CN111808953A - 一种用于肿瘤诊断和治疗的lncRNA标志物 - Google Patents

一种用于肿瘤诊断和治疗的lncRNA标志物 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于肿瘤诊断和治疗的lncRNA标志物。本发明记载了使用lncRNA RP11‑533E19.7区分肝癌和正常对照的产品和用途，本发明同时记载了使用lncRNA RP11‑533E19.7治疗肝癌的药物组合物和用途。

Description

一种用于肿瘤诊断和治疗的lncRNA标志物
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种用于肿瘤诊断和治疗的lncRNA标志物。
背景技术
恶性肿瘤是威胁、人类健康的第二大疾病。尽管近年来恶性肿瘤的死亡率逐渐下降，但肝癌的发病率确逐年上升。肝癌作为一种常见的恶性肿瘤，位居我国恶性肿瘤发病率第四位，病死原因第二位，尤其在东亚、东南亚、非洲和南欧。乙型肝炎，丙型肝炎，或酒精引起的肝硬化是肝癌的首要致病因素。原发性肝癌主要分为三种亚型：肝细胞肝癌，是最主要的一种亚型，约占原发性肝癌的85％；胆管细胞型肝癌，作为第二大类型，其发病率也不断增加，以及包含肝细胞癌与胆管细胞癌两种成分的混合型肝癌。尽管随着诊断技术的不断发展和治疗手段的多样化，肝癌五年生存率已得到很大程度上的提高，但仍有近70％的肝癌会发生复发、转移，因此明确肝癌侵袭转移的机制对改善患者预后具有十分重要的意义。
长链非编码RNA(LncRNA)是一类长度大于200bp的非编码RNA。LncRNA有多种来源，其中主要为：长的基因间RNAs(LlncRNAs)、长的内含子非编码RNA、基因的反义链、启动子相关长非编码RNA、增强子RNAs，假基因、3'端非编码区以及长的应激诱导的非编码转录本等。同蛋白编码基因类似，长非编码RNA主要由II型RNA聚合酶(RNA pol II)转录而来，并且具有独立的启动子、转录因子结合区、表观遗传学修饰、外显子及内含子。一些研究发现1ncRNAs可以通过与多梳抑制复合物(polycomb repressive complex,PRC)结合，调节染色体重塑和基因的表达。此外LncRNA还可以通过与某些转录因子结合改变其转录活性或稳定性间接调节下游基因的表达；也可作为竞争性RNA(ceRNA)通过与一些miRNAs结合抑制其功能进而促进miRNA下游靶基因的表达。lncRNA在肝癌的发病与进展中发挥重要的作用，并能够作为分子标记对疾病的发展加以评估，lncRNA研究的深入，不仅是解析疾病发病机制的重要一环，更能够为疾病监测、风险评估提供重要依据。
发明内容
为了弥补现有技术的不足，本发明经过广泛而深入的研究，通过检测肝癌标本中lncRNA在肿瘤组织和正常组织的表达，发现其中具有明显表达差异的lncRNA，探讨其与肝癌的发生之间的关系，从而为肝癌的诊断及靶向治疗寻找更好的途径和方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了检测RP11-533E19.7的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。
进一步，所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测RP11-533E19.7表达水平的试剂。
进一步，通过反转录PCR检测RP11-533E19.7表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-533E19.7的引物，通过实时定量PCR检测RP11-533E19.7表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-533E19.7的引物，通过原位杂交检测RP11-533E19.7表达水平的试剂包括特异性识别RP11-533E19.7的探针，通过芯片技术检测RP11-533E19.7表达水平的试剂包括特异性识别RP11-533E19.7的探针。
进一步，通过实时定量PCR检测RP11-533E19.7表达水平的特异性扩增RP11-533E19.7的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
进一步，所述产品包括芯片、试剂盒。所述基因芯片包括固相载体以及固定在固相载体的特异性识别RP11-533E19.7的寡核苷酸探针，所述试剂盒包括特异性扩增RP11-533E19.7的引物、特异性识别RP11-533E19.7的寡核苷酸探针或芯片。
本发明提供了一种一种诊断肝癌的产品，所述产品包括检测RP11-533E19.7表达水平的试剂。
进一步，所述产品包括芯片或试剂盒。
进一步，芯片中检测RP11-533E19.7表达水平的试剂包括特异性识别RP11-533E19.7基因的探针。
进一步，试剂盒中检测RP11-533E19.7表达水平的试剂包括特异性扩增RP11-533E19.7基因的引物或特异性识别RP11-533E19.7基因的探针。
进一步，特异性扩增RP11-533E19.7基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明提供了RP11-533E19.7在制备治疗肝癌、或抑制或降低肝癌细胞生长、增殖、迁移的药物组合物中的应用。
进一步，所述药物组合物包括特异性抑制RP11-533E19.7的分子。
进一步，所述分子选自核酸分子、脂类、小分子化学药、核酸构建体。
进一步，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、dsRNA、siRNA或shRNA。
进一步，所述核酸分子为siRNA。
本发明提供了一种治疗肝癌、或抑制或降低肝癌细胞生长、增殖、迁移的药物组合物，所述药物组合物包括特异性抑制RP11-533E19.7的分子。
进一步，所述分子选自核酸分子、脂类、小分子化学药、核酸构建体。
进一步，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、dsRNA、siRNA或shRNA。
进一步，所述核酸分子为siRNA。
进一步，所述药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
发明详述
本发明的发明人经过大量实验和反复研究，发现RP11-533E19.7在肝癌组织中表达显著上调，为了探讨RP11-533E19.7与肝癌的发生发展之间的相关性，通过下调RP11-533E19.7基因表达来检测该基因对肝癌细胞的功能性影响。
在本发明中，术语“RP11-533E19.7”位于1号染色体上，基因号为ENSG00000231407，包括RP11-533E19.7基因及其的同源物，突变，和同等型。该术语涵盖全长，未加工的RP11-533E19.7，以及源自细胞中加工的任何形式的RP11-533E19.7。该术语涵盖RP11-533E19.7的天然发生变体(例如剪接变体或等位变体)。一种代表性的RP11-533E19.7的序列如ENST00000610272.1所示。
在本发明中，特异性识别RP11-533E19.7的寡核苷酸探针可以是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核苷酸序列特异性结合，任何长度都可以。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超过30个碱基对，与目的核苷酸序列互补的长度以15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序列最好少于4个碱基对，以免影响杂交效率。
所述固相载体包括无机载体和有机载体，所述无机载体包括但不限于有硅载体、玻璃载体、陶瓷载体等；所述有机载体包括聚丙烯薄膜、尼龙膜等。
许多表达检测方法使用分离的RNA。起始材料典型地是从生物样品，例如分别从肿瘤或肿瘤细胞系，以及相应的正常组织或细胞系分离的总RNA。如果RNA的来源是原发性肿瘤，则可以从冷冻的或保存的石蜡包埋并固定的(例如福尔马林固定的)组织样品(例如病理学家指导的组织核心样品)中提取RNA(例如mRNA)。
RNA提取的一般方法是本领域熟知的。特别地，可以使用来自商业制造商，例如TIANGEN的纯化试剂盒、缓冲剂套组和蛋白酶进行RNA分离，按照制造商的说明进行。其它可商购的RNA分离试剂盒可包括MASTERPURETM Complete DNA和RNA纯化试剂盒(Epicentre,Madison,Wis.)和Paraffin Block RNA分离试剂盒(Ambion,Austin,TX)。例如，可以使用RNA Stat-60(Tel-Test,Friendswood,TX)从组织样品中分离总RNA。例如，可以使用高纯FFPE RNA Microkit,货号04823125001(Roche Applied Science,Indianapolis,IN)从FFPE中分离总RNA。例如，可以通过氯化铯密度梯度离心分离从肿瘤制备的RNA。此外，可以通过使用本领域技术人员熟知的技术容易地处理大量组织样品。
分离的RNA可用于杂交或扩增测定中，包括，但不限于PCR分析和探针阵列。用于检测RNA水平的一种方法包括使分离的RNA与能与由被检测基因杂交的核酸分子(探针)接触。核酸探针可以是，例如，全长cDNA，或其部分，例如长度为至少7,15,30,60,100,250或500个核苷酸并且在严谨条件下足以与本发明公开的内在基因，或任何衍生的DNA或RNA特异性杂交的寡核苷酸。RNA与探针的杂交表示所述的内在基因正在表达。
在一个实施方案中，RNA被固定在固体表面上并与探针接触，例如通过使分离的RNA在琼脂糖凝胶上运行，并将RNA从胶上转移至膜，例如硝酸纤维素膜。在替代的实施方案中，探针被固定在固体表面上，RNA例如在Agilent的基因芯片阵列中与探针接触。技术人员可以容易地改变已知的RNA检测方法以适用于检测本公开的内在基因的表达水平。
在本发明的实施方案中，通过定量RT-PCR评价内在基因表达。许多不同的PCR或QPCR方案是本领域已知的，并可以直接应用它们或者对其进行改变以适用于使用当前所述的组合物来检测和/或定量本发明中所列的内在基因。通常，在PCR中，用至少一种寡核苷酸引物或一对寡核苷酸引物进行反应扩增靶核苷酸序列。一个或多个引物与靶核酸的互补区域杂交，并且DNA聚合酶延伸一个或多个引物以扩增靶序列。在足以提供基于聚合酶的核酸扩增产物的条件下，单一大小的核酸片段在反应产物(靶多核苷酸序列，其是扩增产物)中占优势。重复扩增循环以增加单个靶多核苷酸序列的浓度。可以在任何通常用于PCR的热循环仪中进行反应。但是，优选的是具有实时荧光测量能力的循环仪，例如，
Figure BDA0002529821970000051
(Cepheid,Sunnyvale,CA)、ABI PRISM
Figure BDA0002529821970000052
(Applied Biosystems,Foster City,Calif.)、ROTOR-GENETM(Corbett Research,Sydney,Australia)、
Figure BDA0002529821970000053
(Roche Diagnostics Corp,Indianapolis,Ind.)、
Figure BDA0002529821970000054
(BioradLaboratories,Hercules,Calif.)和
Figure BDA0002529821970000055
(Stratagene,La Jolla,Calif.)。
本发明提供了一种诊断肝癌的产品，所述产品包括检测RP11-533E19.7表达水平的试剂。
进一步，所述产品包括芯片或试剂盒，芯片中检测RP11-533E19.7表达水平的试剂包括特异性识别RP11-533E19.7基因的探针；试剂盒中检测RP11-533E19.7表达水平的试剂包括特异性扩增RP11-533E19.7基因的引物或特异性识别RP11-533E19.7基因的探针。
作为一种实施方案，试剂盒包含一组寡核苷酸引物，所述引物足以检测和/或定量本发明所述的内在基因。寡核苷酸引物可以以冻干或重构的形式提供，或者可以作为一组核苷酸序列提供。在一个实施方案中，以微孔板(microplate)的形式提供引物，其中每一个引物组占用微孔板中的一个孔(或多个孔，如在重复的情况下)。微孔板可以进一步包含足以检测如下所述的一个或多个看家基因的引物。试剂盒可以进一步包含足以扩增本发明所述的基因的表达产物的试剂和说明。
为了便于快速访问，例如为进行比较、检查、恢复、和/或修改，分子特征/表达概况典型地记录在数据库中。最典型地，数据库是可由计算机设备访问的关系数据库，虽然可以使用其它形式，例如作为照片、模拟或数字成像读数、电子表格等的表达概况的手动访问索引文件。无论最初记录的表达模式本质上是模拟的或数字的，表达模式、表达概况(集合的表达模式)和分子特征(相关表达模式)以数字形式储存并通过数据库访问。典型地，数据库在中央设备编辑并维持，可以在本地和/或远程访问。
进一步，特异性扩增RP11-533E19.7基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
本发明提供了RP11-533E19.7在制备治疗肝癌或抑制肿瘤细胞增殖/侵袭的药物组合物中的应用。药物组合物包括特异性抑制RP11-533E19.7的分子。所述分子选自核酸分子、脂类、小分子化学药、核酸构建体。所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、dsRNA、siRNA或shRNA，作为本发明的一种具体实施方式，所述核酸分子为siRNA。
作为一种可选择的实施方式，本发明的药物组合物还包括由特异性针对RP11-533E19.7的核酸分子构建的和核酸构建体。作为一种优选的实施方式，所述核酸构建体为慢病毒载体，所述慢病毒载体包括但不限于pLKO.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP、pLKO.1-CMV-Neo、pLKO.1-Neo、pLKO.1-Neo-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP、pLKO.1-puro-CMV-TagFP635、pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP、pLKO.1-puro-UbC-TagFP635、pLKO-puro-IPTG-1xLacO、pLKO-puro-IPTG-3xLacO、pLP1、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BLOCK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNA1.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-GW/lacZ。
作为一种可选择的实施方式，所述药物组合物还包括含有特异性针对RP11-533E19.7的核酸分子构建的或核酸构建体的细胞。优选的，所述细胞为真核细胞，例如为哺乳动物细胞。
在制备这些药物组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括:乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水等。制剂还可包括:湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。
该药物组合物的应用为肿瘤的治疗提供了一种方法，具体为一种预防或治疗对象体内肿瘤的方法，包括将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。
所述药物组合物用于预防或治疗对象体内肿瘤时，需要将有效剂量的所述的药物组合物施用于对象中。采用该方法，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移被抑制。进一步的，所述肿瘤的生长、增殖、复发和/或转移的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的部分被抑制。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现了RP11-533E19.7基因的表达水平与肝癌相关，通过检测受试者样本中RP11-533E19.7的表达水平，可以判断受试者是否患有肝癌，以及患肝癌的风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
本发明发现了一种与肝癌相关的RP11-533E19.7基因分子标记物，采用分子标记物进行诊断，相比传统诊断手段，更及时、更灵敏、更特异。
附图说明
图1是RP11-533E19.7的诊断效能图。
图2是RP11-533E19.7对肝癌细胞增殖的影响图。
图3是RP11-533E19.7对肝癌细胞迁移和侵袭的影响图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1检测RP11-533E19.7在肝细胞癌中的表达情况
1、样品收集
分别收集27例原发性肝细胞癌患者的癌组织及相对应的癌旁组织样本(距离肿瘤边缘≥5cm的肝组织)，配对的癌组织经病理证实为肝细胞癌。标本于手术后内用大量生理盐水清洗干净后立即分装，经液氮冷冻后放入-80℃冰箱冻存。
2、RNA样品的制备及质量分析
使用TRIZOL法提取组织总RNA
1)用剪刀组织剪碎，加入1ml Trizol,振荡器上震荡1min；常温放置10min，使核蛋白体完全分解。
2)加入200μl三氯甲烷(氯仿)，盖紧管盖，剧烈震荡15s，常温静置10min。
3)4℃，11000rpm离心15min。
4)将水样层转移到一个新的离心管中，加入500μl异丙醇；颠倒混匀后，常温静置10min。
5)4℃，11000rpm离心15min。
6)用枪小心吸走液体，留沉淀在管底，加入1ml 75％的乙醇，在振荡器上震荡5s，洗涤沉淀一次。
7)4℃，8000rpm离心5min。
8)将上清小心去掉，干燥沉淀10min，加入适量的水溶解沉淀10min。
9)检测RNA浓度，鉴定RNA的产量和纯度。
3、QPCR检测
1)引物设计
根据RP11-533E19.7和GADPH的基因序列设计引物，具体引物序列如下：
RP11-533E19.7基因：
正向引物为5’-GACACATAACCTTATTCCT-3’(SEQ ID NO.1)；
反向引物为5’-ACTTGTTCATTTCTCACT-3’(SEQ ID NO.2)。
GAPDH基因：
正向引物为5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.3)；
反向引物为5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.4)。
2)逆转录反应
采用FastQμant cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR106)进行lncRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Bμffer 2.0μl，总RNA 1μg，加Rnase Free ddH2O使总体积至10μl，水浴锅中42℃加热3min，再将10×Fast RT Bμffer 2.0μl，RT EnzymeMix 1.0μl，FQ-RT Primer Mix 2.0μl，RNase Free ddH2O 5.0μl，混合后加入上述试管中一起混合共20μl，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min。
3)QPCR扩增检验
用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)，进行扩增，实验操作按产品说明书进行。
采用20μl反应体系：2×SuperReal PreMix Plus 10μl，正反向引物(10μM)各0.6μl，5×ROX Reference Dye△2μl，DNA模板2μl，灭菌蒸馏水4.8μl。每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。
扩增程序为：95°15min，(95℃10s，55℃30s，72℃32s)×40个循环。
4)cDNA模板浓度的筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度(10、100、1000、10000、100000倍)稀释，稀释后样品各取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行融解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行模板浓度的筛选。
根据溶解曲线，可以看出，当cDNA的进行10倍稀释时，PCR的扩增效率较高，溶解曲线单峰比较好。
5)样品Real Time PCR检测
将各样品cDNA 10倍稀释后取2μl作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增。同时在60-95℃进行溶解曲线分析，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，2-ΔΔCT法进行相对定量。
4、结果
QPCR结果显示，以RP11-533E19.7在对照组(癌旁组织)中的表达量作为基准定为1，与癌旁组织相比，RP11-533E19.7在肝细胞癌组织中表达上调(6.59±0.9875)，差异具有统计学意义(P＝0.0102，*)。
具体表达情况如表1所示，呈现RP11-533E19.7显著上调的样本有26例，其中癌组织样本有22例，癌旁组织样本有4例。说明RP11-533E19.7应用于肝细胞癌的诊断具有较高的特异性和敏感性。
表1基因在疾病中的阳性情况表
Figure BDA0002529821970000101
实施例2 RP11-533E19.7的诊断效能的检测
1、数据收集
从TCGA数据库中下载lncRNA的表达谱数据，其中包括371例肝癌组织和50例癌旁组织。
2、ROC曲线分析
使用R语言中的pROC包分析lncRNA RP11-533E19.7的受试者工作特征，计算二项精确置信空间，绘制ROC曲线。
3、结果
ROC分析结果如图1所示，从图中可以看出，RP11-533E19.7作为检测变量具有较高的曲线下面积(AUC＝0.94)，说明使用RP11-533E19.7进行肝细胞癌的诊断具有较高的敏感性和特异性。
实施例3 RP11-533E19.7的功能验证
1、细胞培养
人肝癌细胞系HepG2购于上海细胞库，细胞系均以含10％胎牛血清和1％P/S的培养基DMEM在37℃、5％CO2的培养箱中培养。每天观察细胞生长情况，隔天换液。
2、转染
2.1siRNA的合成
由上海吉码制药技术有限公司设计并合成针对RP11-533E19.7的干扰siRNA-RP11-533E19.7，对照为通用的siRNA-NC。其中，干扰siRNA-RP11-533E19.7的序列如下所示：
正义链为5’-UUUGUACACCCUCAACAAGUG-3’(SEQ ID NO.5)；
反义链为5’-CUUGUUGAGGGUGUACAAAAU-3’(SEQ ID NO.6)。
2.2转染
将实验分为3组，分别为对照组(HepG2)、阴性对照组(siRNA-NC)和实验组(siRNA-RP11-533E19.7)。按照Invitrogen公司的lipofectamine 2000转染试剂说明书进行转染。具体步骤如下：
1)将肝癌细胞系HepG2加入含10％胎牛血清的DMEM培养基并置于37℃、5％CO2的培养箱中培养。当细胞生长融合至80-90％的时，用PBS清洗3遍以去除细胞瓶中的血清成分，然后加入1-2mL的含0.25％的胰酶0.02％EDTA的消化液，当细胞变为单个细胞时加入1mL的完全培养基终止消化。
2)将细胞转移至离心管内，放入常温离心机，1000g/min离心5min收集细胞沉淀，用完全培养基将细胞重悬为1×105/mL，吸取500μL接种于24孔板内，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜。
3)在OPTI-MEM培养液中加入Lipofectamine 2000，室温孵育5min。
4)在OPTI-MEM培养液中加入siRNA混合均匀。
5)将稀释好的3)和4)混合均匀，室温放置20min。
6)将混合液加入到无血清培养基培养细胞的24孔板中，轻轻晃动混匀，放入37℃、5％CO2的培养箱中培养6h后将细胞培养液更换为新鲜的完全培养基继续培养。
3、QPCR检测细胞中RP11-533E19.7的表达水平
各组细胞转染培养48h后，使用Trizol法提取细胞总RNA，按照实施例1中的方法进行逆转录以及实时定量PCR检测。
4、CCK-8法检测细胞增殖能力
1)各组细胞转染后24h，用PBS清洗3次去除细胞内的血清成分，然后用胰蛋白酶将细胞充分消化，1000rpm离心5min收集细胞，弃去上清液并用1ml含10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，细胞计数板对细胞进行计数。
2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基将细胞稀释至1×104/mL，然后向96孔板的每孔加入200μL细胞(每种细胞接种5个复孔)。
3)在96孔板四周未铺细胞的其他孔中加入200μL的PBS。
4)将接种好肿瘤细胞的96孔板放至37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养72h后加入10μL CCK-8，放入培养箱内孵育1h。
5)将培养板取出，用酶标仪测量450nm波长的吸光度。
5、细胞迁移实验
1)各组细胞转染后24h，用PBS清洗3次去除细胞内的血清成分，然后用胰蛋白酶消化细胞，将细胞悬液转移至15mL离心管内，然后放入室温离心机内，1000rpm离心5min收集细胞。弃去上清然后用1ml不含胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，用细胞计数板对细胞进行计数。用不含胎牛血清的DMEM培养基将细胞稀释至1×106/mL，吸取1×105个细胞滴加入Transwell小室的上室。
2)向Transwell小室的下室加入600μL含10％血清的完全培养基，然后将上室放入孔板内，置于37℃、5％CO2的细胞培养箱内培养24h。
3)取出小室，轻轻弃去小室内的培养基，用PBS清洗2遍后放入75％的乙醇固定液中中固定15min。
4)用棉签将Transwell上室内细胞轻轻擦去，然后将小室置于结晶紫中染色15min。
5)取出小室，用PBS清洗3-5次去除多余细胞染液，然后在显微镜下进行观察。
6、细胞侵袭实验
将基质胶用无血清培养基1:20稀释，取100μL铺于小室内，4℃孵育过夜。剩余步骤同细胞迁移实验。
7、统计学分析
所有数据均为三次独立实验获得，按照Mean士SD显示。组间差异使用配对样本t检验分析，p<0.05时表示差异具有统计学差异。
8、结果
1)转染结果显示，以RP11-533E19.7在对照组中(HepG2)的表达量作为基准定为1，转染结果显示，相比对照组，实验组在转染siRNA-RP11-533E19.7后，RP11-533E19.7的表达水平(0.18±0.07)显著下调(对照组vs实验组，P值＝0.0024，**)，而转染siRNA-NC的阴性对照中的RP11-533E19.7的表达水平(0.96±0.02517)则无显著变化(对照组vs阴性对照组，P值＝0.2529，ns)
2)细胞增殖实验结果如图2所示，相比阴性对照组的细胞增殖活性，实验组的细胞增殖活性显著降低(阴性对照组vs实验组，P＝0.0001，***)，说明RP11-533E19.7影响肝癌细胞的增殖，提示RP11-533E19.7可作为分子靶标应用于肝癌的治疗。
3)细胞迁移和侵袭实验结果如图3所示，相比迁移实验的阴性对照组，迁移实验的实验组的细胞穿膜数显著降低，差异具有统计学意义(阴性对照组vs实验组，P＝0.0109，*)，说明降低RP11-533E19.7的表达水平可以降低细胞的迁移能力，提示RP11-533E19.7可应用于肝癌转移的治疗；相比侵袭实验的阴性对照组，侵袭实验的实验组的细胞穿膜数显著降低，差异具有统计学意义(阴性对照组vs实验组，P＝0.0047，**)，说明降低RP11-533E19.7的表达水平可以降低细胞的侵袭能力，提示RP11-533E19.7可应用于肝癌浸润的治疗。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 山东第一医科大学第二附属医院
山东第一医科大学（山东省医学科学院）
<120> 一种用于肿瘤诊断和治疗的lncRNA标志物
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacacataac cttattcct 19
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acttgttcat ttctcact 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aatcccatca ccatcttcca g 21
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagccccagc cttctccat 19
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
uuuguacacc cucaacaagu g 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cuuguugagg guguacaaaa u 21

Claims (10)

1.检测RP11-533E19.7的试剂在制备诊断肝癌的产品中的应用。
2.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测RP11-533E19.7表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，通过反转录PCR检测RP11-533E19.7表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-533E19.7的引物，通过实时定量PCR检测RP11-533E19.7表达水平的试剂至少包括一对特异性扩增RP11-533E19.7的引物，通过原位杂交检测RP11-533E19.7表达水平的试剂包括特异性识别RP11-533E19.7的探针，通过芯片技术检测RP11-533E19.7表达水平的试剂包括特异性识别RP11-533E19.7的探针；优选的，通过实时定量PCR检测RP11-533E19.7表达水平的特异性扩增RP11-533E19.7的引物序列如SEQID NO.1～2所示。
4.一种诊断肝癌的产品，其特征在于，所述产品包括检测RP11-533E19.7表达水平的试剂。
5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒，优选的，芯片中检测RP11-533E19.7表达水平的试剂包括特异性识别RP11-533E19.7基因的探针；试剂盒中检测RP11-533E19.7表达水平的试剂包括特异性扩增RP11-533E19.7基因的引物或特异性识别RP11-533E19.7基因的探针。
6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于，特异性扩增RP11-533E19.7基因的引物序列如SEQ ID NO.1～2所示。
7.RP11-533E19.7在制备治疗肝癌、或抑制或降低肝癌细胞生长、增殖、迁移的药物组合物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，其特征在于，所述药物组合物包括特异性抑制RP11-533E19.7的分子，优选的，所述分子选自核酸分子、脂类、小分子化学药、核酸构建体；优选的，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、dsRNA、siRNA或shRNA；优选的，所述核酸分子为siRNA；优选的，siRNA的序列如SEQ ID NO.5～6所示。
9.一种治疗肝癌、或抑制或降低肝癌细胞生长、增殖、迁移的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括特异性抑制RP11-533E19.7的分子，优选的，所述分子选自核酸分子、脂类、小分子化学药、核酸构建体、细胞、慢病毒；优选的，所述核酸分子选自：反义寡核苷酸、dsRNA、siRNA或shRNA；优选的，所述核酸分子为siRNA；优选的，siRNA的序列如SEQ IDNO.5～6所示。
10.根据权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含任选的药学上可接受的载体或赋形剂。
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