌系先经斜面活化，以恢复其最佳性能，为制作种子做准备。而后在超净工作台将斜面活化的种子划线培养，并置于32℃培养箱培养3天。将培养至对数生长期的种子在无菌环境下转接入1L的三角瓶中，于32℃，200rpm，培养2天。

种子液扩大培养：

种子液扩大培养首先在200L种子罐中进行。培养48h后，对种子质量进行检测，合格后放入扩大培养罐，进行复合菌系的发酵培养；

高效分解复合菌系发酵：

复合菌系的培养分为三段发酵：(1)常温发酵：发酵温度保持32℃，0-14小时，通气量为1m³/min；15-38小时，通气量为2m³/min；39-48小时，通气量为1.2m³/min。发酵结束后，各菌种的菌落形成单位数目(CFU)比为：枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、溶纸梭菌、毕赤酵母12-15:13-15:15-18:23-25:24-26，且有效活菌数为109个/mL以上。(2)低温激活：6℃保持12h。(3)高温水解：逐渐提高培养温度，以5℃/h为单位，最终升至55℃，培养48h。在发酵过程中检测微生物的数量(图1)及发酵液中的各酶酶活(图2)，其中木质素水解酶包括木质素过氧化物酶，纤维素水解酶包括内切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和纤维素总酶活，半纤维素水解酶包括木聚糖酶和β-D-木糖苷酶，此时检测的总蛋白浓度达到5g/L。

实施例3

如图3-4所示，复合菌系对甘蔗渣的分解：

实验方法：

以实施例1中的方法培养复合菌系产酶，2t发酵罐以三段式技术发酵产酶，而后向所产酶液中添加10％的玉米秸秆，酶解48h。分别测定分解过程中第0、24和48h复合菌系分解甘蔗渣的总减重及各成分减重。

实验结果：

复合菌系分解甘蔗渣过程中分解率的变化

在酶解刚开始时(0h)，对甘蔗渣的分解率为0％，在第24h的分解率为74％，而在酶解结束(48h)的时候对甘蔗渣的分解率达到了90％。由此可见复合菌系对甘蔗渣具有较高的分解能力。

复合菌系分解甘蔗渣过程中的各成分减重变化由图4可知，复合菌系对甘蔗渣中纤维素的分解能力最高，其次是半纤维素，最后是木质素，在分解的第48h，甘蔗渣中纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别为98％、88％和60％。

实施例4

如图5-6所示，复合菌系对小麦秸秆的分解：

实验方法：

以实施例1中的方法培养复合菌系产酶，2t发酵罐以三段式技术发酵产酶，而后向所产酶液中添加10％的小麦秸秆，酶解48h。分别测定分解过程中第0、24和48h复合菌系分解小麦秸秆的总减重及各成分减重。

实验结果：

复合菌系分解小麦秸秆过程中分解率的变化：

由图5可知，复合菌系对小麦秸秆的分解能力不如甘蔗渣，但依然具有较高的分解能力。在0h时，对小麦秸秆的分解率为0％，在第24h的分解率为65％，而在酶解结束(48h)的时候对小麦秸秆的分解率达到了82％。

复合菌系分解小麦秸秆过程中的各成分减重变化：

复合菌系对小麦秸秆中的半纤维素的分解能力最高，其次是纤维素，最后是木质素。尤其在分解的第24h，对小麦秸秆中的半纤维素分解率就达到了76％。在分解的第48h，小麦秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别为70％、88％和52％。

实施例5

如图7-8所示，复合菌系对水稻秸秆的分解：

实验方法：

以实施例1中的方法培养复合菌系产酶，2t发酵罐以三段式技术发酵产酶，而后向所产酶液中添加10％的水稻秸秆，酶解48h。分别测定分解过程中第0、24和48h复合菌系分解水稻秸秆的总减重及各成分减重。

实验结果：

复合菌系分解水稻秸秆过程中分解率的变化：

复合菌系对水稻秸秆的分解能力很强，在第24h的分解率就达到了80％，而在酶解结束(48h)的时候对水稻秸秆的分解率达到了95％。

复合菌系分解水稻秸秆过程中的各成分减重变化

由图8可知，复合菌系对水稻秸秆中纤维素和半纤维素都具有很高的分解能力。在分解的第24h，水稻秸秆中纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别为79％、70％和35％。在分解的第48h时，纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别为99％、90％和65％。

实施例6

如图9-10所示，复合菌系对纸壳的分解：

实验方法：

以实施例1中的方法培养复合菌系产酶，2t发酵罐以三段式技术发酵产酶，而后向所产酶液中添加10％的纸壳，酶解48h。分别测定分解过程中第0、24和48h复合菌系分解纸壳的总减重及各成分减重。

实验结果：

复合菌系分解纸壳过程中分解率的变化：

复合菌系对纸壳的分解能力也很强，在酶解结束(48h)的时候对纸壳的分解率达到了87％。

复合菌系分解纸壳过程中的各成分减重变化：

由图10可知，复合菌系对纸壳中纤维素分解率最高，其次是半纤维素，然后是木质素。在分解的第24h，纸壳中纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别为73％、68％和47％。在分解的第48h时，纤维素、半纤维素和木质素的分解率分别为90％、83％和61％。

实施例6

如图11-13所示，复合菌系抵御外源微生物的效果

材料与方法

实验菌株：

实验组中所用到的外源细菌为大肠杆菌、外源霉菌为金色链霉菌、外源乳酸菌为嗜酸乳酸菌；

实验方法：

实验组1-3分别是向150L的复合菌系中添加10％的外源细菌、外源霉菌和外源乳酸菌，共同培养48h。而后以10％的接种量转接入新的200L发酵罐(150L培养基)中，发酵罐培养48h。以此方式培养至第4代时，转入2t发酵罐(1.5t培养基)，以三段式技术发酵产酶，而后向所产酶液中添加5％的玉米秸秆，分别于0、48h取样。

对照组1-3为培养基中只加入10％的外源细菌、外源真菌和外源乳酸菌。对照组4为培养基中只添加10％复合菌系。培养条件同实验组。实验组与对照组分别设置三个重复。

实验结果

实验组1为复合菌系LDMC+大肠杆菌，实验组2为复合菌系LDMC+金色链霉菌，实验组3为复合菌系LDMC+嗜酸乳酸菌；

对照组1为大肠杆菌；对照组2为金色链霉菌，对照组3为嗜酸乳酸菌，对照组4为复合菌系；

添加外源微生物对复合菌系分解玉米秸秆的影响

由图11可知，添加了外源大肠杆菌、金色链霉菌和嗜酸乳酸菌的实验组与只含复合菌系的对照组4相比，对玉米秸秆的分解率分别为84％、83％、85％和85％。而单独培养大肠杆菌、金色链霉菌和嗜酸乳酸菌对玉米秸秆的分解率均为0。接种外援菌对复合菌系的稳定性及分解能力没有影响，也没有明显的促进或抑制作用，说明复合菌系具有较强的调节能力；

添加外源微生物对复合菌系生物量的影响

如图12所示，添加了外源添加了外源大肠杆菌、金色链霉菌和嗜酸乳酸菌的实验组与只含复合菌系的对照组4相比，OD值分别为21.82、22.12、21.58和22.375，没有显著的差别。而单独培养大肠杆菌、金色链霉菌和嗜酸乳酸菌对玉米秸秆的OD值分别为12.24、16.67和18.82。再次证明了复合菌系具有较强的内部调节能力和稳定性。

添加外源微生物对复合菌系酶活力的影响

如图13所示，添加了外源添加了外源大肠杆菌、金色链霉菌和嗜酸乳酸菌的实验组与只含复合菌系的对照组4相比各酶活性没有显著性差异，而单独培养大肠杆菌、金色链霉菌和嗜酸乳酸菌的发酵液中，仅单独的大肠杆菌发酵液的木聚糖酶活性为30IU，证明了复合菌系具有较强的内部调节能力和稳定性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (7)

1.一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系，其特征在于：该种复合菌系包括分泌淀粉酶和蛋白酶的枯草芽孢杆菌、分泌蛋白酶的蜡状芽孢杆菌、分泌木质素酶的铜绿假单胞菌、分泌纤维素酶的溶纸梭菌、分泌半纤维素酶的毕赤酵母，所述复合菌系各菌种的菌落形成单位数目比为：枯草芽孢杆菌:蜡状芽孢杆菌:铜绿假单胞菌:溶纸梭菌:毕赤酵母＝12-15:13-15:15-18:23-25:24-26，复合菌系中酶的浓度为5g/L。

2.根据权利要求1所述的一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系，其特征在于：将甘蔗渣、玉米秸秆、小麦秸秆、水稻秸秆、纸壳中的一种以1:10的比例与复合菌系混合分解，分解时长为48小时。

3.一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系培养方法，其特征在于：包括如下步骤，

S1、菌种培养

种子液培养基制备：蛋白胨12g，酵母浸粉7g，氯化钠10g，磷酸二氢钾0.42g，磷酸氢二钾0.21g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，酸碱度7.0，121℃灭菌15min，灭菌结束后，倒于平板上，冷却、凝固备用；

将保藏的菌种先经斜面活化，以恢复其最佳性能，为制作种子做准备，而后在超净工作台将斜面活化的种子划线培养，并置于32℃培养箱培养3天，将培养至对数生长期的菌种在无其他菌影响的环境下与种子液培养基转接入1L的三角瓶中，于32℃、200rpm条件下培养2天，得到种子液；

S2、种子液扩大培养

种子扩大培养首先在200L种子罐中进行，培养48h后，对种子质量进行检测，合格后放入扩大培养罐，进行复合菌系的发酵培养；

S3、复合菌系发酵

复合菌系的培养在发酵培养基中采用常温发酵、低温激活、高温水解的三段发酵方式。

4.根据权利要求3所述的一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系培养方法，其特征在于：所述S3中常温发酵条件为：发酵温度保持32℃，0-14小时，通气量为1m³/min；15-38小时，通气量为2m³/min；39-48小时，通气量为1.2m³/min。

5.根据权利要求3所述的一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系培养方法，其特征在于：所述S3中常温发酵条件为：在6℃下保持12h。

6.根据权利要求3所述的一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系培养方法，其特征在于：所述S3中高温水解条件为：以5℃/h为单位逐渐提高培养温度，最终升至55℃，培养48h。

7.根据权利要求3所述的一种木质纤维素类物料高效分解复合菌系培养方法，其特征在于：所述S3中发酵培养基成分包括玉米粉9kg，大豆蛋白粉4.5kg，麸皮3kg，葡萄糖1kg，七水硫酸镁0.3kg,氯化钠0.4kg，氯化钙0.8kg，磷酸氢二钾0.3kg，磷酸二氢钾0.15kg，硫酸锰0.3kg，氯化铁0.2kg，酸碱度7.2，在121℃灭菌30min，冷却至37℃时接入种子罐培养菌种。

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