CN111808886A - 用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法 - Google Patents

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Abstract

用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法，该被引剂为核酸或核酸类似物，该方法包括在聚六亚甲基双胍(PHMB)的存在下在盐的存在下将细胞暴露于该核酸或该核酸类似物的步骤，其中该核酸或该核酸类似物和该PHMB是纳米颗粒形式的复合物的形式；其中该被引剂包括多肽、肽、小分子药物、生物活性试剂或细胞成像探针/造影剂。

Description

用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法
本申请是分案申请，其原申请的国际申请号为PCT/GB2012/052526，国际申请日是2012年10月11日，中国国家申请号为201280050149.X，进入中国的日期为2014年04月11日，发明名称为“方法”。
本发明涉及用于促进试剂(agent)(例如核酸)进入细胞的方法和反应试剂(reagent)的领域。
核酸和其类似物在基础研究以及预防性和治疗性干预中有许多应用。然而，原核和真核细胞对于核酸/类似物通常是不可渗透的。通常核酸/类似物的摄取需要病毒或非病毒递送载体，以激发它们的潜能(potential)。为了进行得有效，递送载体/核酸或类似物的组合或复合必须克服许多挑战，例如细胞外降解、细胞膜屏障的穿透(cell membranebarrier penetration) 和胞内释放，同时使细胞毒性和抗原性最小化。许多原本很有用的多肽(例如蛋白质、肽)和其它生物活性分子也是细胞不可渗透的。例如许多化合物的活性在生化分析中比在细胞分析或活体内的活性要高。细胞活性的下降被认为是主要是由于向细胞内的递送不良。
脂质转染胺(lipofectamine)是广泛使用的用于促进试剂(例如核酸) 进入细胞的试剂的实例。然而，脂质转染胺被认为对特别是哺乳动物细胞有毒性作用，这可以例如使体外实验难以评价且活体内实验难以执行。
其它被提出的促入剂(entry-promoting agent)描述在例如WO 2009/015143(Biodegradable cationic polymer gene transfer compositions and methods ofuse)；WO 02/22174(作为生物相容性基因递送剂的阳离子脂质聚合物(cationiclipopolymer as biocompatible gene delivery agent))； WO2010/086406(非病毒转染剂)；US 5,958,894(两亲性双胍衍生物)中。
需要替代性的促进进入的试剂(促入剂)，用于例如核酸和其它物质，当活性受限于较差的细胞进入时。本发明识别出了促进进入的试剂和方法。这样的促进进入的试剂和方法被认为是有益于例如为特别是真核细胞提供良好的进入促进、较弱的抗原性、低成本和/或低毒性。这样的促进进入的试剂和方法可能例如在诸如以下等领域是有用的：核酸/类似物的转染，例如功能的研究；稳定细胞系的产生；基因沉默；和DNA疫苗。如本领域普通技术人员将容易理解的，这样的促入剂和方法可能在相关的RNA干扰(RNAi)或其它反义技术中是有用的。递送反应试剂或药物至细胞中的的挑战并不仅仅局限于核酸。蛋白质和肽通常也很难进入细胞，促入技术也是有用的。而且，许多被描述为小于1000克/摩尔的小分子也难以进入细胞，而通过改进的细胞递送技术将会提高它们作为试剂或药物的效用。
PHMB(聚六亚甲基双胍)是已知的作为安全有效的杀生物剂(biocidal agent)，并被用作消毒剂(sanitiser)和防腐剂：US7897553、US 4758595、 US2008261841；US20040009144。本申请的发明者已经出人意料地发现 PHMB和相关的分子是有用的促入剂。出人意料地观察到PHMB(举例) 本身进入多种细胞，包括细菌、真菌和哺乳动物细胞。更出人意料地是， PHMB(举例)能够与多种分子形成纳米颗粒并将这些分子递送至这些细胞内。最后发现所递送的从核酸至小分子的分子在细胞内是能发挥作用的。
在本说明书中明显的先前出版的文献的列出或论述不一定被认为是承认该文献是现有技术状态的部分或是公知常识。
本发明的第一方面提供了用于促进试剂进入细胞的方法，所述方法包括在聚合物的存在下将所述细胞暴露于被引剂(introduced agent)的步骤，其中所述聚合物包括线型和/或支化聚单胍/聚胍、聚双胍、其类似物或衍生物，例如根据下述式1a或式1b所示，在表1和表2中给出了实例，如下：
式1a
Figure BDA0002462095410000021
式1b
Figure BDA0002462095410000022
其中：
“n”指所述聚合物中的重复单元的数目，且n可以从2至1000、例如从2或5至10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、 250、300、350、400、450、500、600、700、800或900；
G1和G2独立地表示包括双胍或胍的阳离子基团，其中L1和L2直接连接到所述胍的N原子。因此，所述双胍或胍基团是构成所述聚合物骨架所必需的。所述双胍或胍基团不是式1a的侧链部分。
阳离子基团的实例：
双胍
Figure BDA0002462095410000031
(如在PHMB中)
或
胍
Figure BDA0002462095410000032
(如在PHMG中)
在本发明中，L1和L2是所述聚合物中的G1和G2阳离子基团之间的连接基团。L1和L2可以独立地表示包含C1-C140碳原子的脂肪族基团，例如烷基基团，诸如：亚甲基、乙烯、丙烯、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10； C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、 -C130或-C140烷基；或L1和L2可以(独立地)是C1-C140(例如，C1、C2、 C3、C4、C5、C-6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、 -C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)脂环族、杂环、芳香族、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基，或L1和L2可以(独立地) 是聚亚烷基，所述聚亚烷基可选地由一个或多个的优选为一个的氧、氮或硫原子、官能团以及饱和或不饱和的环部分中断。合适的L1和L2的实例是表1中列出的基团。
L1、L2、G1和G2可以使用脂肪族基、脂环族基、杂环基、芳基、烷基芳基、和氧化烯基进行改性。
N和G3优选为端基。通常在本发明所使用的所述聚合物具有末端氨基(N)和氰基胍(G3)或胍(G3)端基。这样的末端基团可以(用例如 1,6-二氨基己烷、1,6二(氰基胍基)己烷、1,6-二胍基己烷、4-胍基丁酸) 通过连接到脂肪族基、脂环族杂环基、杂环基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基来改性。此外，端基可以通过连接到受体配体、葡聚糖、环糊精、脂肪酸或脂肪酸衍生物、胆固醇和胆固醇衍生物或聚乙二醇(PEG) 来改性。可选地，所述聚合物可以用胍或双胍或氰胺或胺或氰基胍在N和 G3位置，或氰胺在N且氰基胍在G3位置，或胍在N和氰基胍在G3位置，或L1胺在G3且氰基胍在N上终止。G3可以是L1-胺、L2-氰基胍或L2-胍。根据聚合(n)的数目或聚合物链的断裂和在合成过程中的副反应，端基的不均一(heterogeneous)混合物可以如以上所描述的作为实例出现。因此， N和G3基团可以是互换的(interchanged)/表现为不均一的混合物，如以上所指出的。或者N和G3可以是不存在的，且所述聚合物是环状的，在这种情况中，各自的末端L1和G2彼此直接连接。
在式1b中，X可以是存在或不存在的。L3、L4和X是如上针对“L1或L2”所提到的。因此，L3和L4和X是所述聚合物中的G4和G5阳离子基团之间的连接基团。L3和L4和X可以独立地表示含有C1-C140碳原子的脂肪族基团，例如烷基基团，诸如：亚甲基、亚乙基、亚丙基、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、-C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、 -C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140烷基；或L3和L4和X可以独立地是C1-C140(例如，C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9或C10；C1-C10、 -C20、-C30、-C40、-C50、-C60、-C70、-C80、-C90、-C100、-C110、-C120、-C130或-C140)、脂环族基、杂环基、芳香族基、芳基、烷基芳基、芳基烷基、氧化烯基，或L3和L4和X可以(独立地)是聚亚烷基，所述聚亚烷基可选地由一个或多个(优选为一个)氧、氮或硫原子、官能团以及饱和或不饱和的环部分中断。合适的L3和L4的实例是表2中列出的基团。
“G4”和“G5”是阳离子部分且可以是相同或不同的。它们中的至少一个是双胍部分或氨基甲酰基胍，且另一个可以是如上的(双胍或氨基甲酰基胍)或胺。为了避免疑义，在式1b中，阳离子部分G4和G5不包含仅单个的胍基团。例如，G4和G5通常不包含单个的胍基团。这样的化合物的实例为聚烯丙基双胍、聚(烯丙基双胍基-共-烯丙胺) (poly(allylbiguanidnio-co-allylamine))、聚(烯丙基氨基甲酰基胍基-共-烯丙胺)(poly(allylbiguanidnio-co-allylamine))、聚乙烯基双胍，如表2中所列出的。
聚烯丙基双胍的实例如下所示：
Figure BDA0002462095410000041
在聚烯丙基双胍的情况中L3和L4是相同的，G4和G5是类似的，因此聚烯丙基双胍可以简化为如下所示。
Figure BDA0002462095410000051
聚(烯丙基氨基甲酰基胍基-共-烯丙胺)的实例如下所示：
Figure BDA0002462095410000052
用于在本发明中使用的聚合物将通常具有与它们相关联的反荷离子(counterions)。合适的反荷离子包括但不限于以下：卤化物(例如氯化物)、磷酸盐、乳酸盐、膦酸盐、磺酸盐、氨基羧酸盐、羧酸盐、羟基羧酸盐、有机磷酸盐(organophosphate)、有机膦酸盐、有机磺酸盐和有机硫酸盐 (organosuflate)。
用于在本发明中使用的聚合物可以是不同的“n”数字的聚合物不均一的混合物或包含特定的“n”数字的通过标准纯化方法所纯化的均一的片段。如上所指示的，所述聚合物也可以是环状的且另外可以是支化的。
用于“n”的优选的数字包括2-250、2-100、2-80和2-50。
表1.源于式1a的聚合物类似物的实例
Figure BDA0002462095410000053
Figure BDA0002462095410000061
Figure BDA0002462095410000071
源于式1a的示例化合物的CAS号
Figure BDA0002462095410000072
表2.源于式1b的聚合物类似物的实例
Figure BDA0002462095410000073
本发明的方法中所使用的促入剂可以包含线型、支化或树枝状的分子。所述促入剂可以包含线型、支化或树枝状的分子的组合。所述促入剂可以包含一种式1a或式1b分子或任意的式1a或式1b分子的组合，例如如上所描述的。
例如，所述促入剂可以包含以下物质中的一种或多种：聚六亚甲基双胍(PHMB)、聚六亚甲基单胍(PHMG)、聚亚乙基双胍(PEB)、聚四亚甲基双胍(PTMB)或聚亚乙基六亚甲基双胍(PEHMB)。一些实例在表1 和表2中列出。
因此，所述促入剂可以包含以下物质中的一种或多种组成的均一或非均一的混合物：聚六亚甲基双胍(PHMB)、聚六亚甲基单胍(PHMG)、聚亚乙基双胍(PEB)、聚四亚甲基双胍(PTMB)、聚亚乙基六亚甲基双胍 (PEHMB)、聚亚甲基双胍(PMB)、聚(烯丙基双胍基-共-烯丙胺)、聚 (N-乙烯基双胍)、聚烯丙基双胍。
所述化合物可以通过标准程序在实验室中合成或可以获得自商业供应商，如本领域技术人员所公知的。
例如PHMB还可以具有异名：聚(六亚甲基)双胍盐酸盐；聚合的双胍盐酸盐；聚己缩胍；双胍；CAS号27083-27-8；32289-58-0；IUPAC名称聚(亚氨基酰亚胺基羰基)亚氨基六亚甲基盐酸盐。
PHMB可以通过标准程序在实验室中合成或可以获得自供应商，例如Arch(http:// www.archchemicals.com/Fed/BIO/Products/phmb.htm)。通常n＝2 至40，n平均为：11，平均分子量：3025。PHMB作为杀虫剂销售，例如用于在卫生用品、游泳池水处理和伤口敷料。
聚六亚甲基单胍(PHMG)可以通过标准程序在实验室中合成或获得自供应商，例如获得自上海山的实业有限公司，http://scunder.en.busytrade.com/products/info/ 683633/PHMG.html。
如本领域技术人员将理解的，所述促进进入聚合物可以是共聚物或异聚物(heteropolymer)，即所述单体可以不是相同的。然而，通常所述单体单元可以是相同的。
本发明中的所述促进进入的聚合物可以用于递送至原核和真核细胞。因此，所述细胞可以是原核细胞。这样的细胞的实例包括革兰氏阴性菌；革兰氏阳性菌；和分枝杆菌或抗酸细菌(acid fast bacteria),例如耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)。革兰氏阴性菌的实例包括大肠杆菌、肠道沙门氏菌(S.enterica)，例如鼠伤寒沙门氏菌(S.entericia serovar Typhimurium)、沙门氏菌属(Salmonella spp)和弯曲杆菌属(Campylobacter spp)。革兰氏阳性菌的实例包括金黄色葡萄球菌。
所述细胞可以可替换地为真核细胞，例如，真菌细胞，例如曲霉菌、例如烟曲霉菌；念珠菌属(Candida spp)；酵母菌属(Saccharomyces spp)；毕赤酵母属(Pichia spp)。所述细胞可以是哺乳动物细胞(其可以是细胞培养中的细胞或存在于组织或器官的细胞)。所述细胞例如可以是人类、小鼠、大鼠、兔子、牛或狗(或例如任何其他野生、家畜/家养动物)细胞。所述细胞例如可以是稳定细胞系细胞、原代细胞(primary cell)、贴壁细胞 (adherentcell)或悬浮细胞。作为实例，所述细胞可以是巨噬细胞、骨肉瘤或海拉细胞系细胞或小鼠原代细胞。
所述真核细胞可以可替换地为植物细胞(例如单子叶或双子叶(dicotyledenous)植物细胞)，通常实验的、庄稼和/或观赏植物细胞，例如拟南芥属(Arabidopsis)、玉米)；鱼(例如斑马鱼；鲑鱼(salmon))、鸟(例如鸡或其它家养的鸟)、昆虫(例如果蝇；蜜蜂)、线虫类(Nematoidia) 或原生生物(例如疟原虫(Plasmodium spp)或阿米巴原虫(Acantamoeba spp))细胞。
被引剂可以通常是或包含具有较差的细胞摄取性能的生物活性化合物、例如药学上的活性物质、或诊断/成像工具或探针。被引剂可以包括核酸或核酸类似物。所述核酸或核酸类似物例如可以是或包含DNA或RNA 或DNA和RNA。所述核酸或核酸类似物可以通常是反义核碱基寡聚物、或有义核碱基寡聚物(sense nucleobase oligomer)(例如编码多肽或结构或调控的核酸)。所述核碱基寡聚物可以是保持碱基配对的能力的任意类型的核酸类似物或模拟物(mimic)，如本领域技术人员所公知的。例如，所述核酸/似物或核碱基寡聚物可以是硫代磷酸酯(phosphorothioate)、2’O-甲基核酸、锁核酸、肽核酸(PNA)寡聚物。或者，所述核酸/类似物或核酸寡聚物可以是例如硫代磷酸酯、吗啉基寡聚物((PMO)。本领域技术人员将容易地能够确定给定的核碱基寡聚物在化学上(chemistry)与保留特定地结合到目标核酸的能力的核碱基是否是可兼容的，例如充当探针、指导多肽/核酸表达或介导基因沉默(例如通过反义或RNAi，如本领域技术人员所公知的)。本领域技术人员将容易地能够确定给定的核碱基寡聚物在化学上(chemistry)与所述促入剂的进入的促进是否是可兼容的：认为如以上所阐述的促入剂通常对核酸/类似物/核碱基寡聚物是有用的。
PNA和吗啉基寡聚物通常具有不带电荷的(而不是阴离子的)骨架。先前在PNA递送中存在较小的成功。对DNA和RNA起作用的许多策略对通常不带电荷的PNA和吗啉基寡聚物是不起作用的。我们出人意料地发现本发明的促入剂对这些分子是起作用的。
所述核酸/类似物/核碱基寡聚物可以是单链的或双链的。所述核碱基寡聚物可以能够在引导多肽/核酸表达时充当探针，或充当RNAi分子，例如小干扰RNA(siRNA)或微小RNA(microRNA)，充当适配子(aptamer) 或配体，如本领域技术人员所公知的。通常所述核酸/类似物/核碱基寡聚物可以是单链的，特别是当所述细胞是原核细胞时。当所述细胞是真核细胞 (例如当所述细胞是酵母或其它真菌)时，所述核碱基寡聚物可以通常是单链或双链的，其可以包括单链和双链区的混合物。
所述核碱基寡聚物可以是通过序列特定的碱基配对到互补DNA和/ 或RNA序列进行杂交的任意分子。在本发明的上下文中，“杂交”是指氢键，所述氢键可以是互补核苷或核苷酸碱基之间的Watson-Crick、Hoogsteen 或反向的Hoogsteen氢键。例如腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过氢键的形成而配对的互补核碱基。
核碱基寡聚物(例如反义核碱基寡聚物)的进一步相关的特征，将是本领域技术人员公知的，且在例如WO 02/079467(在此通过引用并入)中进行了阐述：第2页，第1-34行(反义RNA调控；PNA制备，用作反义化合物；细胞摄取)；第6页，第14-34行(杂交到目标序列)；第8页， 1-25行(核碱基寡聚物的类型)；第8页第27行至第14页第2行(反义化合物的长度；关于核碱基寡聚物类型的更多的类型)；第15页第29行至第16页第2行(细胞摄取)；第16页第28行至第17页第6行(合成)；第18页第33行至第19页第6行(PNA和肽之间的连接基团(linker))。
所述核碱基寡聚物可以包括例如硫代磷酸酯、2'O-甲基、2'-氟、锁核酸(LNA)、吗啉基、PNA或脱氧核苷酸。
参见，例如：
硫代磷酸酯
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1772569
LNA
http://www.pnas.org/content/97/10/5633.short
PNA
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed？term＝Progress％20in％20Developing％20PNA％20as％20a％20Gene-Targeted％20Drug
吗啉基
http://www.liebertonline.com/doi/abs/10.1089/oli.1.1997.7.187
被引剂可以包含质粒或其它载体DNA(其可以是改性的DNA)，如本领域技术人员所公知的。通常质粒或载体DNA可以编码和/或适于表达(或例如通过编码当其被表达时会激活内源基因的表达的细胞因子来促进内源基因的表达)多肽或感兴趣的核酸。或者，被引剂可以包含RNA(其可以是改性的RNA，例如如以上所论述的)分子，例如所述被引剂可以包含siRNA分子，即能够介导RNA干扰的分子，如本领域技术人员所公知的。
成功地转化细胞或转染细胞，即包含如上所述的DNA构建体 (construct)的细胞，可以通过公知的技术进行识别。例如，一种选择技术涉及将在所述转化细胞中编码可选择的特征的DNA序列(标志物)并入到所述表达载体中。这些标志物包括用于真核细胞培养的二氢叶酸还原酶、G418或新霉素抗性(resistance)，和用于在大肠杆菌和其它细菌中进行培养的四环素、卡那霉素(kanamycin)或氨苄西林抗性基因。或者，用于这样的可选择的特征的基因可以在用于共转化所需的宿主细胞的另外的载体上。
所述标记物基因可以用于识别转化体(transformants)，但理想的是确定哪些细胞包含重组DNA分子且哪些包含自连接(self-ligated)载体分子。这可以通过使用克隆载体来实现，在所述克隆载体中，DNA片段的插入破坏存在于所述分子上的一种基因的完整性。由于该基因功能的缺失，因此可以识别重组体。
成功地转化细胞，即包含如上所提到的DNA构建体的细胞，可以通过公知的技术来识别。例如，识别成功地转化细胞的另外的方法涉及使自引入如上所提到的表达构建体所得到的细胞生长，所述细胞可以生长而产生编码的多肽。可以获得并溶解细胞，且利用诸如Southern(1975)J.Mol. Biol.98,503或Beren等(1985)Biotech.3,208中描述的方法，针对存在 DNA检查了所述细胞的DNA含量。或者利用本领域技术人员所公知的抗体可以检测上清液中蛋白质的存在。
除了直接地分析重组DNA的存在度外，当所述重组DNA能够指导所述蛋白质的表达时，通过公知的表型分析(例如免疫方法)可以确定成功的转化。例如，用表达载体所成功地转化或转染的细胞产生显示适当的抗原性的蛋白质。利用合适的抗体，针对所述蛋白质获得并分析疑似被转化或转染的细胞样品。
用于确定反应试剂是否被细胞摄取的方法将也是本领域技术人员所公知的，例如，在概念上与以上所描述的那些类似的方法；所述引入的反义试剂可以导致内源基因功能或表达的减少。
被引剂可以包括多肽(该术语包括可以被称为肽的例如长度为小于50 个氨基酸、通常长度为10-20个氨基酸残基的较小的多肽或较大多肽的片段；以及包括可以称为蛋白质的长度超过50个氨基酸的更大或全长的多肽)。http://en.wikipedia.org/wiki/Peptide。术语多肽将包括拟肽类 (peptidomimetic)化合物，如本领域技术人员所公知的。拟肽类化合物的一个实例在Sherman and Spatola,J.Am.Chem.Soc.,112:433(1990)中进行了论述。所述多肽可以是治疗性多肽，例如取代缺失/失去和/或有缺陷的多肽的功能的多肽；或可以是抗原性多肽，例如将要用作疫苗或充当结合到另外的蛋白质或肽的配体。例如，所述多肽可以是细胞蛋白质的激动剂 (agonist)或拮抗剂。所述递送的肽或蛋白质可以通过在细胞中抑制或促进酶的功能来建立细胞中酶的作用的理解或在所述细胞中或所述细胞为其一部分的组织、器官或主体中具有治疗性或其它有用的效果。
用于确定多肽是否已经被细胞摄取的方法将也是本领域技术人员所公知的。例如，所述蛋白质可以具有荧光性能，诸如利用荧光显微镜、流式细胞仪(flow cytometry)和类似的方法能够观察和监测到的绿色荧光蛋白(GFP)。而且，利用抗体介导的染色可以对摄取进行评估。最后，根据所述蛋白质的已知功能，可以利用多样的功能研究。例如，如果所述蛋白是转录因子，通过所述因子所调控的基因可以被概括分析来评估表达水平的变化。或者，所述蛋白可以是激酶，且它的已知的底物的磷酸化变化可以利用磷酸化分析来测定。用于测定肽是否已经被细胞摄取的方法将也是本领域技术人员所公知的。例如可以利用例如荧光素对所述肽进行荧光标记，利用荧光显微镜、流式细胞仪或类似的方法可以观察和监测到所述荧光素。而且，利用抗体介导染色对摄取进行评估。最后，根据蛋白质和肽的已知的功能，可以利用多样的功能研究。或者，如果所述肽是配体，可以评估与受体相互作用的肽的下游效应(downstream effects)。最后，许多肽和蛋白质是产生免疫性的，且在递送之后的免疫功能效果可以利用分子的和细胞的免疫学者和本领域其它技术人员所公知的方法来评估。
被引剂可以包括小分子药物或生物活性试剂，例如具有小于1000或 2000Da的分子量。所述小分子药物或生物活性试剂在本发明的促入剂不存在的情况下可以具有较差的细胞摄取或稳定性性能。实例是庆大霉素，庆大霉素是有用的抗体，但是不容易进入宿主细胞。第二个实例是两性霉素B。带负电荷的或高疏水的分子可以是受益于本发明的递送技术的被引剂。
用于确定小分子是否已经被细胞摄取的方法也将是本领域技术人员所公知的。所述小分子可以具有固有的荧光性能，利用上述的方法所述荧光性能允许摄取被监测到。而且可以并入放射性同位素或使小的荧光团结合来提供荧光性能。例如，一旦结合DNA便增加荧光性的DNA配体小分子提供了用于递送的方便的分析，显示了细胞摄取和结合到目标分子。在许多情况下，小分子递送可以通过由结合到它的受体所造成的效果的功能分析来评估。例如，小分子可以是激动剂或拮抗剂，且利用本领域技术人员所公知的方法可以测定下游效果。
被引剂可以包括细胞成像探针，例如用于活体内成像的造影剂 (contrastagent)，诸如量子点(quantum dots)、超顺磁氧化铁；或受体配体，例如用于细胞内的受体，例如细胞核激素受体；或基于核酸的探针，如以上所提到的，所有这些都将是本领域技术人员所公知的。用于确定成像探针位置的方法是本领域技术人员所公知的，包括但不限于荧光成像和放射性监测。
被引剂和所述促入剂可以是共价连接的。或者，被引剂和所述促入剂可以作为制剂(formulation)提供，例如作为非共价复合物提供。可以通过以合适的比例且在合适的条件下(例如pH和盐浓度，例如如在实施例中所阐述的)混合所述促入剂和被引剂来制备所述制剂。可以用例如从相对于促入剂为100倍摩尔比的被引剂，到利用等摩尔浓度的载体和装载物分子(cargo molecule)，至相对于被引剂为1000倍摩尔比的促入剂，来执行所述方法。例如，被引剂(例如核酸，例如长度为例如10-30个碱基的寡核苷酸)和促入剂的合适的摩尔比例可以在1:0.1至1:50或1:0.5至 1:1000的范围内，例如1:1至1:10或1:5，例如约1:1.5。被引剂和促入剂的合适的重量:重量比例可以在1:0.1至1:50或1:0.5至1:1000的范围内，例如1:1至1:10或1:5，例如约1:1.5。以下进一步论述所述复合物的形成。所述促入剂和被引剂进行混合/温育(incubated)的pH可以是高pH，例如 10-13.5，如以下所进一步论述的。
本发明的第一方面的方法可以在体外(in vitro)执行。在其中本发明的方法可以是有用的情况的实例包括大规模的批量转染和实验的转染，例如用于表达有价值的蛋白质或理解基因的作用或影响所述基因或基因产品的条件。而且，所述方法可以表征微生物样品。如以上所提到的，本发明可以在例如功能性研究、稳定细胞系的产生；基因沉默；DNA疫苗；和药物递送中是有用的。
因此，本发明的进一步的方面提供了用于制造目标多肽的方法(如以上所提到的，该术语包括肽和蛋白质，所述肽和蛋白质适当地包括共价改性的多肽，例如糖基化的多肽)，所述方法包括从宿主细胞的细胞培养来制备目标多肽的步骤，其中所述宿主细胞是已经通过外源核酸分子(可以是外源核酸分子的拷贝，但其通常是不同于先前存在在所述细胞内的核酸分子)转化的宿主细胞(或它的祖细胞(progenitor)已经被转化)，以使所述细胞合成目标多肽，其中，所述转染包括在如在关于本发明的第一方面所定义的促入剂存在下，将所述宿主细胞暴露于所述外源核酸分子。
所述方法可以包括在用于合成所述目标肽的条件下培养宿主细胞的步骤，如本领域技术人员将所公知的。通常所述方法可以在体外执行，但将应当理解所述方法也可以在活体内执行，例如在植物或(非人类)动物中执行。
为了预期的目标多肽，本领域技术人员可以很容易的执行合适的宿主细胞和诸如培养条件等其它因素的选择。
本发明的第一方面的方法可以在活体内(in vivo)或先体外后体内(ex vivo)执行。例如所述方法可以在主体表面例如皮肤或黏膜上进行。所述方法可以在随后引入的或返回到对象生物体(subject organism)的细胞上进行，所述对象生物体例如为哺乳动物(例如人或家畜/宠物/实验动物)。
本发明的进一步的方面提供了如所定义的与本发明的第一方面相关的促入剂和如所定义的与本发明的第一方面相关的被引剂，用于治疗需要所述被引剂的对象。
类似地，本发明的进一步的方面提供了如所定义的与本发明的第一方面相关的促入剂和如所定义的与本发明的第一方面相关的被引剂在制造用于治疗需要所述被引剂的对象的药物中的用途。
本发明的进一步的方面提供了治疗需要如所定义的与本发明的第一方面相关的被引剂的对象的方法，所述方法包括用如所定义的与本发明的第一方面相关的促入剂和所述被引剂治疗所述对象。
所述对象可以是例如哺乳动物：例如人类或家畜/宠物/实验动物/野生动物。
关于各种疾病或条件，本领域技术人员将容易地理解本发明可以是有用的，例如用siRNA试剂或治疗性或抗原性多肽治疗可以是有用的的疾病或条件。作为实例，关于：用于治疗口腔病毒感染(oral viral infections) 的漱口液，例如普通感冒，例如使用所述促入剂和核酸抵抗有问题的病毒株；用于骨骼相关疾病的治疗，在该治疗中，所述促入剂与多肽或核酸结合并作为乳剂或混悬剂(suspension)注射入关节中以治疗关节炎；DNA 疫苗(即编码抗原性多肽的DNA或抗癌或其它疾病的疫苗，例如，类似于注入皮肤的(靶向DC)的DNA电穿孔疫苗，但反而作为局部试剂(topical agent))的递送(例如到皮肤)；例如基于核酸的治疗药物(therapeutic) 皮肤病(例如痤疮、牛皮癣)的治疗(例如局部治疗)，本发明可以是有用的。然而，本发明的许多其它用途是设想中的，例如对应于其中RNAi,、 DNA或多肽治疗药物(特别是递送至主体表面)被认为是有用的的各种情况中，如以上所提到的。
本发明进一步的方面提供了组分试剂盒(a kit of parts)或组合物，所述组分试剂盒或组合物包含如在关于本发明的第一方面中所定义的促入剂和被引剂。所述组分试剂盒可以预期包含或组合物可以包含相对于促入剂为100倍摩尔比的被引剂，经由等摩尔浓度的载体和装载物分子，至相对于被引剂达1000倍摩尔比的促入剂。例如，被引剂(例如核酸，例如长度为例如10-30个碱基的寡核苷酸)和促入剂的合适的摩尔比例可以在1:0.1 至1:50或1:0.5至1:1000的范围内，例如1:1至1:10或1:5，例如约1:1.5。被引剂和促入剂的合适的重量:重量比例可以在1:0.1至1:50或1:0.5至 1:1000的范围内，例如1:1至1:10或1:5，例如约1:1.5。所述促入剂和被引剂的优选是如以上所提出的。例如，所述被引剂可以是siRNA分子。以下进一步论述所述复合物的形成。所述促入剂和所述被引剂进行混合/温育的pH可以是高pH，例如10-13.5，如以下所进一步论述的。
本发明的进一步的方面提供了本发明的组分试剂盒或组合物，其中，所述组分试剂盒或组合物是药学上可接受的。因此，成套组分或组合物可以包含(或由…组成)药学上可接受的成分，如本领域技术人员将所公知的。本发明的促入剂被认为是药学上可接受的。例如PHMB已经用于例如伤口敷料。
本发明进一步的方面提供了用于治疗需要所述被引剂的患者的本发明的组合物或组分试剂盒。
本发明的进一步的方面提供了用于在成像或诊断方法中使用的本发明的组合物或组分试剂盒。例如，如以上所论述的，所述被引剂可以是有助于成像或其它检测细胞内的成分的试剂，例如核酸或蛋白质。因此，所述被引剂例如可以是特定地结合至细胞内的成分的试剂。例如，所述被引剂可以是通常对特定的抗原保留特定的结合亲和性(bindingaffinity)的抗体或抗体片段，如本领域技术人员所公知的；或以所需的特异性杂交至特定的核酸序列的核酸。如将被理解的，所述成像或诊断方法通常是医学成像或诊断方法，且通常可以在所述对象上执行或可以在获得自对象的样品上执行或可以在某些其他样品上执行。例如，所述样品可以是食物或水样品或其它环境样品，如本领域技术人员将所公知的。
因此，例如，本发明的促入剂和如上所定义的被引剂，例如核酸/类似物或核碱基寡聚物可以用于细胞内分子的检测，例如通过例如原位杂交(例如其中所递送的核酸是标记有荧光团或其它可检测的分子的原位杂交)用于多肽或核酸序列的检测，。
本发明的所述组分试剂盒或组合物可以进一步包括用于接收所述被引剂的细胞。所述细胞可以是例如用于表达多肽的细胞，所述多肽的表达通过所述被引剂编码或诱导。
在一实施方案中，所述促入剂和递送的分子可以在具有高pH的缓冲液(buffer)中一起提供。因此，所述用于促进试剂进入(被引剂)到细胞中的方法可以包括在促入剂(均如上所阐述的)的存在下将所述细胞暴露于所述被引剂的步骤，其中，所述被引剂和所述促入剂已经在高pH混合或温育，例如在具有高pH的缓冲液中。术语“高pH”将是本领域技术人员所公知的且通常是指9以上的pH，例如9.5以上或10以上的pH，例如 10到13.5之间的pH。通常所述被引剂和所述促入剂在高pH进行混合以形成纳米颗粒，然后在所述促入剂存在下将所述细胞暴露于所述被引剂。
具体地，认为pH 10-13.5的范围内的缓冲液(具有或不具有附加的盐，例如通常在分子生物缓冲液中所使用的，例如PBS；NaCl；或许多其它的缓冲液)提供具有改进的转染效率的制剂(如在图34中所显示的)。得到的复合物可以在合适的生长培养基中稀释为1:1至1:1000，可以在数个时间点将均匀的复合物添加到细胞中(重复的多次转染)以实现更高的效率。所述程序包括在具有高pH的缓冲液中分开的稀释所述促入剂和所述递送的分子并混合它们以形成纳米颗粒。所述促入剂和所述被引剂的比例和浓度可以是以上关于制剂和非共价复合物的制备所论述的；和关于所述组分试剂盒所论述的。
例如，可以使用以下程序：
在例如50μl的缓冲液中稀释1-100μg的促入剂。在例如50μl的缓冲液中稀释0.01-50μg的质粒DNA。混合这两种溶液并在例如室温温育1 分钟至几个小时。然后利用公知的方法，可以将该混合物用于转染反应。添加合适体积的生长培养基至所述促入剂/递送的分子的混合物，混合并添加至在培养中生长的细胞。当所述细胞培养在从事于细胞培养的人所知的合适的条件下进行温育时，将发生转染。
本领域技术人员应当理解利用例如NaOH或KOH，可以很容易地制备高pH的缓冲液。当使用通常的复合时间例如30分钟时，这些缓冲液条件提供了改进的转染效率。因此，高pH缓冲液(和本文所阐述的促入剂)可以很容易地并入到研究者当前所使用的方案(protocols)。
本发明的进一步的方面提供了用于制备复合物的方法，所述复合物包括如以上所定义的促入剂(例如PHMB)和被引剂，所述方法包括在复合(complexation)缓冲液中温育所述促入剂和被引剂，例如在高pH，例如在10-13.5的pH。认为形成的纳米颗粒包括所述促入剂(例如PHMB)和所述被引剂，例如寡核苷酸聚合物(DNA，PNA,siRNA),蛋白质、肽和小分子。具体地，在与细胞一起使用之前，纳米颗粒的形成可以通过在合适的缓冲液中温育PHMB和如以上所描述的类似的分子与寡核苷酸、蛋白质、肽和小分子来实现。合适的温育缓冲液可以包括水、PBS和在实验室中常用的其它缓冲液。以上论述了高pH缓冲液。最佳的缓冲液可以取决于所述促入剂和所述递送的分子的具体的特性，如对本领域技术人员来说将是显而易见的。纳米颗粒的形成和细胞递送通常通过在混合所述两种成分之前在复合缓冲液中稀释配偶体分子(partner molecules)来实现。而且，混合所述两种组分通常在结合其它赋形剂或其它活性成分以及应用于细胞或在活体内使用之前进行。认为高效的纳米颗粒的形成发生在几秒或几分钟内，但所述程序可以进行几个小时。用于高效的纳米颗粒形成的合适的比例随着不同的搭档组合物而变化。例如，1-20:1(wt:wt)的PHMB:质粒 DNA提供高效的纳米颗粒的形成。以上给出了导致纳米颗粒形成的 PHMB；DNA组合(combinations)的实例。当使用不同的配偶体分子比例时，本领域技术人员能够评估纳米颗粒的形成和递送效率。可以用许多方式评估纳米颗粒的形成。例如，本领域技术人员个人将能够利用动态光散射(DLS)和显微镜方法来评估纳米颗粒的形成。
本发明的进一步的方面提供了包含促入剂(例如PHMB)和如以上所定义的被引剂的复合物，其中，通过包括在例如高pH(例如10-13.5的pH) 的复合缓冲液中温育所述促入剂和所述被引剂的方法，所述复合物是可获得的。
所述复合缓冲液可以是在每种情况下可替换地或附加地包括交联剂，例如如在图40中所阐述的，例如1,4-丁二醇缩水甘油醚等等。
现在通过参照以下非限定性的附图和实施例更详细的描述本发明。
图1.PHMB和PHMB作为抗菌剂的可能的作用机制
图2.PHMB与FITC的结合(Conjugation)
图3.摄取自由PHMB到细菌细胞。
图4.PHMB进入到各种细菌细胞。
摄取PHMB到革兰氏阴性菌和抗酸细菌中：用1μM的PHMB-FITC 处理过夜的培养物(cultures)1小时并在荧光显微镜下观察之前用DAPI 逆向地(counter)染色。PHMB已经进入到所有的细胞，如通过在FITC 滤光器(filter)下的绿色细胞的存在所显示的。
图5.PHMB-FITC进入到革兰氏阳性菌
摄取PHMB到革兰氏阳性菌细胞中：用1μM的PHMB-FITC处理金黄色葡萄球菌野生型的过夜的培养物1小时并用DAPI逆向地(counter) 染色。给定区域的所有的细胞为PHMB摄取阳性的，表明高效的细胞渗透。
图6.PHMB高效地进入真菌
用PHMB-FITC处理烟曲霉菌营养细胞。显然PHMB进入了所有的细胞中。
图7.PHMB处理的烟曲霉菌的相衬影像
相衬影像显示了真菌菌丝和PHMB进入到大多数的菌丝。真菌细胞是相对难以转染的。摄取PHMB到曲霉菌菌丝显示了该分子作为用于真菌的载体的潜在效用。
图8.PHMB进入到烟曲霉菌
图9.摄取自由的PHMB到哺乳动物细胞中
图10.PHMB快速地进入到哺乳动物细胞中
摄取自由的PHMB-FITC到J774巨噬细胞。上半部分：PHMB-FITC 摄取的荧光显微镜图像。下半部分：PHMB摄取的时程测量的共焦图像。在不到10分钟PHMB开始进入所述细胞。
图11.PHMB高效地进入到贴壁细胞以及悬浮细胞
左半部分：摄取PHMB到贴壁细胞中(HEK 293)。左半部分：摄取 PHMB到悬浮细胞中(THP-1悬浮细胞中)
图12.PHMB定位于细胞质区室
在哺乳动物细胞中，PHMB的细胞质定位：在倒置荧光显微镜下观察到用10μg/ml的PHMB-FITC处理2小时的海拉细胞，箭头指向(pointing) 所述荧光的细胞质定位。与PHMB处理过的细胞相比，在未处理过的细胞中仅存在背景荧光，在PHMB处理过的细胞中，所有细胞都是摄取阳性的。
图13.PHMB与寡核苷酸的相互作用
PHMB与核酸的相互作用的证据：左半部分显示了FAM标记的寡核苷酸的电泳迁移率。道1：寡占(Oligooly)，道2-8：增加的PHMB/寡核苷酸(oligo)摩尔比率：L2:0.02、L3:0.06、L4:0.12、L5:0.2、L6:0.4、 L7:0.8、L8:1.6。PHMB的添加导致了寡核苷酸(oligonucletoide)迁移的减速，如在道5-7中所显而易见的。在PHMB/寡核苷酸摩尔比率为0.8时，存在所述迁移的完全减速，这表明高效的核酸结合。右半部分显示了PHMB 与FAM标记的寡核苷酸的光谱学证据。PHMB的添加导致FAM荧光的猝灭，这发生在两种分子很靠近时，显示了所述相互作用。
图14.PHMB与质粒DNA的相互作用
PHMB与质粒DNA相互作用的证据：以不同的w/w比率制备PHMB/ 质粒(编码GFP)的复合物，并在37℃温育30分钟，然后流过用溴化乙锭(0.5μg/ml)染色的1％的琼脂糖凝胶。观察到PHMB的添加导致道3-5 的质粒DNA 9的迁移的减速。在2/2比率为1.5:1时观察到完全的减速。该比率用作转染实验的指导。
图15PHMB与siRNA的相互作用
PHMB与siRNA的相互作用的证据：以不同的摩尔(M/M)比率制备 PHMB/siRNA复合物。观察到PHMB的添加导致siRNA迁移的减速。在摩尔比率为20:1时观察到迁移的完全的减速。该比率用作siRNA递送的指导。
图16.PHMB类似物与核酸的相互作用
Figure 16Interaction of PHMB analogues with nucleic acids
Figure 17Interaction of polyhexamethylene guanidine(PHMG)with nucleicacids
图17.聚六亚甲基胍(PHMG)与核酸的相互作用
凝胶移位分析(Gel shift assay)显示了PHMG与核酸的相互作用。 PHMG/质粒(a)和PHMG/siRNA(b)复合物流过所琼脂糖凝胶。对于全部质粒(w/w 2.5:1)和siRNA(8:1,M/M)，观察到了完全的减速。
图18.PHMB通过非共价键络合运载PNA至细菌细胞
PHMB/PNA-FITC复合物进入到细菌。用PHMB/PNA-FITC复合物(摩尔比率11:1)处理大肠杆菌AS19和K12菌株(strais)，用DAPI进行逆向地染色并在荧光显微镜下进行观察。如所预期的，在PNA单独处理过的细菌中存在最小的摄取。在用所述PHMB/PNA复合物处理过的细胞中荧光强度的改进和阳性细胞的数目是明显的。
图19.PHMB运载寡核苷酸到烟曲霉菌(Aspergillus fumigates)
摄取PHMB/寡核苷酸至真菌。用PHMB/FAM标记的寡核苷酸复合物处理烟曲霉菌，并用DAPI进行复染。在寡核苷酸单独处理过的样品中存在最小的摄取。在PHMB/寡核苷酸复合物处理过的样品中注意到所述摄取的增加，表明寡核苷酸递送到了真菌中。
图20.寡核苷酸递送到哺乳动物细胞中
图21.PHMB运载寡核苷酸至哺乳动物细胞的细胞核中。
递送寡核苷酸至哺乳动物细胞：用PHMB/寡核苷酸复合物处理海拉细胞2小时。在用费用寡核苷酸(fee oligonucleotides)处理过的细胞中没有摄取，然而用PHMB/寡核苷酸处理过的细胞显示了增加的摄取。如箭头所指示的，所述寡核苷酸被递送到细胞核。
图22.递送编码GFP的质粒到哺乳动物细胞
图23.PHMB递送的质粒能够在海拉细胞中表达GFP
递送质粒到哺乳动物细胞。用PHMB/编码GFP的质粒处理海拉细胞。在未处理的细胞(a)或单独用DNA处理的细胞(b,500ng质粒)中没有 GFP的表达。在PHMB/质粒处理的细胞(c,2.5μg PHMB+500ng质粒) 中存在增加的GFP的表达。将脂质转染胺2000用作阳性对照(d)。
图24.PHMB递送的质粒能够在海拉细胞中表达GFP
图25.PHMB递送的质粒能够在骨肉瘤细胞中表达GFP
递送质粒到哺乳动物细胞。用PHMB/质粒(c,2.5:1,w/w)处理过的骨肉瘤细胞表达GFP。单独用质粒处理的细胞(b)或未处理的细胞(a) 中没有表达。将脂质转染胺2000用作阳性对照(d)
图26.摄取PHMG-FITC到哺乳动物细胞
PHMG的细胞渗透性能：用3μg/ml PHMG-FITC(b)处理海拉细胞。 PHMG已高效地进入到所有的细胞中，然而未处理的细胞显示了最小的背景荧光(a)。显然PHMB类似物业具有细胞渗透性能。
图27.PHMG也能够携带质粒到哺乳动物细胞
递送质粒到哺乳动物细胞。用PHMG/质粒(a,1.25:1)处理过的骨肉瘤(Osteoscarma)细胞表达GFP。这显示了用于哺乳动物细胞的PHMG 的载体潜能。将脂质转染胺2000用作阳性对照(b)
图28.递送siRNA到原代细胞并分析效果
图29.通过PHMB递送的siRNA能够在原代细胞中沉默基因。
初生脂肪细胞中Tbx基因的敲除(Knockdown)。利用脂质转染胺和 PHMB，Tbx15siRNA库(pool)用于敲除的Tbx 15mRNA。当使用PHMB 时观察到Tbx 15mRNA减少了60％。
图30.与脂质转染胺2000相比，PHMB对原代细胞具有更小的毒性
在原代细胞中载体的细胞毒性。用脂质转染胺2000和PHMB处理细胞，并在处理后观察6天。脂质转染胺和脂质转染胺+siRNA处理过的细胞两者都显示了比PHMB或PHMB/siRNA处理过的细胞的更高的细胞毒性。
图31.PHMB与FITC形成纳米颗粒
表征通过PHMB和装载物形成的颗粒。载体和装载物之间的非共价相互作用导致粒子的形成。在水中制备PHMB/自由FITC复合物，且通过动态光散射分析得到的尺寸和表面电荷。观察到PHMB单独形成平均尺寸 888.6nm的无定型聚集体，该无定型聚集体具有(0.64)的PDI和+42.8mV 表面电荷，表明是非均一群体(heterogeneous population)。PHMB/FITC复合物具有98.36nm的平均尺寸、具有0.20的PDI，表明均一总体的纳米颗粒的形成，具有正表面电荷(+12.2mV)。
图32.作为潜在的转染试剂的PHMB的类似物
图33.PHMB与FITC的结合，通过IR光谱证明
向50mg的PHMB和50μl的N,N-二异丙基乙胺在800μl去离子水的溶液中加入在100μl DMF中的2mg的FITC。在室温摇动反应混合物过夜然后冻干，产生剩余质量(residualmass)，用乙酸乙酯将该剩余质量研碎以除去过量的未反应的FITC。将得到的物质溶解在1ml的去离子水中并用50％乙醇溶液利用间歇改变(intermittent change)溶液(10次，500ml) 进行透析5天。将所述透析过的溶液冻干以获得荧光素基(fluoresceinyl) -PHMB。通过记录的IR光谱确定PHMB-FITC的结合，IR(Nujol)，ν(cm-1)： 750-760cm-1(C＝S伸缩)
图34.高pH和盐增强使用PHMB/pEGFP复合物的转染
在左侧，通过利用NaOH或HCl制备具有13.5–7pH的缓冲液(水或PBS或0.9％NaCl)来测试pH和缓冲液对复合物的形成和转染效率的影响。在100μl体积的缓冲液中通过在室温下温育20分钟制备4μgPHMB和1μg pEGFP的复合物并在生长培养基中稀释，并在12孔板中进行接种时，添加至1.5x105个海拉细胞中。通过转染后36小时测定GFP的表达而通过流式细胞仪来监测转染效率。
在右侧，为了间接评估PHMB和pEGFP之间的复合物形成速率，通过在具有pH 11.5的1X PBS中混合4μg PHMB和1μg pEGFP而准备多个复合反应，并在不同的时间点添加至如以上所论述的在12孔板中海拉细胞。通过在转染后的36小时通过流式细胞仪来测定GFP的表达。PHMB 形成在不到5分钟形成复合物，且所述反应在室温是稳定几个小时。
图35.PHMB介导红色荧光蛋白和抗体(IgG-Alexa488)递送到人类细胞(海拉)。
将3μg的PHMB与0.3μg的荧光蛋白R-藻红蛋白(左边的图)或alexa 488标记的IgG抗体(右边的图)在100μl体积的PBS中混合，并在室温静止30分钟。将得到的复合物在900μl的生长培养基中稀释，并将所述稀释了的复合物覆盖在海拉细胞上。用荧光显微镜成像温育2小时后的细胞。
图36.PHMB介导小荧光分子递送到人类细胞(海拉)
将3.5μg的PHMB与1μl的100μM小分子(SYTOX Green或FITC) 在在100μl的PBS中混合，并在室温静止30分钟。将得到的复合物用900 μl的生长培养基稀释，并将所述稀释了的混合物覆盖在海拉细胞上。用荧光显微镜成像温育2小时后的细胞。
图37.PHMB与各种装载物分子形成纳米颗粒
A.通过DLS表征纳米颗粒的形成。通过取固定量的寡核苷酸(1μl 的100μM原料(stock)和不同的PHMB浓度(1-6μg)而在100μl PBS中制备PHMB/寡核苷酸复合物，在室温下温育30分钟，在1ml的过滤后的水中稀释得到的复合物，用Zetasizer ZS nano监测平均尺寸、ζ电位(zeta potential)。如以上所描述的，通过取固定量的质粒(1μg)和不同的PHMB浓度(1-6μg)而在100μl PBS中制备PHMB/pEGFP复合物。如以上所描述的，通过取固定量的siRNA(1μl的100μM原料)和不同的PHMB浓度(1-6μg)而在100μl PBS中制备PHMB/siRNA复合物。为了计算摩尔浓度，PHMB的平均分子量取为3000道尔顿。
B.通过荧光显微镜表征纳米颗粒的形成。如以上所描述的，制备 PHMB/pEGFP复合物，用100nM的SYBR Green对质粒进行染色，且将所述复合物装载在在载玻片上制备的1％的琼脂糖层(agarose bed)上，并在使用490nm的激发(Excitation)、520nm的发射的荧光显微镜下观察。DNA 单独不显示任何颗粒，而PHMB/pEGFP复合物表现为小颗粒。
图38.PHMB与小分子制霉菌素相互作用
在左侧，PHMB与制霉菌素(10单位/ml)的相互作用，通过猝灭来指示，当以350nm激发时，通过记录的710nm的发射进行监测。
在右侧，PHMB(3mg)与利福平(20μg)的相互作用，通过降低的吸光度来指示，通过在PHMB存在的一段时间的吸光度(470nm)的猝灭进行监测。
图39.PHMB介导递送荧光团标记的DNA寡核苷酸至细菌，肠道沙门氏菌。
将6μg的PHMB与1μl的100μM的18mer的用6FAM标记的脱氧寡核苷酸在具有Ph12的100μl体积的水中混合，
并在室温下静止30分钟。所得到的复合物在400μl的PBS中稀释，添加到100μl的0.2OD的早期的对数期中的肠道沙门氏菌中，很好地混合且在37℃温育2小时并用DAPI复染，并在荧光显微镜下观察。通过流式细胞仪定量寡核苷酸的递送。
图40.支化的PHMB/PHMG介导递送表达GFP的质粒DNA到人类细胞中。
实施例1：PHMB和相关的阳离子聚合物作为载体用于递送到细菌、真菌和哺乳动物细胞中。
我们已经评估了PHMB和相关分子作为载体用于体素到原核和真核细胞。还没有出现一种技术作为实用性的基因转移方法用于临床。载体的理想的特性包括：
·它应该能够与生物分子相互作用
·自身以及在转载有生物分子时进入
·一旦进入就释放生物分子的能力
·低细胞毒性且适于活体内应用。
·瞬时转染的高转染效率是用于研究的重要特征，如低细胞毒性、和用于难以转染细胞的效率。
我们认为PHMB和相关的分子可以能够充当有效的载体。聚六亚甲基双胍(PHMB)是为广谱抗菌剂且对哺乳动物细胞具有更小的毒性的阳离子聚合物(VantocilTM Archbiocides limited,英国)。在递送试剂中，低毒性是不寻常的且是非常有益的性质，且在广泛的应用中，这些化合物的所观察到的低毒性和安全记录是该技术的特征。
n＝2to 40，Bx529 VANTOCIL 100的重均分子量(Mw)和多分散性分别是3035和1.9。这样的Mw对应约14(更精确地13.8)的“n”值。端基：胺、胍和氰基胍。聚六亚甲基单胍(PHMG)是具有抗菌性质的PHMB 的类似物(Zhou等，2010)。
PHMB的当前用途：
·用作消毒剂，手术伤口敷料的建议的选择(Stephen Gilliver2009)。
·存在于消毒剂、游泳池消毒剂、固体表面清洁剂、口腔清洗剂和隐形眼镜洗液(Lucas等,2009)
·用于处理种蛋(hatching eggs)、作为化妆品和纺织品中的除臭剂和防腐剂、和用于处理冷却系统以防止军团菌等
我们认为PHMB作为载体是有用的，该载体要么作为共价结合物 (covalentconjugate)要么作为非共价复合物，可能具有疏水和/或静电相互作用。如果是这种情况，PHMB的其它性能可以增强它的作为载体的用途。已经很好地研究了PHMB的毒性特征(toxicity profile)(Muller等, 2008；Kathryn V.Montague,2004)，
且根据在人类患者中的试验，认为PHMB是弱的过敏原(理想的性质) (Schnuch等,2007)。抗菌性能也可以有利于减少细胞培养中的污染问题。
对摄取自由的PHMB-FITC到三个领域(kingdom)进行评估：
a)细菌：
革兰氏阴性的：大肠杆菌和肠道沙门氏菌
革兰氏阳性的：金黄色葡萄球菌
抗酸的：耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)
b)真菌：烟曲霉菌
c)哺乳动物细胞：巨噬细胞、单核细胞、HEK和海拉细胞
参见图2-12，图33的PHMB与FITC的结合
PHMB与核酸在体外的相互作用的证据(对载体与装载物形成非共价键复合物并递送它至细胞是至关重要的)。
自由PHMB进入到各种细胞。PHMB与核酸相互作用。PHMB也能运载核酸和类似物吗？是的：参见图18-21，图39。
所述递送的核酸能够用于有效的功能吗？是的：参见图22-25。
PHMB类似物也具有细胞渗透性能：参见图26-27。
对原代细胞的影响：参见图28-30。
类似物：参见图31至32和40，(注意，图32中的化学式取自F.C.Krebs 等./Biomedicine&Pharmacotherapy 59(2005)438–445)。
实施例2.PHMB和相关的阳离子聚合物用于递送小分子至哺乳动物细胞的用途
我们已经显示了PHMB和相关的阳离子聚合物能够与小分子相互作用(例如，制霉菌素、利福平、姜黄素、自由FITC、SYTOX Green)并递送它们之哺乳动物细胞，例如海拉细胞。参见图31、36至38。而且，我们观察到利用PHMB/利福平复合物的协同的细菌杀伤性，所述PHMB/利福平复合物在暴露于细菌细胞前形成。
实施例3.PHMB和相关的阳离子聚合物用于递送蛋白质至哺乳动物细胞的用途
PHMB和类似物能够递送蛋白质分子(例如R-藻红蛋白或结合IgG抗体的alexa488)到诸如海拉细胞等哺乳动物细胞中，参见图35。
实施例4.PHMB与核酸分子快速地形成复合物，且高pH提高转染效率。
我们的方法显示了当载体和装载物在具有高pH(13.5-10)的缓冲液中复合时，可以实现更高的转染效率。我们测试了用于PHMB和核酸的复合物的形成所需的时间量。我们的结果显示仅仅5分钟已足够于形成能够进入哺乳动物细胞的复合物，或甚至允许所述复合物在室温下保持几小时也不会损害所述转染能力。参见图34。
实施例5：PHMB和相关的阳离子聚合物与生物活性分子形成纳米颗粒的用途
我们已经评估了PHMB和相关的分子作为形成具有一系列的生物活性分子的纳米颗粒的手段。还没有出现一种技术作为实用性的纳米颗粒形成方法用于临床。
载体的理想的特性包括：
·利用简单的程序高效的形成纳米颗粒
·对一系列的生物活性分子是有用的
·释放生物活性分子用于生物活性效果的能力
·低细胞毒性且适于体外应用
当研究PHMB和相关的分子的细胞递送性能时，我们观察到这些聚合物能够高效地与一系列的分子形成纳米颗粒，其中许多分子具有生物活性。
在进一步配制(formulation)和应用之前，生物活性分子的用途可以得益于包含在纳米颗粒内。这样的益处可以包括在使用和改善时改善的溶解性、改善的稳定性、预防降解，和在活体内改善或改变分布或清除 (clearance)特性。在纳米颗粒形成试剂中，低毒性是不寻常的且是非常有益的性质，且在广泛使用的几十年的广泛的应用中，这些化合物的所观察到的低毒性和安全记录是该技术的特征。
评估具有一系列生物活性分子的纳米颗粒的形成
PHMB与核酸在体外作用的证据，这对于载体形成具有装载物分子的非共价复合物和纳米颗粒并递送它至细胞是至关重要的。
使用一系列的方法评估复合物形成的证据
参见图13至17和38。
使用动态光散射(DLS)和荧光显微镜来测定纳米颗粒的形成。使用一系列的方法评估纳米颗粒形成的证据。
a)核酸，所述核酸包括染色体DNA、质粒DNA和RNA。
b)蛋白质
c)小分子
我们的结果显示PHMB和相关的分子形成具有各种装载物分子的纳米颗粒。参见图31和37。
结论：
·自由PHMB能够进入各种细菌、真菌和哺乳动物细胞中(所证明的三个领域)
·PHMB和类似物是用于各种细胞类型的有效的载体，作为用于哺乳动物系统的载体具有巨大的潜在应用
·PHMB和类似物与蛋白质和肽相互作用
·PHMB与一系列的小有机分子相互作用，所述小有机分子包括碱性和酸性小分子。
·PHMB和类似物能够运载核酸到哺乳动物细胞的细胞核并可能释放它们用于在细胞内的有效的功能。
·报道并观察到PHMB和类似物的非常低的毒性
·PHMB和类似物能够运载蛋白质、肽和小分子(实例SytoxGreen和自由的FITC)到哺乳动物细胞中。
·PHMB和类似物能够运载核酸、肽核酸和小分子到细菌和真菌中。
·所述物质成本(substance cost)是非常低的
·化学上允许进一步改性
·PHMB与核酸在高pH下复合导致更高效地递送核酸至细菌和哺乳动物细胞中。
·PHMB和类似物在几分钟内与核酸快速地复合，且复合物在室温稳定几个小时
·PHMB和类似物能够与一系列的生物活性分子形成纳米颗粒。
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Claims (12)

1.用于促进被引剂进入细胞的体外或离体方法，所述被引剂为核酸或核酸类似物，所述方法包括在聚六亚甲基双胍(PHMB)的存在下在盐的存在下将所述细胞暴露于所述核酸或所述核酸类似物的步骤，其中所述核酸或所述核酸类似物和所述PHMB是纳米颗粒形式的复合物的形式；其中所述被引剂包括多肽、肽、小分子药物、生物活性试剂或细胞成像探针/造影剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是原核细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中，所述细胞是真核细胞，例如组织或器官。
4.如权利要求1或3所述的方法，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其中，所述被引剂包括分子量小于2000Da的小分子药物。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述被引剂包括分子量小于1000Da的小分子药物。
7.如权利要求1所述的方法，其中，所述被引剂和所述PHMB是共价连接的。
8.如权利要求1所述的方法，其中，所述核酸和所述PHMB作为制剂提供，例如作为非共价复合物，可选地作为纳米颗粒提供。
9.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法在体外执行。
10.如权利要求1所述的方法，其中，所述方法离体执行。
11.如权利要求8所述的方法，其中，所述方法用所述被引剂相对于所述PHMB过量达100倍摩尔比至所述PHMB相对于所述核酸过量达1000倍摩尔比来执行。
12.如权利要求1所述的方法，其中，所述PHMB和所述被引剂在具有高pH的缓冲液中已经混合或温育或一起提供，所述高pH可选地为10-13.5的pH。
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