CN111830173B - 皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法，皂角刺饮片中野皂角刺的掺假量X与皂角刺饮片色谱图中野皂角刺成分的峰面积Y之间存在一次方函数关系，符合Lambert‑Berr定律。本发明所述的方法符合科学理论，实验操作简便，可在较短时间内完成样品的检测，对皂角刺饮片是否掺假野皂角刺，野皂角刺的掺假比例能够进行简单、快速准确的检验，为检测中药饮片掺假提供了一种全新的方法，为中药饮片质量控制提供新视野。本发明在中药饮片的生产、销售和使用领域的质量检验中具有重要的实用价值，特别是对于药品质量管理部门打击掺假、掺伪的不法行为具有十分重要的借鉴和推广意义。

Description

皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法
技术领域
本发明涉及中药材检测技术领域，具体的说是一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法。
背景技术
中药材及饮片是供中医临床用药、中成药生产的重要原料，是我国医疗保健事业的重要组成部分和医药宝库中的瑰宝。皂角刺含有黄酮、多酚、三萜皂苷、香豆素、甾醇、内脂、三萜等成分，具有消肿排毒，排脓杀虫之功效，临床主治痈疽肿毒；瘰疬；产后缺乳；胎衣不下；其外用于疥癣麻风。具有抗炎、抑菌、免疫调节、抗肿瘤等多种药理活性。皂角刺为豆科植物皂荚Gleditsia sinensis Lam.的干燥棘刺。皂荚系豆科云实亚科皂荚属植物，是我国特有的乡土树种。主产于甘肃、湖北、山西、河北、山东、江苏、安徽等地。皂角刺饮片是由皂角刺原药材切片成不规则厚片或斜切片，直径0.3～1cm，常带有尖细的刺端。
中药饮片的质量包括“真伪”和“优劣”两方面，《中国药典》为我国中药材、中药饮片质量检验的法定标准。标准中关于“真伪”检验的技术包括性状检验（即传统的经验鉴别）、显微鉴别和化学鉴别（以薄层色谱鉴别为主，个别采用高效液相色谱法HPLC、气相色谱法GC）。“优劣”检验的技术包括以高效液相色谱法HPLC、气相色谱法GC为主的含量测定、浸出物含量测定，以及其他检查指标的项目。
近年，中药饮片质量隐患较多，不法分子为了谋取暴利，肆意掺进外观相近的其他中药饮片或根本就不是中药饮片的植物、动物或矿物，中药饮片的掺假掺伪成为近年国家严厉打击的领域。传统鉴别方法是对药材或饮片的“形”、“色”、“气”、“味”为基本要素的判别，这对其辨识者的技术水平、实践能力、从业技术都有很高要求，需要具备丰富的经验和敏锐的判别能力，由于检验者的水平参差不一，检验的准确性、重复性和结论的一致性不高，误判情况时有发生。同样，对于人为掺假做假现象，国家标准收录的理化鉴定方法并不能满足中药饮片真伪、优劣鉴定的需要。必须借鉴现代科学技术及检测设备，根据市场出现掺假的具体饮片品种，有目的、有针对性的构建专属性量化检测检验方法，或针对现有鉴定方法中的鉴定特征进行替代研究，严重制约了中药饮片质量检验和质量判断。应该结合实际掺假掺伪的具体饮片来源，建立不同的检测方法，以供企业、流通、医疗和质检部门做为检验的依据。
发明内容
本发明的目的是提供一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法，能够快速检测出市场购买的皂角刺饮片中是否掺假野皂角刺，并对野皂角刺的掺假量进行快速、准确的计算，易于操作。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法，皂角刺饮片中野皂角刺的掺假量X与皂角刺饮片色谱图中野皂角刺成分的峰面积Y之间存在一次方函数关系，符合Lambert-Berr定律，建立的二元一次方程为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
式中：R2表示X与Y的线性离合程度，R2越大回归线性离合效果越好。
优选的，该方法包括以下步骤：
步骤一、制备内标溶液：精密称定阿魏酸对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，得到质量百分比浓度为10%的阿魏酸溶液；
步骤二、制备皂角刺正品饮片溶液标准色谱：精密称定皂角刺正品饮片0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到皂角刺正品标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到皂角刺正品饮片的色谱图；
步骤三、制备野皂角刺参照样品色谱图：精密称定野皂角刺0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到野皂角刺标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到野皂角刺样品的色谱图；
步骤四、制备供试品溶液进行色谱分析：取掺假比例为10.9-70.0%的皂角刺饮片为供试品，粉碎，过三号筛，取0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，收集续滤液为供试品溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9ml/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到供试品溶液的色谱图；
步骤五，将步骤四所制备的供试品溶液色谱图与步骤二所制备的皂角刺正品饮片的色谱图和步骤三所制备的野皂角刺的色谱图进行比较，判断供试品中是否掺假野皂角刺；
步骤六，测量步骤四所制备的供试品溶液色谱图中的野皂角刺成分的峰面积Y为48.34995-276.93195mAU·S，计算出皂角刺中野皂角刺的掺假量X为0.02934-0.2002g，与实际掺入野皂角刺的质量相比较，存在0.4-2.8%的相对偏差。
优选的，所述皂角刺饮片色谱图中野皂角刺成分的峰面积Y为皂角刺饮片供试品溶液色谱图中野皂角刺与内标物阿魏酸相对保留时间为1.434时所得到的野皂角刺的峰面积值。
优选的，所述皂角刺饮片色谱图为选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，C18色谱柱，柱温为30℃，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，所得到的皂角刺饮片的色谱图。
本发明所述的流动相乙腈-0.1%甲酸梯度脱洗系统的洗脱梯度表见表1。
表1
Figure 227729DEST_PATH_IMAGE002
为了验证所选取的梯度洗脱系统的适宜性，进行了如下实验。
精密度 分别选取掺假量为30%的掺有野皂角刺的皂角刺饮片样品，按照本发明所述方法制备供试品溶液，在乙腈-0.1%甲酸流动相及305nm检测波长色谱条件下连续进样6次进行试验，得到精密度考察色谱图如图3所示；分别计算色谱中内标物阿魏酸、野皂角刺成分A（相对保留时间1.434）峰面积平均值，结果内标物阿魏酸的峰面积RSD<0.2%、野皂角刺特征峰R峰面积RSD<0.4%，表明精密度良好。
重复性 取6份市场购买的掺假量为30%的掺有野皂角刺的皂角刺饮片样品，按照本发明所述方法制备供试品溶液，在乙腈-0.1%甲酸流动相及305nm检测波长色谱条件下，得到重复性考察色谱图如图4所示；分别计算色谱中每单位掺假比例下内标物阿魏酸、野皂角刺成分A（相对保留时间1.434）峰面积平均值，结果内标物阿魏酸的峰面积RSD<2.5%、野皂角刺特征峰A峰面积RSD<3.0%，表明重复性良好。
稳定性 取掺假量为30%的掺有野皂角刺的皂角刺饮片样品，按照本发明所述方法制备供试品溶液，将供试品溶液分别于0、2、4、6、8、10、12、24h时进样，在乙腈-0.1%甲酸流动相及305nm检测波长色谱条件下，得到稳定性考察色谱图如图5所示；分别计算色谱中内标物阿魏酸、野皂角刺成分A（相对保留时间1.434）峰面积平均值，结果内标物阿魏酸的峰面积RSD<0.6%、野皂角刺特征峰A峰面积RSD<0.8%，表明稳定性良好。
皂角刺饮片中野皂角刺的掺假量X与野皂角刺成分A（相对保留时间1.434）的峰面积Y存在的函数关系验证：
为了检测在正品皂角刺饮片中掺假野皂角刺饮片的比例，进行模拟试验，以正品中掺假野皂角刺（掺假比例为10.9%-70.0%），与野皂角刺成分A的峰面积进行线性关系考查（皂角刺与野皂角刺的总量为0.3g），结果见表2；野皂角刺掺假量与特征峰线性关系如图6所示。
表2
Figure DEST_PATH_IMAGE003
本发明所述皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法符合科学理论，实验操作简便，可在较短时间内完成样品的检测，对皂角刺饮片是否掺假野皂角刺，野皂角刺的掺假比例能够进行简单、快速准确的检验，为检测中药饮片掺假提供了一种全新的方法，为中药饮片质量控制提供新视野。本发明在中药饮片的生产、销售和使用领域的质量检验中具有重要的实用价值，特别是对于药品质量管理部门打击掺假、掺伪的不法行为具有十分重要的借鉴和推广意义。
本发明所选用的仪器包括：Agilent 1260高效液相色谱仪，Agilent 5TC-C18柱（250 mm×4.60mm，5μm）、G7129A型自动进样器、G7116A型柱温箱、G7115A型DAD检测器、G7111A型四元梯度泵；KQ-500DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；NC-MS型电子天平(精密度0.1 mg)(梅特勒)。所选用的实验试剂包括阿魏酸对照品（110773-201614，中国食品药品检定研究院，99.0%）；乙腈（JA050130，默克，色谱纯）；甲醇（WXBC8482V，SIGMA，色谱纯）；水为纯化水。所选用的实验材料包括皂角刺样品购置甘肃陇西药材产地，为豆科植物皂荚Gleditsia sinensis Lam.的干燥棘刺。掺假饮片购置于国内药材市场，鉴定掺伪样品为豆科植物野皂荚Gleditsia heterophylla Bunge带枝条的棘刺。
附图说明
图1为皂角刺正品饮片标准溶液色谱图谱；
图2为野皂角刺溶液色谱图；
图3为掺假量为30%的掺有野皂角刺的皂角刺饮片样品在色谱条件下连续进样6次的色谱图（精密度考察色谱图）；
图4取6份掺假量为30%的掺有野皂角刺的皂角刺饮片样品在色谱条件下的色谱图（重复性考察色谱图）；
图5为掺假量为30%的掺有野皂角刺的皂角刺饮片样品制备成供试品后分别于0、2、4、6、8、10、12、24小时时进样的色谱图（稳定性试验色谱图）；
图6为野皂角刺掺假量与特征峰线性关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的表述。
一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法，皂角刺饮片中野皂角刺的掺假量X与皂角刺饮片色谱图中野皂角刺成分（相对保留时间1.434）的峰面积Y之间存在一次方函数关系，符合Lambert-Berr定律，建立的二元一次方程为：
Figure 916723DEST_PATH_IMAGE001
式中：R2表示X与Y的线性离合程度，R2越大回归线性离合效果越好。
皂角刺饮片色谱图中野皂角刺成分的峰面积Y为皂角刺饮片供试品溶液色谱图中野皂角刺与内标物阿魏酸相对保留时间为1.434时所得到的野皂角刺的峰面积值。
皂角刺饮片色谱图为选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，C18色谱柱，柱温为30℃，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，所得到的皂角刺饮片的色谱图。
流动相乙腈-0.1%甲酸梯度脱洗系统的洗脱梯度表见表1。
选取了流动相乙腈-0.1%甲酸进行梯度脱洗，通过在不同洗脱程序及不同检测波长下正品皂角刺饮片和野皂角刺饮片色谱图的比较，乙腈-0.1%甲酸流动相及305nm检测波长下皂角刺饮片和野皂角刺饮片所得到的色谱图的特征成分有很好的分辨度。在此条件下，野皂角刺饮片在37.1min出现特征性的色谱峰（认定为野皂角刺成分A），没有皂角刺的阳性干扰，正品皂角刺与掺假的野皂角刺色谱分离良好、基线平稳。同时，为对野皂角刺中的特征性成分A定位，本发明采用加入一种内标物，用相对保留时间对其进行定性，在筛选了黄芩苷、绿原酸、橙皮苷、阿魏酸、葛根素、木犀草素、槲皮素等多种化学组分后，最终确定以阿魏酸作为内标物，其保留时间为25.8min，野皂角刺特征峰R相对保留时间为1.434。该内标物简便易得，性质稳定。
制备供试品样品是在正品皂角刺饮片中分别掺进10.9%-70.0%不同比例的野皂角刺饮片，进行检测方法的系统研究、验证试验和建立判别函数。
实施例1
一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法包括以下步骤：
步骤一、制备内标溶液：精密称定阿魏酸对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，得到质量百分比浓度为10%的阿魏酸溶液；
步骤二、制备皂角刺正品饮片溶液标准色谱：精密称定皂角刺正品饮片0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到皂角刺正品标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到皂角刺正品饮片的色谱图；
步骤三、制备野皂角刺参照样品色谱图：精密称定野皂角刺0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到野皂角刺标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到野皂角刺样品的色谱图；
步骤四、制备供试品溶液进行色谱分析：取掺假比例为10.9%的自制掺假皂角刺饮片为供试品，粉碎，过三号筛，取0.3g，其中皂角刺的质量为0.2672g，掺入野皂角刺量0.0328g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，收集续滤液为供试品溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9ml/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到供试品溶液的色谱图；
步骤五，将步骤四所制备的供试品溶液色谱图与步骤二所制备的皂角刺正品饮片的色谱图和步骤三所制备的野皂角刺的色谱图进行比较，可判断出供试品中掺假了野皂角刺；
步骤六，测量步骤四所制备的供试品溶液色谱图中的野皂角刺成分A（相对保留时间1.434）的峰面积Y为48.34995，计算出野皂角刺的质量为0.02934，与实际掺入野皂角刺的质量相比较，存在2.8%的相对偏差。
实施例2
一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法包括以下步骤：
步骤一、制备内标溶液：精密称定阿魏酸对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，得到质量百分比浓度为10%的阿魏酸溶液；
步骤二、制备皂角刺正品饮片溶液标准色谱：精密称定皂角刺正品饮片0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到皂角刺正品标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到皂角刺正品饮片的色谱图；
步骤三、制备野皂角刺参照样品色谱图：精密称定野皂角刺0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到野皂角刺标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到野皂角刺样品的色谱图；
步骤四、制备供试品溶液进行色谱分析：取掺假比例为29.9%的自制掺假皂角刺饮片为供试品，粉碎，过三号筛，取0.3g，其中皂角刺的质量为0.2084g，掺入野皂角刺量0.0916g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，收集续滤液为供试品溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9ml/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到供试品溶液的色谱图；
步骤五，将步骤四所制备的供试品溶液色谱图与步骤二所制备的皂角刺正品饮片的色谱图和步骤三所制备的野皂角刺的色谱图进行比较，可判断出供试品中掺假了野皂角刺；
步骤六，测量步骤四所制备的供试品溶液色谱图中的野皂角刺成分A（相对保留时间1.434）的峰面积Y为135.7687，计算出野皂角刺的质量为0.09467，与实际掺入野皂角刺的质量相比较，存在0.8%的相对偏差。
实施例3
一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法包括以下步骤：
步骤一、制备内标溶液：精密称定阿魏酸对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，得到质量百分比浓度为10%的阿魏酸溶液；
步骤二、制备皂角刺正品饮片溶液标准色谱：精密称定皂角刺正品饮片0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到皂角刺正品标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到皂角刺正品饮片的色谱图；
步骤三、制备野皂角刺参照样品色谱图：精密称定野皂角刺0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到野皂角刺标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到野皂角刺样品的色谱图；
步骤四、制备供试品溶液进行色谱分析：取掺假比例为40.1%的自制掺假皂角刺饮片为供试品，粉碎，过三号筛，取0.3g，其中皂角刺的质量为0.1750g，掺入野皂角刺量0.1250g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，收集续滤液为供试品溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9ml/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到供试品溶液的色谱图；
步骤五，将步骤四所制备的供试品溶液色谱图与步骤二所制备的皂角刺正品饮片的色谱图和步骤三所制备的野皂角刺的色谱图进行比较，可判断出供试品中掺假了野皂角刺；
步骤六，测量步骤四所制备的供试品溶液色谱图中的野皂角刺成分A（相对保留时间1.434）的峰面积Y为181.62575，计算出野皂角刺的质量为0.1289，与实际掺入野皂角刺的质量相比较，存在0.8%的相对偏差。
实施例4
一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法包括以下步骤：
步骤一、制备内标溶液：精密称定阿魏酸对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，得到质量百分比浓度为10%的阿魏酸溶液；
步骤二、制备皂角刺正品饮片溶液标准色谱：精密称定皂角刺正品饮片0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到皂角刺正品标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到皂角刺正品饮片的色谱图；
步骤三、制备野皂角刺参照样品色谱图：精密称定野皂角刺0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到野皂角刺标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到野皂角刺样品的色谱图；
步骤四、制备供试品溶液进行色谱分析：取掺假比例为51.4%的自制掺假皂角刺饮片为供试品，粉碎，过三号筛，取0.3g，其中皂角刺的质量为0.1438g，掺入野皂角刺量0.1562g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，收集续滤液为供试品溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9ml/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到供试品溶液的色谱图；
步骤五，将步骤四所制备的供试品溶液色谱图与步骤二所制备的皂角刺正品饮片的色谱图和步骤三所制备的野皂角刺的色谱图进行比较，可判断出供试品中掺假了野皂角刺；
步骤六，测量步骤四所制备的供试品溶液色谱图中的野皂角刺成分A（相对保留时间1.434）的峰面积Y为221.31615，计算出野皂角刺的质量为0.1586g，与实际掺入野皂角刺的质量相比较，存在0.4%的相对偏差。
实施例5
一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法包括以下步骤：
步骤一、制备内标溶液：精密称定阿魏酸对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，得到质量百分比浓度为10%的阿魏酸溶液；
步骤二、制备皂角刺正品饮片溶液标准色谱：精密称定皂角刺正品饮片0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到皂角刺正品标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到皂角刺正品饮片的色谱图；
步骤三、制备野皂角刺参照样品色谱图：精密称定野皂角刺0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到野皂角刺标准溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到野皂角刺样品的色谱图；
步骤四、制备供试品溶液进行色谱分析：取掺假比例为70.0%的自制掺假皂角刺饮片为供试品，粉碎，过三号筛，取0.3g，其中皂角刺的质量为0.1168g，掺入野皂角刺量0.1832g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，收集续滤液为供试品溶液；选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9ml/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到供试品溶液的色谱图；
步骤五，将步骤四所制备的供试品溶液色谱图与步骤二所制备的皂角刺正品饮片的色谱图和步骤三所制备的野皂角刺的色谱图进行比较，可判断出供试品中掺假了野皂角刺；
步骤六，测量步骤四所制备的供试品溶液色谱图中的野皂角刺成分A（相对保留时间1.434）的峰面积Y为276.93195，计算出野皂角刺的质量为0.2002g，与实际掺入野皂角刺的质量相比较，存在2.2%的相对偏差。
上述实施例中所制备的5批不同掺假比例的掺有野皂角刺的皂角刺饮片样品，按照本发明所述方法计算得到的掺假量与实际掺假量相比较的结果见表3。
表3
Figure 577511DEST_PATH_IMAGE004
从表3中可以看出，实际掺入的野皂角刺掺假量（比例），与通过建立的二元一次线性方程中计算出来的野皂角刺的掺假量非常相近，相对平均偏差小于3.0%，充分证明本发明所述的皂角刺饮片中野皂角刺的掺假量X与野皂角刺成分A的峰面积Y存在的函数关系成立。

Claims (2)

1.一种皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
步骤一、制备内标溶液：精密称定阿魏酸对照品10mg，置于100ml容量瓶中，加甲醇使溶解并稀释至刻度，得到质量百分比浓度为10%的阿魏酸溶液；
步骤二、制备皂角刺正品饮片溶液标准色谱：精密称定皂角刺正品饮片0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到皂角刺正品标准溶液；选用高效液相色谱仪，色谱柱：C18色谱柱；选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到皂角刺正品饮片的色谱图；
步骤三、制备野皂角刺参照样品色谱图：精密称定野皂角刺0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得到野皂角刺标准溶液；选用高效液相色谱仪，色谱柱：C18色谱柱；选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到野皂角刺样品的色谱图；
步骤四、制备供试品溶液进行色谱分析：取掺假比例为10.9-70.0%的皂角刺饮片为供试品，粉碎，过三号筛，取0.3g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，称定重量，采用功率为400W，频率40kHz的超声处理30分钟，取出，静置降至室温，称定重量，用甲醇补足减失重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5ml，取步骤一所制备的内标溶液1ml与滤液置于同一10ml容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，收集续滤液为供试品溶液；选用高效液相色谱仪，色谱柱：C18色谱柱；选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，流速为0.9ml/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，得到供试品溶液的色谱图；
步骤五，将步骤四所制备的供试品溶液色谱图与步骤二所制备的皂角刺正品饮片的色谱图和步骤三所制备的野皂角刺的色谱图进行比较，判断供试品中是否掺假野皂角刺；
步骤六，测量步骤四所制备的供试品溶液色谱图中的野皂角刺成分的峰面积Y为48.34995-276.93195mAU·S，计算出皂角刺中野皂角刺的掺假量X为0.02934-0.2002g，与实际掺入野皂角刺的质量相比较，存在0.4-2.8%的相对偏差；
所述流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统的洗脱梯度表为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
皂角刺饮片中野皂角刺的掺假量X与皂角刺饮片色谱图中野皂角刺成分的峰面积Y之间存在一次方函数关系，符合Lambert-Berr定律，建立的二元一次方程为：
Figure DEST_PATH_IMAGE004
式中：R2表示X与Y的线性离合程度，R2越大回归线性离合效果越好；
所述皂角刺饮片色谱图中野皂角刺成分的峰面积Y为皂角刺饮片供试品溶液色谱图中与内标物阿魏酸相对保留时间为1.434时所得到的野皂角刺的峰面积值。
2.根据权利要求1所述的皂角刺饮片中掺杂野皂角刺含量的内标法检测方法，其特征在于：所述皂角刺饮片色谱图为选用高效液相色谱仪，选择色谱进样条件为流动相乙腈-0.1%甲酸梯度洗脱系统，C18色谱柱，柱温为30℃，流速为0.9mL/min，检测波长为305nm，进样体积10μL，进样，所得到的皂角刺饮片的色谱图。
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