CN115137748B - 介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料及其制备方法和应用 - Google Patents

介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种介孔二氧化硅‑氧化铈‑miR129复合材料及其制备方法和应用，属于放射性皮肤损伤修复技术领域。所述介孔二氧化硅‑氧化铈‑miR129复合材料的制备方法，包括以下步骤：(1)向介孔二氧化硅分散液中加入氧化铈分散液，搅拌12‑20h，得到MS‑CeO2；(2)将DSPE‑PEG‑NHS溶于无菌PBS缓冲液中，加入miR129‑NH2，混合反应12‑20h，透析纯化得到DSPE‑PEG‑miR129；(3)将DSPE‑PEG‑miR129加入到MS‑CeO2中，搅拌12‑20h，制备得到MS‑CeO2‑miR129复合材料。本发明的介孔二氧化硅‑氧化铈‑miR129复合材料具有良好的抑制辐射诱导的ROS和HIF‑1α活化的活性，并能起到放射抵抗作用，实现促进放射性皮肤损伤的高质量愈合。

Description

介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及放射性皮肤损伤修复技术领域，具体涉及一种介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料及其制备方法和应用。
背景技术
放射治疗是临床上广泛应用于肿瘤治疗的有效方法。北美50％的癌症患者和超过70％的恶性肿瘤患者接受放射治疗，表明放射肿瘤学在癌症治疗中的重要作用和地位。然而，皮肤辐射反应是限制放射治疗剂量和治疗效果的常见不良反应。在接受放射治疗的癌症患者中，高达95％出现皮肤反应，近10％经历严重的皮肤损伤。放射治疗失败的一个主要原因是辐射对周围正常组织的损伤。放射性皮肤损伤(RISI)在放射性事故和放射性治疗中是最多的损伤，RISI的主要原因包括创面微环境缺氧、活性氧(ROS)激活和DNA修复蛋白下调等。放射性损伤的皮肤组织愈合困难，反复发作，给患者带来了极大的痛苦。
临床上，针对不同程度的放射性皮肤损伤病人采取不同的治疗方法。伤及深部皮肤组织或形成经久不愈溃疡者，通常采用手术治疗；全身性放射性损伤及局部轻度损伤者，药物治疗为首选。但是目前大部分针对放射性皮损的药物都存在疗效欠佳及副作用明显等不足。例如：己酮可可碱(PTX)是一种抗纤维化药物；适当浓度单独治疗6个月后临床未见明显的组织学变化。而高浓度的PTX可抑制成纤维细胞胶原蛋白合成或增加胶原酶活性，因此所必需的高浓度PTX可能是有一定毒性，并且单独施用PTX不能用于治疗纤维化；己酮可可碱与生育酚联合使用的体外研究显示，通过减少即刻和晚期量活性氧自由基的产生，而在成纤维细胞或内皮细胞中具有抗氧化作用；然而其对放射性损伤的治疗和预防效果是极其有限的。因此，为了降低正常组织的放射敏感性，需要开发新的材料。放射性皮肤损伤的确切机制尚不清楚，缺乏标准化、统一的防治方法。
miRNA是一类由18-25个碱基构成的广泛存在的非编码RNA。miRNAs在表观遗传调控中的作用已有进展，其中miRNAs调节目标mRNAs的蛋白质浓度。据估计，miRNA可以调节多达30％～60％的基因表达。在人类基因组中，一个miRNA可能与多个mRNA发生作用。miRNA调节细胞发育以及增殖，分化和凋亡，因此其表达的异常会导致多种疾病，包括癌症。miRNA表达的特定模式几乎与所有类型的肿瘤相关，并且许多miRNA参与肿瘤发生和发展。根据其mRNA靶标，miRNA可以充当肿瘤的抑制或促进因子。许多研究集中于异常表达的miRNA及其对肿瘤发生的影响。当所影响的mRNA是癌基因或抑癌基因，那么也就影响了肿瘤的发生。此前有研究发现，miR129-5p在胃癌中下调，并通过负向调控HMGB1抑制细胞增殖。结果表明，富含miR129的HS-MSC-Exo可显著降低炎症反应和软骨细胞凋亡，而缺乏miR129的HS-MSC-Exo可增加IL-1β介导的炎症反应和软骨细胞凋亡。富含miR129的HS-MC-Exo可显著降低炎症反应和软骨细胞凋亡，而缺乏miR129的HS-MC-Exo可增加IL-1β介导的炎症反应和软骨细胞凋亡。在机制上，miR129作用于HMGB1的3'UTR端，抑制IL-1β介导的HMGB1的上调。miR129表达的增加通过抑制HMGB1和TLR3相关细胞因子来减轻炎症诱导的神经元和血脊髓屏障损伤，从而对血液再灌注产生保护作用。
然而，miR129在RISI进展中与创面愈合的关系尚未阐明。而且在临床上，miR129具有全身吸收差、生物利用度低的问题。
RISI是最常见的辐射诱发疾病，因为皮肤覆盖全身，是人体所有器官中最大的器官。用于肿瘤放射治疗的外照射束首先通过皮肤，然后到达肿瘤区域。因此，合理设计和开发治疗RISI的药物具有重要的现实意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料(MS-CeO2-miR129)及其制备方法和应用。本发明的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料具有良好的抑制辐射诱导的ROS和HIF-1α活化的活性，并能起到放射抵抗作用，实现促进放射性皮肤损伤的高质量愈合。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料的制备方法，包括以下步骤：
(1)向介孔二氧化硅(MS)分散液中加入氧化铈(CeO2)分散液，搅拌12-20h，得到MS-CeO2；
(2)将DSPE-PEG-NHS溶于无菌PBS缓冲液中，加入miR129-NH2，混合反应12-20h，透析纯化得到DSPE-PEG-miR129；
(3)将DSPE-PEG-miR129加入到MS-CeO2中，搅拌12-20h，制备得到MS-CeO2-miR129复合材料。
优选的，步骤(1)中，介孔二氧化硅分散液中介孔二氧化硅的含量为200mg/ml；氧化铈分散液中氧化铈的含量为200mg/ml。
优选的，步骤(1)中，介孔二氧化硅分散液与氧化铈分散液加入的体积比为1:1。
优选的，步骤(2)中，DSPE-PEG-NHS与miR129-NH2加入的质量比为2:1
优选的，步骤(2)中，miR129的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；具体如下：
Sense strand:CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC；(SEQ ID NO.1)
antisense strand:AAGCCCAGACCGCAAAAAGUU。(SEQ ID NO.2)
优选的，步骤(3)中，DSPE-PEG-miR129与MS-CeO2加入的体积比为1:1。
本发明的第二方面，提供上述制备方法制备的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料。
优选的，所述介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料的尺寸为50-80nm。
本发明的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料是利用介孔二氧化硅牢固的锚定和分散氧化铈，形成MS-CeO2纳米复合材料，该纳米复合材料具有良好的抑制辐射诱导的ROS和HIF-1α活化的活性；然后再利用MS-CeO2纳米复合材料负载miR129，MS和miR129都带负电，带正电的CeO2的存在降低了它们的静电排斥；而负载的miR129可以直接靶向RAD17和调节CHK2通路，从而减轻DNA损伤诱导的细胞凋亡。因此，本发明的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料兼具纳米酶和miRNA治疗的优点，能够促进放射性皮肤损伤的高质量愈合。
本发明的第三方面，提供上述介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料在制备促进放射性皮肤损伤愈合的药物中的应用。
本发明的第四方面，提供一种促进放射性皮肤损伤愈合的药物，所述药物以介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料为活性成分。
优选的，所述药物的剂型为喷雾剂。
本发明的有益效果：
(1)本发明将MS-CeO2纳米酶和miR129整合在一起，形成了具有抗ROS、抗HIF-1α和辐射抵抗活性的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料，从而实现了促进放射性皮肤损伤的高质量愈合。
(2)本发明的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料还具有促进HaCaT和HUVEC细胞增殖、迁移、血管生成和抗凋亡的能力，从而使所制备的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料具有体内外协同抗放射性皮肤损伤的能力。
(3)本发明的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料，其中，MS提供了基本的核壳结构，促进了材料在伤口血管中的循环；通过MS可以牢固的锚定和分散CeO2，避免其团聚，形成的MS-CeO2纳米复合材料在RISI创面中起到了高效的抗菌、抗ROS和抗缺氧作用。重要的是，MS-CeO2纳米复合材料通过减轻体内和体外的缺氧，大大降低了HIF-1的α，从而减少了ROS的损伤。再利用MS-CeO2纳米复合材料负载miR129，能够有效的将miR129输送到伤口毛细血管，解决了miR129全身吸收性差、生物利用度低的问题；而且，MS-CeO2和miR129在抗ROS和抗炎中发挥协同作用，可减轻RISI创面的炎症反应，诱导颗粒状组织形成、血管生成和胶原沉积，从而加快RISI创面愈合速度。此外，本发明的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料还改善了免疫微环境。因此，本发明的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料能够为RISI伤口修复提供一种新的治疗策略。
附图说明
图1：MS-CeO2-miR129的制备及其在RISI愈合中的应用示意图。
图2：MS-CeO2-MiR129的表征。MS-CeO2-miR129(A)的扫描电镜。MS-CeO2-miR129(B)的EDS，包括Si、Ce和O。MS-CeO2-miR129(C)的XPS。测试元素包括氧、氮、硅和碳。
图3：MS-CeO2-MiR129的表征。miR129与MS-CeO2-miR129的相对表达(A)。粒径和电位分析(B)，粒径为229n，PDI为0.119，zeta电位为-38.60mV。MS-CeO2-miR129(C)的FT-IR。MS-CeO2-miR129对H2O2的体外催化性能(D)。MS-CeO2-miR129(E)的紫外光谱。MS-CeO2-miR129(F)的XRD研究。
图4：MS-CeO2-miR129的生物相容性和抗菌活性。HUVEC细胞在MS-CeO2-miR129上培养7d(A)的FITC/DAPI染色图像。G+(MRSA)和G-(大肠杆菌)的抗菌活性(B)。在MS-CeO2-miR129上培养的HaCaT细胞第7(C)天进行CCK-8测定。B(D和E)细菌计数。*P<0.05。
图5：MS-CeO2-miR129体外细胞学研究。流式细胞术和总凋亡率结果(A和C)。血管形成实验(B)。B中淋巴结数量和血管总长度(D和E)。*p<0.05。
图6：MS-CeO2-miR129体外细胞学研究。MS-CeO2-miR129对HaCaT细胞划痕迁移的影响(A)、HIF-1α的Western Blot和半定量分析(B和E)、细胞克隆形成实验(C)、迁移面积百分比(D)；*p<0.05。
图7：MS-CeO2-miR129的体内RISI小鼠研究。医用电子直线加速器和小鼠RISI模型的操作过程(A)。第1天和第14天创面照片和第14天H&E染色(B)。第14天小鼠体重(g)(C)。第14天各组创面面积(D)。第14天各组HIF-1αElisa(E)。第14天毛囊相对数量(F)。*p<0.05。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
如前所述，放射性皮肤损伤的确切机制尚不清楚，缺乏标准化、统一化的防治方法，是目前临床治疗的一个重要挑战。
基于此，为实现放射性皮肤损伤的治疗，本发明设计了一种多重放射抵抗策略，本发明将介孔二氧化硅(MS)、氧化铈和miR129有机结合，制备得到介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料，其具有体内外协同抗辐射的能力，促进了放射性皮肤损伤的高质量愈合(图1)。其中：
介孔二氧化硅(MS)具有比表面积大、孔体积大、载药量高、生物相容性好等优点，是一种很有前途的药物载体。特别是，二氧化硅通过促进细胞补充、新生血管和表皮成熟来增加再上皮化率，从而加速伤口的闭合和收缩。
CeO2纳米粒子在药物传递、催化、生物传感和医学等方面具有广阔的应用前景，在纳米医学领域得到了广泛的关注。这些纳米粒子相对稳定，具有特殊的生物相容性，毒性小，成本低，环境友好。Ce具有四价(Ce4+)和三价(Ce3+)两种主要氧化态，因此氧化铈以Ce2O3和CeO2两种氧化物的形式存在，这取决于材料的性质。CeO2纳米粒子具有立方萤石结构，表面有Ce3+和Ce4+共生。CeO2的主要优点是在晶格中产生氧空位。因此，CeO2纳米粒子的氧化还原性能得到改善，有助于治疗各种氧化应激相关疾病。此外，CeO2能产生几种对体外活性至关重要的活性氧。
本发明将CeO2纳米粒子固定在MS表面和内部，以获得良好的过氧化氢酶活性，并防止其聚集。本发明用介孔二氧化硅牢固地锚定和分散CeO2纳米颗粒，形成MS-CeO2纳米复合材料，该复合材料具有良好的抑制辐射诱导的ROS和HIF-1α活化的活性，最终促进RISI创面愈合。
放射性皮肤损伤患者血清中的miR129通过直接靶向RAD17和调节Chk2通路而起到放射抵抗作用。本发明利用MS-CeO2纳米复合材料负载miR129，得到MS-CeO2-miR129复合材料。MS和miR129都带负电，因此带正电的CeO2粒子的存在降低了它们的静电排斥。MS核壳结构的纳米转移体适合于跨伤口床层给药，由此产生的miR129被包裹到纳米转移体中，有助于miR129有效地穿透和输送到角质层和伤口床。这有效地改善了miR129在临床使用中存在的全身吸收差、生物利用度低的问题。CeO2共包裹到纳米转移体中，进一步促进了CeO2-miR129的伤口渗透和沉积。
综合来看，本发明制备的MS-CeO2-miR129复合材料具有纳米酶和miRNA治疗学的优点，能够促进放射性皮肤损伤的高质量愈合，为RISI提供了一个有希望的治疗途径，由此提出了本发明。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中：
HaCat细胞、HUVEC细胞和VEGF来自西南医院肿瘤科。SiO2和硝酸铈购西安瑞禧生物科技有限公司。抗IFI6和抗HIF-1α购买自北京博奥森生物科技有限公司。抗SSBP1购买自武汉菲恩生物科技有限公司。miR129购买自上海吉玛制药技术有限公司，正义链:CUUUUUGCGGUCUGGGCUUGC(SEQ ID NO.1)，反义链：AAGCCCAGACCGCAA AAGUU(SEQ ID NO.2)；miR129末端被NH2基团修饰，具有绿色荧光。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗购买自中国中山生物工程有限公司。DSPE-PEG-NHS购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。
实验动物为雄性BALB/c小鼠，体重25±2g，在相对湿度50％和环境温度为25℃的塑料笼中按12h昼夜节律单独喂养。动物实验经陆军医科大学动物伦理委员会批准，所有操作均遵循相关伦理规定。
实施例1：MS-CeO2-miR129复合材料的制备及表征
1、MS-CeO2-miR129复合材料的制备
(1)MS的合成：
将1g对甲苯磺酸十六烷基三甲基铵(CTATos)、1g三乙醇胺(TEAH3)和5ml H2O，加入50毫升烧瓶中，混合，然后加热至80℃，搅拌至完全溶解；加入1g正硅酸四乙酯(TEOS)，在80℃下反应2小时；停止，冷却，(12000rpm，10min)离心收集，ddH2O和乙醇交替洗涤3次，将所得纳米粒子2g分散在10ml乙醇中，然后加入11ml乙醇/盐酸＝10/1(体积比)的混合溶液中，在70℃下过夜反应，离心收集(12000rpm，10min)，水和乙醇交替洗涤3次，最后甲苯洗涤2次，水洗3次，再分散在水中，得到MS分散液(分散液中MS的浓度为200mg/ml)。
(2)CeO2的制备：
将1g硝酸铈加入5ml水/乙二醇(体积比1:1)混合溶液中，加热至60℃后加入5ml氨水，快速加入3.12ml TEOS，在80℃下反应2h；反应后用水离心洗涤，再分散于水中，得到CeO2分散液(分散液中CeO2的浓度为200mg/ml)。
(3)DSPE-PEG-miR129的制备：
将200mg DSPE-PEG-NHS溶于1ml无菌PBS(pH＝8)中，加入100mg 20OD的miR129-NH2，室温培养过夜；然后透析DSPE-PEG-miR129，纯化并去除未反应的DSPE-PEG-NHS和miR129-NH2。
DSPE-PEG-NHS作为交联剂将miR129粘到材料上。
(4)MS-CeO2-miR129复合材料的制备：
向1ml步骤(1)制备的介孔二氧化硅(MS)分散液中加入1ml步骤(2)制备的氧化铈(CeO2)分散液，搅拌16h，得到MS-CeO2。
取1ml MS-CeO2，向其中加入1ml步骤(3)制备的DSPE-PEG-miR129，搅拌16h，然后离心洗涤，即制备得到MS-CeO2-miR129复合材料，在4℃避光下保存。
2、MS-CeO2-miR129复合材料的表征和理化性质
(1)MS-CeO2-miR129复合材料的形貌和组成表征：
用电镜观察MS-CeO2-miR129的形貌。用动态光散射法测定纳米粒子的粒径和zeta电位。用Nicolet 6700FTIR光谱仪(4000-600cm-1)记录傅里叶变换红外(FTIR)光谱。紫外可见近红外光谱测量材料的紫外光谱仪/近红外光吸收效应。能量色散谱(EDS)/X射线光电子能谱(XPS)分析材料的元素组成。
图2A为MS-CeO2-miR129复合材料的扫描电镜(SEM)图像，表明制备得到的复合材料的尺寸为50-80nm。
图2B为MS-CeO2-miR129复合材料的EDS图像，表明CeO2和miR129主要集中在壳层内部；通过X射线能量色散分析的元素分布比较，证实了壳层内CeO2-miR129核的晶体结构。这些结果表明，CeO2已成功地固定到MS中。
用X射线光电子能谱(XPS)分析了MS-CeO2-miR129表面的Ce价态(图2C)。结果表明，MS-CeO2-miR129中885.1和903.2eV处的XPS峰为Ce3+，881.7、888.1、898.1、900.9、906.4和916.4eV处的XPS峰为Ce4+。这些结果与MS-CeO2-miR129中混合价Ce共存的现象相反，MS-CeO2-miR129中的Ce3+氧化为Ce4+后起到了清除ROS的作用。
(2)MS-CeO2-miR129复合材料的理化性质
通过TaqMan qPCR分析miR129和MS-CeO2-miR129复合材料在相同光密度下的表达，结果如图3A所示，结果表明，miR129在MS-CeO2上被成功负载，载药率达77％。
图3B为MS-CeO2-miR129纳米酶的粒径和zeta电位分析，结果表明，其粒径为229nm，多分散指数(PDI)为0.119，zeta电位为-38.60mV。
通过傅立叶变换红外光谱(FT-IR)和紫外-可见-近红外光谱(NIR)对载药和封盖过程进行了研究，发现在MS-CeO2-miR129颗粒中有典型的CeO2和MS吸收峰(图3C、3E)。
图3D为MS-CeO2-miR129复合材料对H2O2的体外催化性能测试结果，结果表明MS-CeO2-miR129复合材料能在10分钟内分解85％的H2O2，并对H2O2表现出很强的催化能力。
图3F为MS-CeO2-miR129复合材料的XRD图，结果表明图3F的峰与标准CeO2的立方特征很好地匹配。观察到的XRD峰的展宽与CeO2颗粒尺寸的减小有关。
实施例2：MS-CeO2-miR129复合材料对放射性皮肤损伤的作用研究
1.MS-CeO2-miR129复合材料的生物相容性评价和抗菌活性研究
细胞学实验分为5组，A组为正常细胞组，B组为正常细胞+3Gy辐射组，C组为正常细胞+3Gy辐射+MS组，D组为正常细胞+3Gy辐射+MS-CeO2组，E组为正常细胞+3Gy辐射+MS-CeO2-miR129组。MS、MS-CeO2、MS-CeO2-miR129的加入量均为10mg。
HaCat细胞以2×103细胞/孔的密度接种于添加5％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM中，37℃条件下进行培养。
1.1将人血管内皮细胞(HUVEC)接种于A-E组培养液中24h，观察其对细胞骨架形态的影响。室温下用预温磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞3次，预温4％多聚甲醛固定细胞。用磷酸盐缓冲盐水冲洗固定细胞并浸泡它们。在37℃无光条件下，将细胞与制备好的酚氧化酶共孵育30分钟，与DAPI(2-(4-脒苯基)-6-吲哚氨基甲酸二盐酸盐)共孵育5分钟。用共聚焦激光扫描显微镜获得染色细胞的荧光图像。然后对HUVECs进行DAPI和Hypalloidin染色，随后进行荧光观察。
HUVEC细胞与MS-CeO2-miR129复合材料共培养7d，FITC/DAPI染色显示细胞形态与正常组无明显差异，细胞核和细胞质完整(图4A)。CCK-8法显示3Gy照射后第3d，B组和E组HaCaT细胞的ODs减少，提示辐射明显抑制细胞生长(图4C)。第6天，E组OD明显恢复，且明显高于B组(P<0.05)，提示MS-CeO2-miR129在短期(1～3d)不影响照射细胞的生长，而在长期(>6d)照射细胞的生长曲线恢复正常。
1.2细菌共培养
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和大肠杆菌来自陆军医科大学。将细菌扩增(培养过夜)至1×109CFU/ml，用Luria-Bertani培养基稀释至1×104CFU/ml。抽出等量的菌液涂在盘子上，分别添加等量(10mg)的CeO2、MS-CeO2和MS-CeO2-miR129，37℃培养24h后，测定细菌数量的变化；以不添加上述物质作为对照(Control)。
图4B为G+(MRSA)和G-(大肠杆菌)的抗菌活性检测结果，图4D和4E为图4B的细菌计数。对照组耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA，革兰氏阳性，G+)和大肠杆菌(G-)生长良好，但CeO2有效抑制细菌生长。MS-CeO2对细菌生长有较好的抑制作用，但MS-CeO2-miR129对细菌的抑制作用与MS-CeO2的差异不明显。
2.MS-CeO2-miR129复合材料的体外细胞学研究
实验分为5组，A组为正常细胞组，B组为正常细胞+3Gy辐射组，C组为正常细胞+3Gy辐射+MS组，D组为正常细胞+3Gy辐射+MS-CeO2组，E组为正常细胞+3Gy辐射+MS-CeO2-miR129组。MS、MS-CeO2、MS-CeO2-miR129的加入量均为10mg。
2.1流式细胞术
细胞凋亡检测采用流式细胞术和Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒进行。收集细胞并将其悬浮在含有5μL Annexin V-FITC和5μL PI的200μL结合缓冲液中。应用流式细胞仪检测RISI创面免疫微环境中的CD4+、CD8+、NK细胞和M1细胞，并用荧光激活细胞分选仪(FACS)软件对细胞进行分析。
2.2体外试管形成试验
混合2×104个HaCaT细胞接种到Matrigel涂层的96孔板上，然后加入A-E组。刺激24h后，用倒置相位显微镜拍摄新形成的管。每组有五个重复。每个实验进行三次。
2.3细胞划痕实验
HaCaT在完全培养基中汇合生长，在24个孔板(2×104/孔)中播种。用移液管、针尖和显微镜对单层进行24小时检查(0h)。对于每组5个重复的单个实验，使用ImageJ1.48V软件进行具体测量。试验重复三次。
2.4细胞克隆形成试验
每孔用0.005％结晶紫1ml染色1h，显像后用Image Pro Plus6.0计算群落数。实验结果如图6所示。
图5A为流式细胞术检测结果，图5C为总凋亡率检测结果。结果表明，放疗显著增加凋亡率。E组凋亡率低于B组，对E组的作用高于D组。表明MS-CeO2-miR129能显著降低细胞凋亡率，E组中的miR129的在调节细胞凋亡中起重要作用。这些作用可能与抗ROS机制有关。由于CeO2表面存在Ce3+和Ce4+的可逆转化，因此CeO2具有很好的清除ROS的能力。在本发明中，MS-CeO2-miR129在RISI创面具有明显的抑制细胞凋亡，促进DNA修复，抑制DNA损伤，最终促进血管生成的作用，局部注射miR129表达较高。结果表明，给药miR129显著改变了RISI诱导的细胞凋亡产生。
图5B、5D、5E为MS-CeO2-miR129对HUVEC血管形成的影响。与不同组材料共培养人脐静脉内皮细胞后，进行约24h的Matrigel上行血管生成实验。A组正常细胞的血管数量最多，长度最长。3Gy射线照射后，B组的血管形成受到明显抑制，而D组的MS-CeO2前体材料部分恢复了血管的形成(p<0.05)。E组促血管生成效果最好(p<0.05)。MS-CeO2-miR129可促进人脐静脉内皮细胞形成管状结构，在缺氧和高氧化应激诱导的RISI损伤中是一种挑战。因此，本发明成功地证明了MS-CeO2-miR129确实促进了RISI创面愈合过程中的血管生成。
图6A为细胞划痕实验的结果，图6D为迁移面积百分比。结果表明，B组细胞24h迁移率显著降低，这可能与辐射对细胞迁移的影响有关，而E组的迁移抑制率显著降低，提示该材料提高了受照细胞的迁移率。E组细胞迁移率明显高于D组，表明miR129表达增加促进了HaCaT细胞的迁移。与对照组(B组)相比，MS-CeO2纳米粒子和MS-CeO2-miR129纳米酶对细胞迁移均有一定的促进作用。由于MS-CeO2-miR129具有最好的生物相容性和更好的抗氧化性能，其促进细胞迁移的效果优于其他组。目前的细胞划痕实验表明，MS-CeO2纳米粒子与miR129的结合有效地促进了细胞的迁移。
图6B、6E为HIF-1α的Western Blot和半定量分析结果，E组HIF-1α表达量显著高于B组和D组，说明MS-CeO2-miR129可通过抑制HIF-1α通路来降低HaCaT细胞缺氧。推测miR129催化H2O2等O2产生，使伤口O2含量充足，最终负反馈抑制HIF-1α的表达。
图6C为细胞克隆实验结果，照射4Gy后，单纯照射组(B组)的相对克隆数较照射前减少约60％。与之相比，E组的相对克隆数仅减少了约35％。表明应用CeO2和miR129增强了细胞的抗辐射能力，这有利于细胞的形成。
3.MS-CeO2-miR129复合材料对RISI小鼠模型的影响
3.1RISI小鼠模型建立及实验分组：
每只小鼠腹腔注射戊巴比妥约0.2ml麻醉。直线加速器发射6Mev电子射线(一次照射30Gy，照射场1cm×1cm，剂量300cGy/min，10min)。源皮肤距离为1米，剩余皮肤用铅板封堵。每组照射后，用材料覆盖照射部位，每隔一天更换一次，共7～14d，分为5组，每组5只。
A组为正常小鼠组，B组为正常小鼠+30Gy照射组，C组为正常小鼠+30Gy照射+MS注射组，D组为正常小鼠+30Gy照射+MS-CeO2注射组，E组为正常小鼠+30Gy照射+MS-CeO2-miR129注射组。MS、MS-CeO2和MS-CeO2-miR129的注射剂量均为1ml。
3.2苏木精-伊红(HE)染色及组织学分析
所有小鼠在第1天剃毛并成像建立模型。第14天再次拍照，处死小鼠，取局部皮肤组织进行HE染色。
3.3蛋白印迹及免疫组化染色检测
伤后14天，取10mm×10mm的小方块，包括新生表皮和肉芽组织，立即在液氮中冷冻。采用双线粒体酸法测定上清液的蛋白质浓度。抗体以1:10 00稀释。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗稀释至1:20 00。取PVDF(聚偏氟乙烯)膜进行化学发光观察，免疫组织化学方面，伤口组织切片分离复水，在柠檬酸钠缓冲液中95℃孵育获得热介导抗原。最后，用光学显微镜获得图像。
创面愈合率(％)＝(初始创面面积-愈合特定时间后的创面面积)/初始创面面积×100％。RISI评分遵循道格拉斯和福勒评分法。
图7B为小鼠第1天和第14天的伤口照片和第14天的H&E染色结果，与B组相比，D、E组均有促进创面愈合的作用，且E组的促进作用显著高于D组。以上结果表明MS-CeO2-miR129纳米酶对创面愈合的促进作用最强。
图7C为第14天小鼠体重，图7D为第14天各组创面面积，照射后第14天，D组小鼠创面面积约为B组的65％，而E组仅为B组的41％，E组愈合最好；换算成创面愈合率，D组的创面愈合率为35％，E组为59％；而在相同条件下，注射与MS-CeO2-miR129中等量的miR129，小鼠的创面愈合率为17％。结果表明：将MS-CeO2与miR129进行组合使用，其对于放射性皮肤损伤的创面愈合具有协同增效作用。
E组小鼠体重和A组无明显变化。
图7E为第14天各组HIF-1α酶联免疫吸附试验结果。EL ISA分析显示，E组HIF-1α表达显著高于B、D组，表明MS-CeO2-miR129通过抑制HIF-1α途径减少创面缺氧。低氧诱导因子-1α在低氧反应中起核心作用，在常氧条件下，低氧诱导因子-1α容易被酶降解，但在低氧条件下仍保持高度活性。综上所述，MS-CeO2-miR129通过减轻RISI创伤缺氧和抵抗辐射诱导的DNA损伤来降低辐射敏感性，进一步说明MS-CeO2-miR129纳米酶可以作为辐射抵抗剂。
图7F为第14天各组的毛囊相对数量。H&E染色结果分析表明，由于辐射降低了毛囊密度，这种减少可能会导致伤口形成。新的上皮生长和伤口血管形成过程受到抑制，从而延缓伤口愈合。MS-CeO2-miR129纳米酶显著增加毛囊密度，促进伤口愈合，改善辐射抑制。E组含有miR129，提示其具有较强的促进作用。
综上所述，本发明的MS-CeO2-miR129复合材料，将基于MS-CeO2的纳米酶和miR129整合在一起，形成了具有抗ROS、抗HIF-1α和辐射抵抗活性的良好的核壳结构，从而实现了促进放射性皮肤损伤的高质量愈合。MS提供了基本的核壳结构，促进了材料在伤口血管中的循环。MS-CeO2纳米酶在RISI创面中起到了高效的抗菌、抗ROS和抗缺氧作用。更重要的是，MS-CeO2-miR129复合材料通过减轻体内和体外的缺氧，大大降低了HIF-1的α，从而减少了ROS的损伤。
MS-CeO2-miR129可减轻RISI创面的炎症反应，诱导颗粒状组织形成、血管生成和胶原沉积，从而加快创面闭合速度。此外，MS-CeO2-miR129还改善了免疫微环境。这种纳米材料能够为RISI创面修复提供一种新的治疗药物。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军西部战区总医院
<120> 介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料及其制备方法和应用
<130> 2022
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> miR129
<400> 1
cuuuuugcgg ucugggcuug c 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> miR129
<400> 2
aagcccagac cgcaaaaguu 20

Claims (7)

1.一种介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）向介孔二氧化硅分散液中加入氧化铈分散液，搅拌12-20h，得到MS-CeO2；
（2）将DSPE-PEG-NHS溶于无菌PBS缓冲液中，加入miR129-NH2，混合反应12-20h，透析纯化得到DSPE-PEG-miR129；
（3）将DSPE-PEG-miR129加入到MS-CeO2中，搅拌12-20h，制备得到MS-CeO2-miR129复合材料；
步骤（1）中，介孔二氧化硅分散液与氧化铈分散液加入的体积比为1:1；
步骤（2）中，DSPE-PEG-NHS与miR129-NH2加入的质量比为2:1；
步骤（3）中，DSPE-PEG-miR129与MS-CeO2加入的体积比为1:1。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（1）中，介孔二氧化硅分散液中介孔二氧化硅的含量为200mg/ml；氧化铈分散液中氧化铈的含量为200mg/ml。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，步骤（2）中，miR129的核苷酸序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
4.由权利要求1-3任一项所述的制备方法制备的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料。
5.根据权利要求4所述的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料，其特征在于，所述介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料的尺寸为50-80nm。
6.权利要求4或5所述的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料在制备促进放射性皮肤损伤愈合的药物中的应用。
7.一种促进放射性皮肤损伤愈合的药物，其特征在于，所述药物以权利要求4或5所述的介孔二氧化硅-氧化铈-miR129复合材料为活性成分。
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