CN111849783B - 一种高抗性栽培用蜜环菌及其应用 - Google Patents

一种高抗性栽培用蜜环菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明“一种高抗性栽培用蜜环菌及其应用”，涉及生物技术领域，该高卢蜜环(Armillaria cepistipes)菌株NRC002,保藏号为CGMCC No.15871。经田间栽培验证，其应用于天麻或猪苓，在坡地条件下与对照产量相当；在平地条件下，产量显著高于对照菌种，具有广阔的应用前景。

Description

一种高抗性栽培用蜜环菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一株高抗性栽培用蜜环菌及其应用。
背景技术
蜜环菌是担子菌门、蜜环菌属的兼性寄生性真菌，广泛分布于世界各地。在中药材天麻和猪苓的生长过程中，天麻和猪苓需要与蜜环菌形成共生关系才能生长发育，蜜环菌为他们提供营养，因此蜜环菌菌种的优劣直接影响天麻和猪苓产量。随着天麻需求量的逐年增加，麻种植区域不断扩大，而在栽培过程中，如何提升天麻的产量和品质是需要解决的主要技术问题。有研究表明，蜜环菌菌种差异是影响天麻、猪苓的产量和品质的关键因素之一。目前市售蜜环菌菌种繁多，很难从外形上分辨，不同菌种的栽培表现在不同地区表现不同，而且很多菌种都不纯，是多种类型蜜环菌混杂在一起，或因遗传变异活性缺失导致产量低，菌株的田间表现良莠不齐，难以预料，成为导致天麻、猪苓的产量和品质不可控的因素。
开发高产高抗性蜜环菌具有高价值的应用前景，也是解决上述技术问题的有效途径。
发明内容
根据上述领域的需求，本发明筛选到一株高抗性栽培用蜜环菌以及该菌株的栽培用途，具体技术方案如下：
本发明从全国天麻和猪苓主产区收集的蜜环菌资源中经分离、纯化，鉴定到一株高卢蜜环菌(Armillaria cepistipes)NRC002，该菌株已经进行保藏和存活验证，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期：2018年6月22日；保藏号为CGMCC No.15871。
所述高卢蜜环菌NRC002，通过中国专利申请201910419080.7中记载的方法，采用专利申请中引物ZTM.F/ZTM.R对蜜环菌进行扩增，扩增产物采用限制性内切酶EcoR V完全酶切后得到大小分别为304bp、183bp和121bp的三个DNA片段，且SEQ ID No.4的第120位为A，第185位为C，第235位为C；大小为183bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第1-183位，且第120位为C；大小为121bp的DNA片段的核苷酸序列为SEQ ID No.4的第184-304位，且对应SEQ ID No.4的第185位为T，对应SEQ ID No.4的第235位为T，确定该菌株属于B型蜜环菌。
一种高抗性栽培用蜜环菌菌种，其特征在于，为培养在固体或液体基质材料中的菌丝体态的上述高卢蜜环菌NRC002。
所述基质材料包含稻壳、玉米粉、锯末中的一种或几种。
一种高抗性栽培用蜜环菌菌棒的制备方法，其特征在于，
(1)选择边材厚度在0.8cm以上、树皮与木质部结合紧密、树皮与木质部完好率在95％、非含油脂性木材；截成长度50±3cm长，直径6cm-10cm的新材；
(2)将所述新材的2～3个侧面砍成鱼鳞口，砍口深入木质部0.3cm，砍口间距5cm-6cm；
(3)在选地的地块上挖培养坑，深度为35cm～40cm，将坑底土壤挖松、整平并铺湿润阔叶树落叶，在坑内铺两层新材，上层与下层呈十字交叉；
(4)新材口和其断面处各摆放上述密环菌的菌枝或菌块，最后覆盖10cm-15cm疏松腐殖土，并覆盖3cm厚湿润阔叶树落叶；
(5)保持培养坑内地温18℃-25℃，土壤湿度35％-50％，培养60-90天，得到蜜环菌菌菌棒。
所述非含油脂性木材为栗木。
所述培养坑深度为35-40cm。
上述方法制备而得的蜜环菌菌棒。
一种栽培天麻或猪苓的方法，其特征在于，包含以下步骤：
(1)选择适生场地中树木侧根和毛细根较为发达的土壤环境，距离树木主根80～120cm挖深20～30cm、长宽各60cm左右的栽培坑，挖坑过程注意保留侧根并在侧根上按间隔10cm设置侧根砍口；
(2)坑底铺1cm厚阔叶树落叶，将4-6根前述蜜环菌菌捧以分别对准所述侧根砍口处的方式摆放在坑底的树叶上；
(3)将300-500g种苓或米麻紧靠于所述蜜环菌菌捧摆放，隙缝填满腐殖质砂壤土，覆盖腐殖土10～15cm至地平，顶部再覆盖一层3cm厚落叶。
所述适生场地为平地环境。本文所指平地环境是指相对于坡地(林下地)，而言。
现有技术中，生产采用的是林下地，多为坡地；通常坡地产量高，而平地产量低。相较坡地，平地更易操作，省时、省力，坡地栽培限制了天麻和猪苓种植产业的发展，但是如何提高平地环境天麻产量，一直是本领域的技术难题。所述方法，还包括对栽培坑进行以下一种或多种温度管理：
在夏季日最高气温≧30℃时在栽培坑上覆盖秸秆、柴草等遮阴；
在夏季日最高气温≧32℃时适量浇水降温，将10cm深处地温控制在26℃以下；以及
在冬春低温季节对栽培坑采用覆盖方法增温、保温，使10cm深处地温保持在12℃以上。
所述方法，还包括，对栽培坑进行以下水分管理：
播种期：播种后不要即时浇水，7天后方浇透水；
生长期：每10-20天浇一次水，使沙土含水率保持在30～45％之间；
在干热风、大旱天气状况下，需每月应至少灌透水一次，避免过度干燥导致蜜环菌菌索生长缓慢、活力降低或死亡。
防涝措施：夏、秋季汛期雨水频繁且雨量大时，将栽培坑屯高并开挖排水沟，以免栽培坑积水；
防旱措施：冬、春季气候干旱时，将栽培坑下游方向围高，以适量保存水分。
本发明分离筛选到一株高抗性栽培用高卢蜜环菌菌株，保藏号为CGMCCNo.15871，经田间栽培验证，其应用于天麻或猪苓，在坡地条件下与对照产量相当；在平地条件下，产量显著高于对照菌种，具有广阔的应用前景。
具体实施方法
以下通过具体实施方式说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1.蜜环菌的分离与鉴定
从全国天麻和猪苓主产区收集的蜜环菌资源中经分离、纯化、鉴定到两株蜜环菌，编号NRC001和编号NRC002
采用专利文献CN110184376中记载的方法鉴定，其中NRC001菌株的葡萄糖含量大于120μg/g,；NRC002的葡萄糖含量小于等于120μg/g；并采用该专利申请中引物ZTM.F/ZTM.R对蜜环菌进行扩增，扩增产物采用限制性内切酶EcoR V完全酶切鉴定，确定NRC001菌株属于A型蜜环菌，NRC002菌株属于B型蜜环菌。
对上述鉴定出来的菌组进行保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；
NRC001保藏日期：2018年11月21日；保藏号为CGMCC No.16789,建议分类命名为法国蜜环菌(Armillaria gallica)，
NRC002保藏日期：2018年6月22日；保藏号为CGMCC No.15871，建议分类命名为高卢蜜环菌(Armillaria cepistipes)。
实施例2.蜜环菌菌种制备
固体培养基质为：制备马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA，在1L锥形瓶中加入2g马铃薯浸粉，10g葡萄糖，0.5L双蒸水溶解，调节pH 5.6-5.8后，加入琼脂5g·L-1，使用封口膜密封，于121℃，高温高压灭菌15min，备用。)，在洁净台中冷却至40-60℃，加入cef溶液(100mg·mL-1头孢氨苄)，使其终浓度为100μg·mL-1，倒入培养器皿中，凝固后即为所需的培养基。
培养步骤/条件：在无菌条件下于PDA培养基接种无菌化处理后的NRC001、NRC002蜜环菌，置于20℃-30℃恒温培养箱中暗培养，培养2-5天后观察，弃掉污染的培养基，未污染菌继续培养10-15天后即可得到所需的蜜环菌菌索。
菌种瓶扩繁：菌种瓶(850mL，φ-8.7cm；H-17cm)中加入2％的葡萄糖溶液300ml，再加入适量木屑后高温灭菌(121℃，15min)。菌种瓶冷却后洁净台中加入上述约1cm蜜环菌菌索，20℃-30℃恒温培养箱中暗培养60天，即得到瓶装蜜环菌菌种瓶。
实施例3.蜜环菌菌棒的制备
材质：
a)树皮与木质部结合紧密，树皮与木质部完好率在95％以上；
b)边材厚度在0.8cm以上；
c)枯立木、腐朽木不能做菌材；
d)幼嫩的树木不能做菌材；
e)选择栗木，不能选用含油脂性木材
新材规格：
新材，长度：50±3cm长，直径：6cm-10cm，优选10cm；超过20cm需要劈开，不然传菌慢。
菌材的制备：
在截好的新材上2～3面砍成鱼鳞口，砍口深入木质部0.3cm，砍口间距5cm-6cm。
培养坑深度为35cm～40cm，长100m，宽70cm，将坑底土壤挖松整平，铺2cm厚湿润阔叶树落叶，下层与上层各摆放5根新材，上层与下层呈十字交叉，新材口和断面处各摆放实施例2制备的菌枝或密环菌培种2-3段；最后覆盖10cm-15cm疏松腐殖土，并覆盖3cm厚湿润阔叶树落叶；
保持地温18℃-25℃，土壤湿度35％-50％，培养60-90天，生长蜜环菌菌索，成为菌材，即蜜环菌菌棒。
实施例4天麻田间栽培实验
本项目拟设计田间实验，比较在不同地形(坡地、平地)和水肥条件下，两株蜜环菌与栽培天麻所收获的天麻产量及形态数据差异。
分组情况
(1)坡地(S)：NRC001、NRC002蜜环菌各＞10个重复。
(2)平地(F)：NRC001、NRC002蜜环菌各＞10个重复。
按照大田(平地)和次生林林下(坡地)两种生态环境种植，共计50窝。
1.实验材料
1.1天麻：要求米麻、白麻(红天麻，非杂交)、大小一致；
1.2蜜环菌：实施例2制备的NRC001、NRC002的菌种，4瓶/平方。
1.3蜜环菌菌棒：实施例3制备。
2播种(用培养好的蜜环菌棒与种苓栽培)
(1)选择适生场地中树木侧根和毛细根较为发达的土壤环境，距离树木主根80～120cm挖深20～30cm、长宽各60cm左右的栽培坑，挖坑过程注意保留侧根并在侧根上按间隔10cm设置侧根砍口；
(2)坑底铺1cm厚阔叶树落叶，将4-6根前述蜜环菌菌捧以分别对准所述侧根砍口处的方式摆放在坑底的树叶上；
(3)将300-500g种苓或米麻紧靠于所述蜜环菌菌捧摆放，隙缝填满腐殖质砂壤土，覆盖腐殖土10～15cm至地平，顶部再覆盖一层3cm厚落叶。
3.田间管理
温度管理
当10cm深处地温稳定在12℃以上时，蜜环菌和猪苓菌开始萌发；此后随着温度的提高，如达到26℃以上，二者的生长均受到抑制，达到30℃时，即进入高温休眠。
遮阴管理：依靠原有树木和杂草类进行遮阴，夏季日最高气温≧30℃时在栽培坑上覆盖秸秆、柴草等遮阴。
浇水降温：夏季日最高气温≧32℃时适量浇水降温，将10cm深处地温控制在26℃以下。
增温管理：冬春低温季节采取覆盖草苫、柴草、秸秆类，或在栽培沟上搭盖塑膜等进行增温、保温，使将10cm深处地温保持在12℃以上，猪苓即可缓慢生长。尽量不要使温度降至8℃以下，以最大程度地延长猪苓的生长时间。
水分管理
播种期管理：播种后不要即时浇水，7天后方可浇透水。
生长期管理：根据土质状况及气候状况，约每10-20天浇一次水，保持沙土含水率保持在30～45％之间。如有干热风、大旱天气等，则应加大浇水频率，并需每月应至少灌透水一次，避免过度干燥导致蜜环菌菌索生长缓慢、活力降低或死亡。
防涝措施：夏、秋季汛期雨水频繁且雨量较大时，将栽培坑稍加屯高，并及时开挖排水沟，以免栽培坑过量积水。
防旱措施：冬、春季气候干旱时，将栽培坑下游方向稍加围高，以适量保存水分。
通气性管理：防止栽培场地周边壅塞和人畜践踏，以保证相应的土壤通气性。
4、采收
采收时间
天麻生长6个月后，可观测天麻生产量。
采收季节
选择2～11月份晴好天气采收，如冬季确需采收，应选择气温高于0℃的晴好天气。
5、栽培产量结果统计：
表1.产量统计
Figure GDA0003435534880000071
其中S代表陡坡，F代表平地。A.B为NRC001、NRC002蜜环菌
结果显示，平地条件下NRC002菌株的产量显著高于NRC002菌株；坡地等良好条件下没有区别。
另外，猪苓栽培实验中，也存在同样的现象，即平地条件下NRC002菌株产量显著高于NRC002菌株；坡地等良好条件下两株菌产量没有区别。
栽培试验说明，本发明分离到一株在不利条件下具有更好的养分利用率(大田、平地干旱、水肥不利)抗性高卢蜜环菌，可以适应平地环境，在平地环境下大幅提高天麻和猪苓产量。

Claims (9)

1.一株高抗性栽培用高卢蜜环菌(Armillaria cepistipes)菌株NRC002,保藏号为CGMCC No.15871。
2.一种高抗性栽培用蜜环菌菌种，其特征在于，为培养在固体或液体基质材料中的菌丝体态的权利要求1所述的高卢蜜环菌NRC002。
3.根据权利要求2所述的高抗性栽培用蜜环菌菌种，其特征在于，所述基质材料为稻壳、玉米粉和锯末中的一种或几种。
4.一种高抗性栽培用蜜环菌菌棒的制备方法，其特征在于，
(1)选择边材厚度在0.8cm以上、树皮与木质部结合紧密、树皮与木质部完好率在95％、非含油脂性木材；截成长度50±3cm长，直径6cm-10cm的新材；
(2)将所述新材的2～3个侧面砍成鱼鳞口，砍口深入木质部0.3cm，砍口间距5cm-6cm；
(3)在选定的地块上挖培养坑，深度为35cm～40cm，将坑底土壤挖松、整平并铺湿润阔叶树落叶，在坑内铺两层新材，上层与下层呈十字交叉；
(4)新材口和其断面处各摆放权利要求2或3所述的密环菌菌种的菌枝或菌块，最后覆盖10cm-15cm疏松腐殖土，并覆盖3cm厚湿润阔叶树落叶；
(5)保持培养坑内地温18℃-25℃，土壤湿度35％-50％，培养60-90天，得到蜜环菌菌菌棒。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述非含油脂性木材为栗木。
6.权利要求4-5任一所述方法制备而得的蜜环菌菌棒。
7.一种栽培天麻或猪苓的方法，其特征在于，包含以下播种步骤：
(1)选择适生场地中树木侧根和毛细根较为发达的土壤环境，距离树木主根80～120cm处挖深20～30cm、长宽各60cm左右的栽培坑，挖坑过程保留侧根并在侧根上按间隔10cm设置侧根砍口；
(2)坑底铺阔叶树落叶，将4-6段权利要求6所述的蜜环菌菌棒以分别对准所述侧根砍口处的方式摆放在坑底的树叶上；
(3)将300-500g米麻或种苓紧靠于所述蜜环菌菌棒摆放，隙缝填满腐殖质砂壤土，覆盖腐殖土10～15cm至地平，顶部再覆盖厚落叶。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对栽培坑进行以下一种或多种温度管理：
在夏季日最高气温≧30℃时在栽培坑上覆盖秸秆、柴草等遮阴；
在夏季日最高气温≧32℃时适量浇水降温，将10cm深处地温控制在26℃以下；
以及在冬春低温季节对栽培坑采用覆盖方法增温、保温，使10cm深处地温保持在12℃以上。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对栽培坑进行以下水分管理：
播种期：播种后不要即时浇水，7天后方浇透水；
生长期：每10-20天浇一次水，使沙土含水率保持在30～45％之间；
在干热风、大旱天气状况下，需每月应至少灌透水一次，避免过度干燥导致蜜环菌菌索生长缓慢、活力降低或死亡；
防涝措施：夏、秋季汛期雨水频繁且雨量大时，将栽培坑屯高并开挖排水沟，以免栽培坑积水；
防旱措施：冬、春季气候干旱时，将栽培坑下游方向围高，以适量保存水分。
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