CN111840252B - 一种具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料及其制备方法和用途 - Google Patents

一种具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料及其制备方法和用途，属于生物医用材料领域。该纳米材料是由如下配比的原料制备而成：POD‑M 1～10重量份，十六烷基三甲基溴化铵1～10重量份，碱0.001～0.1重量份，原硅酸四乙酯10～100体积份，环己烷100～1000体积份；所述POD‑M由如下重量配比的原料制备而成：一水合乙酸铜1～10份，磷钼酸1～10份，谷氨酸1～10份，均苯三甲酸1～10份。本发明基于原位“捕获‑杀灭”(LCK)灭菌模型的V‑POD‑M纳米体系具有强大的广谱病原体捕获和杀灭能力，这不仅为其他催化体系提供了提高催化活性的新策略，而且在高效抗病原体感染，抗菌植入材料，复合支架材料等生物医学领域的应用中显示出替代抗生素巨大的可能性。

Description

一种具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料及其制备方法和 用途
技术领域
本发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料及其制备方法和用途。
背景技术
在全球流行病爆发的紧急情况下，严重的传染病(例如急性呼吸道综合症、化脓性皮肤病和粘膜炎)每年都困扰着数百万人。目前，由于缺乏特效药物及治疗方案，开发针对细菌和病原微生物引起的感染的新治疗策略具有重要意义。大自然创造了一种有效的杀菌模型，即噬菌体的抗菌过程。噬菌体是一种具有独特刺尾脚的病毒，它可以实现靶向的细菌捕获。随后，噬菌体的核酸，作为一种杀菌物质，可以被释放并进入细菌以诱导其消融。研究者将这种分布过程定义为原位“捕获-杀灭”(LCK)灭菌LCK模型。基于噬菌体LCK模型的模拟可以为开发临床抗感染领域的有效治疗策略提供巨大潜力。
要构建具有LCK模型的纳米系统，首先，必须设计具有许多介孔的多刺结构。刺状表面具有较高的粗糙度，可以增强生物主体与材料之间的相互作用。同时，介孔的微观结构可以负载大量的杀菌物质并确保其有效释放。其次，需要开发一种有效的抗菌途径作为纳米系统的核心。迄今为止，已经广泛报道了几种基于抗生素，金属离子，肽链和活性氧(ROS)的可行策略。由于ROS的生命周期短，它只能对周围的物质造成不可逆转的损害，而不会损伤其他部位的物质，表现出良好的生物相容性。而且，ROS的分子量非常小，这有助于其在介孔中的扩散。使ROS可以迅速传播到病原体的表面。因此，基于ROS的纳米系统更适合于构建LCK模型以实现有效的抗感染治疗。
受到免疫系统中过氧化物酶(POD)的启发，POD模拟物(POD-M)，尤其是金属有机骨架(MOF)衍生的POD-M在产生ROS方面显示出巨大的优势。MOF具有均匀分布的分子/原子级催化中心和多孔结构，可促进POD底物的运输和催化；因此，它们已经成为最有前途的POD模拟催化纳米平台之一。此外，高孔隙率还赋予了MOF负载其他活性助催化剂的能力，从而降低了生成ROS所需的能垒，并实现了级联的POD模拟催化过程。然而，该过程很少报道，找到具有级联催化性能的最佳MOF仍然是一个很大的挑战。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料及其制备方法和用途。
本发明提供了一种具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，它是由如下配比的原料制备而成：POD-M 1～10重量份，十六烷基三甲基溴化铵1～10重量份，碱0.001～0.1重量份，原硅酸四乙酯10～100体积份，环己烷100～1000体积份；
所述POD-M由如下重量配比的原料制备而成：一水合乙酸铜1～10份，磷钼酸1～10份，谷氨酸1～10份，均苯三甲酸1～10份。
进一步地，前述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料是由如下配比的原料制备而成：POD-M 4重量份，十六烷基三甲基溴化铵10重量份，碱0.02～0.03重量份，原硅酸四乙酯80～100体积份，环己烷300～400体积份；
优选地，它是由如下配比的原料制备而成：POD-M 4重量份，十六烷基三甲基溴化铵10重量份，碱0.0276重量份，原硅酸四乙酯80体积份，环己烷320体积份。
进一步地，所述POD-M由如下重量配比的原料制备而成：一水合乙酸铜5～6份，磷钼酸8～10份，谷氨酸2～3份，均苯三甲酸4～5份；
优选地，所述POD-M由如下重量配比的原料制备而成：一水合乙酸铜5.59份，磷钼酸9份，谷氨酸2.81份，均苯三甲酸4.22份。
进一步地，所述碱为氢氧化钠；
和/或，所述谷氨酸为L-谷氨酸。
进一步地，所述POD-M的制备方法包括如下步骤：
(1)将一水合乙酸铜、磷钼酸和谷氨酸溶解于去离子水中，得金属溶液；
(2)将均苯三甲酸溶于去离子水中得均苯三甲酸溶液，将均苯三甲酸溶液加入金属溶液中，反应，得POD-M；
优选地，
步骤(1)中，所述一水合乙酸铜和去离子水的的质量体积比为(0.1～1)g：(100～150)mL；
和/或，步骤(2)中，所述均苯三甲酸溶液和去离子水的质量体积比为(0.1～1)g：(100～150)mL；
更优选地，
步骤(1)中，所述一水合乙酸铜和去离子水的的质量体积比为0.559g：120mL；
和/或，步骤(2)中，所述均苯三甲酸溶液和去离子水的质量体积比为0.422g：120mL。
进一步地，
步骤(1)中，所述溶解为室温下搅拌溶解；
和/或，步骤(2)中，所述反应为室温下搅拌10～15小时；
和/或，步骤(2)中，所述将均苯三甲酸溶液加入金属溶液时连续搅拌；
优选地，步骤(2)中，所述反应为室温下搅拌14小时；
更优选地，
步骤(2)中，所述反应后还包括如下步骤：将反应液离心、洗涤。
本发明还提供了一种前述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料的制备方法，它包括如下步骤：
A.将POD-M、十六烷基三甲基溴化铵和碱加入去离子水中，得POD-M溶液；
B.将原硅酸四乙酯溶解在环己烷，加入到POD-M溶液中，反应，即得；
优选地，
步骤A中，所述POD-M和去离子水的质量体积比为(0.1～1)g：(10～100)mL；
更优选地，步骤A中，所述POD-M和去离子水的质量体积比为0.4g：81.2mL。
进一步地，
步骤A中，所述将POD-M、十六烷基三甲基溴化铵和碱加入去离子水后在50～100℃下搅拌1～5h；
和/或，步骤B中，所述反应为50～100℃下搅拌24～48h；
优选地，
步骤A中，所述将POD-M、十六烷基三甲基溴化铵和碱加入去离子水后在60℃下搅拌2h；
和/或，步骤B中，所述反应为60℃下搅拌48h；
更优选地，
步骤B中，所述反应后还包括如下步骤：将反应液离心，洗涤，干燥。
本发明还提供了一种用于加快活性氧产生的组合物，它由一水合乙酸铜和磷钼酸组成，所述一水合乙酸铜和磷钼酸的质量比为(1～10)：(1～10)；
优选地，所述一水合乙酸铜和磷钼酸的质量比为5.59：9。
本发明还提供了前述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料或前述的组合物在制备抗菌和/或抗炎的材料和/或药物中的用途。
本发明中，如果重量份单位为g，那么体积份单位为mL；如果重量份单位为kg，那么体积份单位为L。即重量份和体积份对应关系为g对应mL；kg对应L，依次类推。
本发明首次揭示了由MOF触发的级联POD拟态催化反应，即由V-POD-M引起的过氧化物酶模拟的协同催化反应。本发明制备了一种具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料(也叫纳米系统，V-POD-M)，该V-POD-M具有类病毒的粗糙外壳，可在体内模拟LCK模型，实现高效的细菌捕获和消融。该基于MOF的纳米体系以[Cu2(BTC)4/3(H2O)2]6[H3PMo12O40]为前体，由一水合乙酸铜(CAM)和磷钼酸(PAH)构成。随后，为了提高细菌捕获能力，通过一种新的单通道定向组装方法在POD-M表面合成了具有许多外延纳米管的类病毒二氧化硅壳(称为V-POD-M)。理论和实验结果的综合分析表明，PAH可以快速与过氧化物结合，并降低CAM催化所需的能垒，从而加快ROS的生成速率。同时，粗糙的类病毒外壳使催化体系具有增强的细胞膜粘附能力，即催化体系具有独特的细菌捕获能力，导致生成的ROS可直接作用于细菌表面，过氧化物酶模拟催化体系可直接在细菌膜上形成高毒性的ROS，随后对其造成不可逆的破坏。
抗菌实验表明，在少量H2O2(0.1mM)存在下，极低浓度(16μg·mL-1)的V-POD-M在体内和体外均具有高效的消毒性能(接近100％)，体内的抗感染治疗效果可与传统抗生素媲美，为广谱病原体灭活和非抗生素治疗的开发提供了新策略。同时，本发明纳米材料对细胞具有良好的安全性，使用时对人体安全。
总之，本发明基于LCK模型的V-POD-M纳米体系具有强大的广谱病原体捕获和消融能力，同时使用时对人体安全，这不仅为其他催化体系提供了提高催化活性的新策略，而且在快速的抗病原体感染，植入物灭菌和其他生物医学领域的应用中显示出替代抗生素巨大的可能性。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为POD-M和V-POD-M的合成和表征数据：a为V-POD-M的合成示意图；b为类病毒状二氧化硅壳形成的示意图；c为POD-M的高分辨率SEM和TEM图像；d为V-POD-M的高分辨率SEM和TEM图像；e为POD-M的HAADF-STEM图像和EDX元素映射图像；f为V-POD-M的HAADF-STEM图像和EDX元素映射图像。
图2为POD-M和V-POD-M的SEM图像和粒径分布图：a为POD-M的SEM图像；b为V-POD-M的SEM图像；c为POD-M的粒径分布图；d为V-POD-M的粒径分布图。
图3为POD-M和V-POD-M的XPS全谱扫描图谱。
图4为POD-M和V-POD-M高分辨率XPS C1s光谱的曲线拟合。
图5为POD-M和V-POD-M的XRD图谱。
图6为POD-M和V-POD-M的FTIR光谱，O-Si-O的特征峰由红色箭头标记。
图7为POD-M和V-POD-M的TGA曲线。
图8为TMB的氧化反应结果：a为TMB的氧化反应示意图；b为数字照片；c为各催化体系和TMB溶液孵育20分钟后的紫外可见吸收光谱。
图9为TA和·OH的反应示意图以及不同催化体系下TA和·OH结合的荧光光谱。
图10为不同催化体系的EPR光谱。
图11为POD-M和V-POD-M的累积CAM释放能力。
图12为POD-M和V-POD-M的累积PAH释放能力。
图13为将TMB溶液与H2O2，POD-M，V-POD-M，H2O2+POD-M和H2O2+V-POD-M体系共培养20分钟的数字照片。
图14为用H2O2+V-POD-M体系共培养的TMB溶液的紫外可见吸收光谱随时间变化。
图15为用H2O2，POD-M，V-POD-M，H2O2+POD-M和H2O2+V-POD-M体系共培养20分钟后的TMB溶液的紫外可见吸收光谱。
图16为用H2O2，POD-M，V-POD-M，H2O2+POD-M和H2O2+V-POD-M体系共培养的不同TA混合物的荧光光谱。
图17为EPR用于检测由H2O2，H2O2+POD-M和H2O2+V-POD-M体系生成的·OH，H2O2，H2O2+POD-M和H2O2+V-POD-M的浓度分别为0.1mM，16μg·mL-1和16μg·mL-1。
图18为DTNB在经不同时间的GSH，GSH+H2O2，GSH+POD-M，GSH+V-POD-M，GSH+H2O2+POD-M和GSH+H2O2+V-POD-M溶液处理后的数码照片。
图19为H2O2，POD-M，V-POD-M，H2O2+POD-M和H2O2+V-POD-M处理后GSH的损失比率。
图20为细菌及与POD-M和V-POD-M组孵育后细菌的SEM图像。
图21为V-POD-M+H2O2孵育前后细菌切片的TEM图像
图22为与H2O2，POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2组孵育的细菌的SEM图像。
图23为POD-M和V-POD-M体系体外抗菌性能的表征：a为琼脂平板计数的数码照片；b和c为细菌分别与H2O2，POD-M，V-POD-M，POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2孵育后的OD600值；d为细菌经H2O2，POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2处理后细菌的活/死荧光图像；e和f为POD-M，V-POD-M，POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2的MIC值。
图24为用H2O2，POD-M，V-POD-M，POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2体系共培养的细菌的活死情况。
图25为用POD-M和V-POD-M处理后的细菌的活/死荧光图像。
图26为用H2O2，POD-M，V-POD-M，POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2体系处理后的金黄色葡萄球菌的活/死数。
图27为用H2O2，POD-M，V-POD-M，POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2体系处理后的大肠杆菌的活/死数。
图28为HUVEC在用H2O2，POD-M，V-POD-M，POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2体系共培养0、1、2天后的HUVEC的活/死细胞染色图像。
图29为共培养0、1和2天后，HUVEC以及经过H2O2，POD-M，V-POD-M，POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2体系处理的HUVEC的CCK-8数值。
图30为V-POD-M体系和万古霉素在体内伤口消毒能力的性能：a为伤口消毒和愈合过程的示意图；b为经不同体系治疗的伤口大小随时间的变化图；c为伤口模型构建，感染，消毒和愈合的数码照片；d为治疗后15天，不同组的表皮组织学切片的H&E染色图像。
图31为琼脂平板计数后的活金黄色葡萄球菌数；在第1天，经过不同的治疗后，伤口上的细菌数目统计。
图32为2个月后经不同处理方式治疗的家兔内脏组织切片的H&E染色图像；以没有金黄色葡萄球菌感染的健康兔子用作标准组；以受金黄色葡萄球菌感染伤口的兔子用作对照组。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
实验材料：磷钼酸(PAH，12MoO3·H3PO4，AR)，一水合乙酸铜(CAM，C4H6CuO4·H2O，金属含量为99.95％)，L(+)-谷氨酸(L-GA，≥99.5％，NT)，均苯三甲酸(BTC，C6H3(COOH)3，98％)，原硅酸四乙酯(TEOS，金属含量为99.999％)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，99％)，3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB，≥99.0％)，对苯二甲酸(TA，99％)，5,5-二甲基-1-吡咯啉N-氧化物(DMPO，97％)，谷胱甘肽(GSH，98％)和5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，98％)均购自阿拉丁。如果没有特别提及，其余的实验试剂均由中国的阿拉丁提供。
实施例1、本发明具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料的制备
具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料(V-POD-M)的合成：V-POD-M的合成过程分为两个主要步骤。具体如下：
首先，将0.559g一水合乙酸铜(CAM)、0.900g磷钼酸(PAH)和0.281g L-谷氨酸添加到120mL去离子水中，并在室温下将其搅拌直至溶解，得金属溶液。然后，将0.422g BTC(均苯三甲酸)溶解在另外的120mL去离子水中，并且在连续搅拌下，将获得的BTC溶液倒入至金属溶液中。在室温下搅拌14小时后，通过离心和洗涤，获得过氧化物酶模拟物(POD-M)。
随后，将0.400g的POD-M、1.000g的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和1.2mL的NaOH(0.1M)添加到80mL的去离子水中，并在60℃下轻轻搅拌2h，得POD-M溶液。将8mL的原硅酸四乙酯(TEOS)溶解在32mL的环己烷中，并将获得的溶液加入到POD-M溶液中，在60℃下搅拌48小时。离心收集产物，并用水、乙醇和丙酮分别洗涤三遍，以除去未反应的单体。最后，在60℃干燥过夜后，获得具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料(V-POD-M)。
以下通过具体的试验例证明本发明的有益效果。
试验例1、本发明具刺状结构产活性氧仿酶纳米制剂的表征
一、表征方法
对实施例1制备的POD-M和V-POD-M进行表征。利用Nicolet-560分光光度计(美国尼科尔)在500-4000cm-1范围内对POD-M和V-POD-M进行傅里叶变换红外(FTIR)光谱分析，分辨率为2cm-1。通过使用X射线光电子能谱仪(XPS，XSAM800，Kratos Analytical，UK)获得XPS光谱，以检测POD-M和V-POD-M的组成并确认类病毒状二氧化硅壳是否成功合成。通过使用JSM-7500F SEM显微镜(日本JEOL)获得扫描电子显微镜(SEM)图像。透射电子显微镜(TEM)图像和EDS通过Tecnai G2 F20S-TWIN TEM显微镜(FEI Ltd.，美国)在200kV下操作获得。使用Perkin-Elmer TGA-7系统在N2流中以10℃min-1至800℃的扫描速率进行热重分析(TGA)。XRD图通过Bruker D8 Focus X射线衍射仪呈现晶体相态。通过电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES，OPTIMA 2X00/5000，PerkinElmer Inc.，美国)监测释放的CAM(一水合乙酸铜)和PAH(磷钼酸)浓度。
二、结果分析
POD-M首先是在室温下通过简便的共沉淀方法合成的(图1a)。然后，在POD-M表面进行了高级的定向自组装过程，以获得类病毒状的粗糙二氧化硅壳，该过程主要包括三个步骤：首先，形成平坦的二氧化硅薄层以覆盖POD-M八面体(通过CTAB在POD-M表面组装，再通过TEOS的水解反应而得)；其次，由于低浓度表面活性剂(CTAB)的诱导，在平坦层上可形成部分纳米孔；最后，与SiO2低聚物(TOES水解反应而得，TEOS分子可与表面活性剂CTAB通过疏水作用结合)结合的表面活性剂在纳米孔上连续组装，形成外延的针状纳米管(图1b)。
高分辨率的扫描电子显微镜(HRSEM)和透射电子显微镜(TEM)图像显示了POD-M的完整八面体形态和V-POD-M的类病毒状的表面结构，验证了合成的可行性(图1c和图1d)。所制备的POD-M和V-POD-M良好单分散性的尺寸，平均粒径分别约为2.6和2.9μm(图2)。
为了进一步研究元素的详细组成，从高角度环形暗场扫描TEM(HAADF-STEM)及其能量色散X射线(EDX)获得的映射数据表明，C，O，Cu和Mo都是均匀分布在POD-M上，更重要的是，在V-POD-M的病毒样外壳上仅检测到Si和O元素的信号(图1e和f)。
此外，通过X射线光电子能谱(XPS)，X射线衍射(XRD)，傅里叶变换红外光谱(FTIR)和热重分析(TGA)表征了POD-M和V-POD-M的化学结构。在对POD-M的XPS全元素扫描中显示了C1s，O 1s，Cu 2p和Mo 3d信号，并且在高分辨率XPS C 1s图谱中，在285.8eV处有清晰的曲线拟合峰，对应BTC中的-COOH基团，证明了POD-M的形成；与POD-M相比，V-POD-M的XPS光谱中Cu，Mo和-COOH信号的消失以及Si 2s和Si 2p峰的出现表明了外壳的形成(图3和图4)。V-POD-M具有与POD-M相似的XRD图谱，表明在类病毒状二氧化硅壳的合成过程中，MOF的原始晶形得以保持(图5)。在1103cm-1处的特征FTIR峰对应于Si-O-Si键的拉伸振动，这也证实了二氧化硅壳的存在(图6)。此外，根据TGA曲线估算这种壳的重量比约为7.71wt.％(图7)。以上形态学和化学结构的结果均验证了POD-M和V-POD-M的成功合成。
试验例2、协同POD的模拟催化性能研究
一、试验方法
过氧化物酶(POD)模拟催化分析：将0.032g催化体系(PAH、CAM，CAM+PAH，POD-M和V-POD-M)首先分散在1mL磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)中，然后用PBS将溶液稀释1000倍，得到催化体系溶液(32μg·mL-1)。
催化体系分组如下：
PAH组：PAH原料；
CAM组：CAM原料；
CAM+PAM组：将CAM原料和PAH原料物理混合的，混合比例为(0.1～1):(0.1～1)；
POD-M组：实施例1制备得到的POD-M；
V-POD-M组：实施例1制备得到的V-POD-M。
对于3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)氧化测定：将1.5mL催化体系溶液，30μL100mM TMB溶液(溶剂为去离子水)，34μL 0.03％H2O2和1.436mL PBS(pH＝7.4)添加到玻璃瓶中并培养20分钟。通过拍摄数码照片并测试不同时间在652nm处的吸光度(UV-Vis光谱，UV-3600，Shimadzu)以完成整个显色过程。整个过程中催化体系的浓度为0.016μg/mL。
对于·OH检测：使用对苯二甲酸(TA)，并使用荧光光谱法(F98，上海)监测435nm(激发波长：315nm)的荧光强度。具体检测方法如下：将1.5mL的催化体系溶液，30μL的200mMTA溶液(溶剂为pH＝10的碱液，NaOH、KOH碱性溶液任意一种都行)，34μL 0.03％H2O2和1.436mL碱液(pH＝10)混合均匀添加到比色皿中，通过荧光光谱法(F98，上海)检测435nm(激发波长：315nm)的荧光强度。
为了比较·OH和·O2-的生成量，将0.28g DMPO溶解在5mL PBS(pH＝7.4)(或DMSO)中以获得DMPO溶液。将100μL催化体系溶液，40μL DMPO溶液和2.3μL 0.03％的H2O2加入57.7μL PBS(或DMSO)中，然后通过Bruker EPR EMX Plus(Bruker Beijing Science andTechnology Ltd.)进行检测。
对于Ellman的测定，所有准备步骤均在黑暗环境中进行：将V-POD-M溶液(16μg/mL)，H2O2(0.1mM)和GSH(0.4mM)与PBS(pH＝7.4)根据试验条件混合在玻璃瓶中，培养5、30和60分钟后，使用5，5′-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB，100mM)使混合物显色。通过UV-Vis光谱法记录在410nm处的吸光度并拍摄数字照片记录颜色变化。
相同浓度和用量的单独的TMB溶液以及TMB和H2O2混合溶液作为对照。
二、试验结果
由于所制备的POD-M和V-POD-M均是基于铜的MOF，它们可能具有过氧化物酶模拟的催化性能；因此，首先研究了该材料的组分(CAM和PAH)在16μg·mL-1的浓度下的催化能力。利用无色的3,3,5,5-四甲基联苯胺(TMB)作为分子探针，可在H2O2存在的情况下将其转化为蓝色的氧化TMB(oxTMB)(图8a)。
孵育20分钟后，在没有CAM的组(PAH组)中几乎没有观察到颜色的变化，表明PAH没有过氧化物催化活性；而TMB+H2O2+CAM混合物(CAM组)的颜色逐渐变成浅蓝色，表明了CAM有催化活性，但催化活性较低。相比之下，将TMB添加到H2O2+CAM+PAH混合物(CAM+PAM组)中时，可以清楚地看到，透明溶液在2分钟内迅速变为蓝色溶液(图8b)；20分钟后，只有TMB+H2O2+CAM+PAH混合物在652nm处具有强吸收峰，这归因于oxTMB的生成(图8c)，证明了CAM-PAH系统具有超高的过氧化物催化活性。
为了监测CAM，PAH和CAM+PAH系统的·OH生成能力，利用苯二甲酸(TA)可以轻松地与·OH结合形成具有独特荧光的2-羟基TA分子(TAOH)，结果如图9所示。图9显示：CAM和PAH催化体系在435nm处的光致发光(PL)强度都很弱，而只有CAM+PAH催化体系显示出很强的PL信号，证实了PAH本身不能催化H2O2产生·OH，但可以增强CAM的催化活性并加速·OH的生成。
图10为EPR光谱，用于检测DMSO中不同体系产生的·O2-。H2O2，PAH和CAM的浓度分别为0.1mM，16μg·mL-1和16μg·mL-1。图10直接说明了PAH可以加速CAM的催化，加速羟基自由基(活性氧)的形成。
根据CAM和PAH的释放结果可知(CAM和PAH释放浓度检测方法同试验例1)：POD-M和V-POD-M在非常低的浓度下(16μg·mL-1)也展现出较高的催化活性(图11～17)。图11和图12说明了POD-M会爆释CAM和PAH组分，而V-POD-M则具有缓释CAM和PAH组分的能力。图13为TMB测试中的照片实物图，通过观察颜色的变化可以发现，POD-M和V-POD-M溶液在过氧化氢存在的情况下可迅速由无色变成蓝色说明TMB已经被氧化，证明了活性氧的生成。图14为V-POD-M+H2O2组溶液不同时间的紫外全谱图，反应了溶液颜色变化的过程。图15为20min后不同组TMB溶液在特征峰处的吸光度，反应了氧化TMB的形成，也说明了活性氧自由基的产生。图16为TA测试的荧光全谱，在435nm处可以检测到POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2组有明显的出峰，说明了这两个组中有羟基自由基(活性氧)的产生。图17中可以发现明显的用黑色圆圈标注的四个峰，进一步证明了羟基自由基的生成。
此外，谷胱甘肽(GSH)在防止微生物被氧化应激损害中起着至关重要的作用。因此，可被用于评估POD-M+H2O2和V-POD-M+H2O2系统在复杂细菌环境中的氧化能力。结合5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DNTB)指示剂的显色效果，GSH溶液的颜色可以从无色变为黄色，而氧化的GSH溶液的颜色则保持不变。根据结果，POD-M和V-POD-M产生的高毒性ROS可以在几秒钟内迅速氧化GSH并破坏微生物抗氧化剂系统，为有效灭菌奠定了基础(图18和19)。
试验例3、V-POD-M的体外抗菌实验
一、试验方法
使用金黄色葡萄球菌(ATCC 25922，革兰氏阳性)和大肠杆菌(ATCC 6538，革兰氏阴性)作为代表性致病菌，研究加速过氧化物酶模拟催化体系的细菌捕获和根除能力。通过OD600，琼脂平板计数和最小抑菌浓度值(MIC)研究材料的抑菌性能。分别将1mL含有H2O2(0.2mM)的POD-M和V-POD-M体系(32μg·mL-1)，或者分别将1mL不含H2O2的POD-M或V-POD-M体系(32μg·mL-1)与1mL细菌悬浮液(106CFU·mL-1)在37℃下培养12h。每3小时通过UV-可见光谱仪(UV-3600，Shimadzu)监测处理过的悬浮液的OD600值，以研究细菌的生长。同时，将培养的悬浮液稀释105倍并用于琼脂平板计数。通过比较不同体系的CFU与对照的CFU来评估其抗菌性能。然后，记录经体系处理后的不同浓度(4、8、16、32、64、128、256和512μg·mL-1)的细菌悬浮液的OD600值，以计算MIC值。
含有H2O2的POD-M体系：POD-M和H2O2物理混合，溶剂为去离子水；体系中POD-M浓度为32μg·mL-1，H2O2浓度为0.2mM；与细菌悬浮液混合后POD-M浓度为16μg·mL-1，H2O2浓度为0.1mM。
不含有H2O2的POD-M体系：POD-M，溶剂为去离子水；体系中POD-M浓度为32μg·mL-1；与细菌悬浮液混合后POD-M浓度为16μg·mL-1。
含有H2O2的V-POD-M体系：V-POD-M和H2O2物理混合，溶剂为去离子水；体系中V-POD-M浓度为32μg·mL-1，H2O2浓度为0.2mM；与细菌悬浮液混合后V-POD-M浓度为16μg·mL-1，H2O2浓度为0.1mM。
不含有H2O2的V-POD-M体系：V-POD-M，溶剂为去离子水；体系中V-POD-M浓度为32μg·mL-1；与细菌悬浮液混合后V-POD-M浓度为16μg·mL-1。
这些体系的杀菌性能和细菌捕获能力通过SEM，TEM和荧光显微镜(DMIRE2，Leica)进行直观地表征。经不同体系处理后，将细菌悬浮液用2.5wt.％的戊二醛固定，并用乙醇/水溶液梯度脱水。然后，通过SEM和TEM图像以观察细菌的捕获能力及形态。此外，还通过LIVE/DEAD BacLight Viability试剂盒(用于活细胞的SYTO-9和用于死细胞的碘化丙啶)对细菌进行了染色，以便通过荧光显微镜观察。
二、试验结果
V-POD-M的细菌捕获能力：利用SEM证实了具有不同形态的POD-M和V-POD-M体系独特的细菌捕获能力。在与细菌(革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性大肠杆菌)孵育后，表面平坦的POD-M的结构稳定性差，材料形态会崩溃。同时，未观察到细菌捕获现象。相反，V-POD-M则可以保持其独特的形貌，其粗糙的表面可以捕获大量细菌(图20)。这些结果证明，类病毒状表面不仅可以赋予V-POD-M稳定的尺寸和结构，还可以提供强大的广谱细菌捕获能力。
V-POD-M的LCK模型：LCK凭借独特的捕获能力，V-POD-M可以大大缩短与细菌的距离并粘附在其表面。然后，在少量H2O2的存在下，通过V-POD-M的协同催化作用将迅速产生高毒性的ROS。ROS可以直接破坏细菌膜并影响其渗透性，从而促进ROS的入侵并造成DNA损伤。为了更直观地验证此LCK模型造成的不可逆损害，采用细菌切片和高分辨率TEM进行了表征。在图像中(图21)，细菌本身显示出饱满的形态和未损坏的细胞膜结构(用绿色箭头标记)；但是，它们的细胞膜在与V-POD-M+H2O2孵育后变成碎片(红色箭头标记)，表明V-POD-M+H2O2具有强大的细菌捕获和消融能力。SEM图像(图22)显示，与H2O2(0.1mM)一起孵育的细菌保持了完整的结构，这说明在如此低的浓度下H2O2不会产生细菌毒性。而与V-POD-M+H2O2一起孵育后，细菌的形态具有明显的变形和塌陷，表明这些破坏都归因于V-POD-M的协同催化作用；此外，对于POD-M+H2O2组，大多数细菌没有被破坏，这表明细菌细胞膜与生成的ROS有一定距离，ROS无法直接作用于细菌，所以会极大地限制其抗菌性能。因此，形态学结果表明，即使在非常低的浓度下，有效的细菌捕获和过氧化物酶催化能力也可以赋予V-POD-M令人满意的杀菌性能。
V-POD-M的抗菌性能：为了系统地计算杀菌率，通过琼脂平板计数和600nm处的光密度值(OD600)研究了与六个不同体系一起孵育的细菌的活性。与对照组(只有细菌培养的组，没有加任何材料，孵育后金黄色葡萄球菌为819个菌落形成单位，CFU，大肠杆菌为971CFU)相比，H2O2组孵育后观察到相似的细菌菌落数(金黄色葡萄球菌为795CFU，大肠杆菌为893CFU)。通过H2O2(0.1mM)组证明了H2O2本身几乎没有抑菌活性。而细菌+V-POD-M混合物的菌落数(金黄色葡萄球菌为496CFU，大肠杆菌为602CFU)的下降速度比细菌+POD-M(金黄色葡萄球菌为673CFU，大肠杆菌为757CFU)更快，证明了类病毒状壳可以将POD-M对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌性能从16％和23％分别提高到39％和40％。更重要的是，V-POD-M在少量H2O2(0.1mM)的存在下显示出近100％的细菌杀灭率，证实了这种具有细菌捕获能力的过氧化物酶模拟的协同催化系统可以在超低浓度下(16μg·mL-1)实现对细菌的彻底消融(图23a，图24)。OD600值显示了用不同体系处理过的细菌的繁殖过程，其结果与琼脂平板计数实验的结果一致(图23b和c)。
荧光显微镜图像也为V-POD-M体系的高效杀菌能力提供了更直观的证据。由于ROS仅能作用于其周围环境，因此没有细菌捕获的POD-M+H2O2无法彻底杀死细菌，从而为细菌的再生提供了一定的可能性。相反，由于ROS在细菌表面的直接作用，在V-POD-M+H2O2组中未观察到活细菌(图23d，图25～27)。此外，最小抑菌浓度(MIC)方法也被用来评估POD-M和V-POD-M体系在不同浓度下的抑菌效率。对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，V-POD-M+H2O2的MIC(约16μg·mL-1)远低于其他组(图23e和f)，即使在如此低的浓度下，在存在少量H2O2的情况下，V-POD-M催化体系仍具有强大的细菌消融能力，这为体内临床治疗中的非抗生素提供了巨大的可能。
试验例4、细胞相容性实验
一、试验方法
人脐静脉内皮细胞(HUVEC)在补充有10％胎牛血清(FBS)(Hyclone，美国)，2mM L-谷氨酰胺和1vol.％抗生素混合物(10,000U青霉素和10mg链霉素)的R1640培养基中生长。将培养物保持在5％CO2的湿润气氛中培养，温度为37℃(Queue Incubator，巴黎，法国)。用无菌PBS和0.05％胰蛋白酶/EDTA溶液从培养瓶中分离融合细胞。每天更换培养基。分别在含有和不含H2O2(0.1mM)的情况下，将浓度为16μg·mL-1的加速过氧化物酶模拟催化体系分散在培养基中。
对于活/死荧光图像，在培养1、2和3天后，进行活/死染色。为了用FDA/PI染色，将0.1mL的FDA工作溶液和0.03mL的PI直接添加到培养基中。将细胞在37℃染色5分钟，然后用PBS洗涤。然后立即通过荧光显微镜(DMIRE2，Leica)观察细胞。通过用氩激光激发(激发波长492nm，发射波长520nm)来监测FDA荧光。PI染色的样品用氦氖激光激发(激发波长537nm，发射波长566nm)。从至少6幅荧光图像上估计粘附在孔板底部的HUVEC的平均数目。
对于CCK-8分析，在细胞培养1、2和3天后，检测HUVEC的细胞活性。细胞在该体系下暴露24小时，48小时和72小时后，分别向每个孔中添加100μL CCK-8溶液。温育3小时后，使用Microplate读数器(550型，Bio-Rad)在450nm下对混合物进行测量。
二、试验结果
结果表明，图28和图29中，发现V-POD-M+H2O2组的细胞数目在培养2天后能够完全恢复之前的细胞数目，可以证明V-POD-M+H2O2对细胞引起的损伤是可逆的，可用于长期共培养，该体系对正常组织细胞几乎是安全的。
试验例5、体内伤口消毒实验
一、试验方法
为了进一步验证V-POD-M+H2O2在非抗生素治疗中的潜在可行性，进行了动物伤口消毒和愈合实验。
在动物实验中选择兔子作为模型，通过两个主要步骤建立感染的伤口模型：i)在兔子表皮上切除直径约1cm的孔；ii)在伤口上滴加100μL金黄色葡萄球菌悬浮液(1×108CFU·mL-1)并孵育1天，1天后可观察到伤口感染严重。
之后，加入100μL V-POD-M(0.16μg·mL-1)和2.3μL 0.03％H2O2来治疗感染的伤口。同时，通过加入生理盐水，过氧化氢(0.1mM)和万古霉素(0.16μg·mL-1)用作对比。消毒处理后，分别从不同的伤口处收集5μL液体，用于琼脂平板计数。16天后，将治疗过后的伤口用10％甲醛溶液固定以进行组织学H&E染色分析。
二、试验结果
抗感染治疗后，化脓性伤口逐渐消肿，结痂并脱落，表皮组织迅速再生(图30a)。
此外，在该动物实验中，设计了H2O2(0.1mM)组以显示V-POD-M+H2O2组优异的疗效，同时万古霉素(16μg·mL-1)也被用于与该LCK治疗过程进行对比。通过数码照片记录了不同时期伤口的愈合情况，可以清楚地观察到，感染的伤口都充满脓液，并被发炎的表皮所包围，这表明金黄色葡萄球菌的成功感染；治疗后7天，生理盐水和H2O2处理的伤口感染恶化，相反，用V-POD-M+H2O2和万古霉素治疗的伤口则会迅速结痂并消肿；治疗后15天后，对照组和H2O2组的伤口仍有脓液流出，而V-POD-M+H2O2和万古霉素组的伤口几乎完全愈合(图30c)。之后，还计算出了不同天数伤口的尺寸以监测其愈合状态。经过生理盐水和H2O2处理后，受感染的伤口逐渐扩大到初始大小的两倍以上，随后恢复缓慢。在V-POD-M+H2O2和万古霉素组中，伤口没有扩张趋势，可以在15天内完全修复(图30b)，表明，在少量H2O2(0.1mM)存在的情况下，V-POD-M催化体系即使在非常低的浓度(16μg·mL-1)下也具有出色的伤口消毒性能，其治疗效果几乎与万古霉素相同。
此外，在不同的体系处理之后，监测了这些伤口上的细菌数目，从而直观地表征其体内的杀菌性能。细菌计数结果表明，低浓度的H2O2没有消毒能力，但是V-POD-M+H2O2可以彻底杀死伤口上的活细菌，体现出与万古霉素相当的消毒能力(图31)。为了研究伤口的感染状况，还通过苏木精和曙红(H&E)染色对组织切片进行了病理分析(图30d)：与健康表皮(黑色箭头和矩形标记)相比，对照组和H2O2组中的组织出现了大面积坏死的多形核白细胞(红色矩形标记)和碎片细胞(红色箭头标记)。同时，细胞间质中的胶原原纤维也显示出异常的质地，代表了严重伤口感染的特征。但是，在用V-POD-M+H2O2治疗后15天，典型的炎症区域消失了，并且大量的真皮成纤维细胞(以绿色箭头标记)和新血管(以绿色矩形标记)的形成与再生，表明V-POD-M+H2O2具有快速高效的伤口消毒能力。此外，在新的表皮组织中未观察到明显的异物反应或V-POD-M的积累。更重要的是，万古霉素治疗的伤口表现出与V-POD-M+H2O2治疗后相似的病理特征，从而保证了V-POD-M+H2O2体系在非抗生素治疗中的应用前景。为了研究该体系对主要内脏组织的累积毒性，在治疗2个月后，将兔子的心脏，肝脏，脾脏，肺和肾脏与正常组织进行了比较，并且在它们的组织中未发现明显的损伤和异常。切片结果也证明了V-POD-M+H2O2治疗措施的安全性(图32)。
结论：本发明首次揭示了由V-POD-M引起的过氧化物酶模拟的协同催化反应，该纳米材料具有类病毒状的粗糙外壳，可应用于高效的体内LCK模型。实验结果表明PAH可以降低CAM催化所需的能垒，从而加快ROS的生成速率。此外，结合粗糙的类病毒表面独特的细菌捕获能力，过氧化物酶模拟催化体系可直接在细菌膜上形成高毒性的ROS，随后对其造成不可逆的破坏。系统的抗菌实验表明，在少量H2O2(0.1mM)的存在下，极低浓度(16μg·mL-1)的V-POD-M在体外和体外均具有高效的细菌消毒性能(接近100％)。体内的抗感染治疗效果可与传统抗生素媲美。
综上，基于LCK模型的V-POD-M纳米体系具有强大的广谱病原体捕获和消融能力，这不仅为其他催化体系提供了提高催化活性的新策略，而且在快速的抗病原体感染，植入物灭菌和其他生物医学领域的应用中显示出替代抗生素巨大的可能性。

Claims (19)

1.一种具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：它是由如下配比的原料制备而成：POD-M 1～10重量份，十六烷基三甲基溴化铵1～10重量份，碱0.001～0.1重量份，原硅酸四乙酯10～100体积份，环己烷100～1000体积份；
所述POD-M由如下重量配比的原料制备而成：一水合乙酸铜1～10份，磷钼酸1～10份，谷氨酸1～10份，均苯三甲酸1～10份。
2.根据权利要求1所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：它是由如下配比的原料制备而成：POD-M 4重量份，十六烷基三甲基溴化铵10重量份，碱0.02～0.03重量份，原硅酸四乙酯80～100体积份，环己烷300～400体积份。
3.根据权利要求2所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：它是由如下配比的原料制备而成：POD-M 4重量份，十六烷基三甲基溴化铵10重量份，碱0.0276重量份，原硅酸四乙酯80体积份，环己烷320体积份。
4.根据权利要求1所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：所述POD-M由如下重量配比的原料制备而成：一水合乙酸铜5～6份，磷钼酸8～10份，谷氨酸2～3份，均苯三甲酸4～5份。
5.根据权利要求4所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：所述POD-M由如下重量配比的原料制备而成：一水合乙酸铜5.59份，磷钼酸9份，谷氨酸2.81份，均苯三甲酸4.22份。
6.根据权利要求1～5任一项所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：所述碱为氢氧化钠；
和/或，所述谷氨酸为L-谷氨酸。
7.根据权利要求1～5任一项所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：所述POD-M的制备方法包括如下步骤：
(1)将一水合乙酸铜、磷钼酸和谷氨酸溶解于去离子水中，得金属溶液；
(2)将均苯三甲酸溶于去离子水中得均苯三甲酸溶液，将均苯三甲酸溶液加入金属溶液中，反应，得POD-M。
8.根据权利要求7所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：
步骤(1)中，所述一水合乙酸铜和去离子水的的质量体积比为(0.1～1)g：(100～150)mL；
和/或，步骤(2)中，所述均苯三甲酸和去离子水的质量体积比为(0.1～1)g：(100～150)mL。
9.根据权利要求8所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：
步骤(1)中，所述一水合乙酸铜和去离子水的的质量体积比为0.559g：120mL；
和/或，步骤(2)中，所述均苯三甲酸和去离子水的质量体积比为0.422g：120mL。
10.根据权利要求7所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：
步骤(1)中，所述溶解为室温下搅拌溶解；
和/或，步骤(2)中，所述反应为室温下搅拌10～15小时；
和/或，步骤(2)中，所述将均苯三甲酸溶液加入金属溶液时连续搅拌。
11.根据权利要求10所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：
步骤(2)中，所述反应为室温下搅拌14小时。
12.根据权利要求11所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料，其特征在于：
步骤(2)中，所述反应后还包括如下步骤：将反应液离心、洗涤。
13.一种权利要求1～12任一项所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料的制备方法，其特征在于：它包括如下步骤：
A.将POD-M、十六烷基三甲基溴化铵和碱加入去离子水中，得POD-M溶液；
B.将原硅酸四乙酯溶解在环己烷，加入到POD-M溶液中，反应，即得。
14.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：
步骤A中，所述POD-M和去离子水的质量体积比为(0.1～1)g：(10～100)mL。
15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于：
步骤A中，所述POD-M和去离子水的质量体积比为0.4g：81.2mL。
16.根据权利要求13所述的制备方法，其特征在于：
步骤A中，所述将POD-M、十六烷基三甲基溴化铵和碱加入去离子水后在50～100℃下搅拌1～5h；
和/或，步骤B中，所述反应为50～100℃下搅拌24～48h。
17.根据权利要求16所述的制备方法，其特征在于：步骤A中，所述将POD-M、十六烷基三甲基溴化铵和碱加入去离子水后在60℃下搅拌2h；
和/或，步骤B中，所述反应为60℃下搅拌48h。
18.根据权利要求17所述的制备方法，其特征在于：步骤B中，所述反应后还包括如下步骤：将反应液离心，洗涤，干燥。
19.权利要求1～12任一项所述的具有刺状结构产活性氧仿酶纳米材料在制备抗菌和/或抗炎的材料和/或药物中的用途。
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