KR101368170B1 - 가지형 폴리에틸렌이민 및 산화그래핀을 포함하는 유전자 전달체, 및 이의 이용 - Google Patents

가지형 폴리에틸렌이민 및 산화그래핀을 포함하는 유전자 전달체, 및 이의 이용 Download PDF

Info

Publication number
KR101368170B1
KR101368170B1 KR1020120019928A KR20120019928A KR101368170B1 KR 101368170 B1 KR101368170 B1 KR 101368170B1 KR 1020120019928 A KR1020120019928 A KR 1020120019928A KR 20120019928 A KR20120019928 A KR 20120019928A KR 101368170 B1 KR101368170 B1 KR 101368170B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
bpei
gene
gene delivery
graphene oxide
nanostructure
Prior art date
Application number
KR1020120019928A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20130098090A (ko
Inventor
김원종
김현우
Original Assignee
포항공과대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 포항공과대학교 산학협력단 filed Critical 포항공과대학교 산학협력단
Priority to KR1020120019928A priority Critical patent/KR101368170B1/ko
Publication of KR20130098090A publication Critical patent/KR20130098090A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101368170B1 publication Critical patent/KR101368170B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/52—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an inorganic compound, e.g. an inorganic ion that is complexed with the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B32/00—Carbon; Compounds thereof
    • C01B32/15—Nano-sized carbon materials
    • C01B32/182—Graphene
    • C01B32/198—Graphene oxide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G18/00—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates
    • C08G18/06—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen
    • C08G18/28—Polymeric products of isocyanates or isothiocyanates with compounds having active hydrogen characterised by the compounds used containing active hydrogen
    • C08G18/40—High-molecular-weight compounds
    • C08G18/64—Macromolecular compounds not provided for by groups C08G18/42 - C08G18/63
    • C08G18/6415—Macromolecular compounds not provided for by groups C08G18/42 - C08G18/63 having nitrogen
    • C08G18/6423—Polyalkylene polyamines; polyethylenimines; Derivatives thereof

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

본 발명은 가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine)과 산화그래핀(Graphene oxide)이 화학적으로 결합된, 유전자 전달용 나노 구조체 및 이의 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 가지형 폴리에틸렌이민의 아민기(amine group)와 산화그래핀의 카르복실기(carboxyl group)를 화학적으로 결합시켜 유전자 전달체 및/또는 세포 영상제로 사용할 수 있는 유전자 전달용 나노 구조체, 및 이를 포함하는 유전자 전달 복합체 및 유전자 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유전자 전달용 나노 구조체는 저분자의 가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine) 및 산화그래핀(Graphene oxide)을 화학적으로 결합시킴으로써 독성은 낮추며 유전자 전달 효율은 현저히 증가시켰을 뿐만 아니라, 산화그래핀의 발광능을 증가시켜 효과적인 유전자 치료용 유전자 전달체 및/또는 세포 영상제로 사용 가능하다.

Description

가지형 폴리에틸렌이민 및 산화그래핀을 포함하는 유전자 전달체, 및 이의 이용{Gene delivery system comprising branched polyethyleneimine and uses thereof}
본 발명은 가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine) 및 산화그래핀(Graphene oxide)이 화학적으로 결합된, 유전자 전달용 나노 구조체 및 세포영상제로의 이용에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 가지형 폴리에틸렌이민의 아민기(amine group)와 산화그래핀의 카르복실기(carboxyl group)를 화학적으로 결합시켜 유전자 전달체 및/또는 세포 영상제로 사용할 수 있는 유전자 전달용 나노 구조체, 및 이를 포함하는 유전자 전달 복합체 및 유전자 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
유전자 치료(Gene therapy)란, siRNA, shRNA, DNA 등과 같은 유전물질을 환자의 세포 안으로 주입시켜 유전자 결함을 교정하거나, 세포의 유전적 변형에 의해 유발된 암, 감염성 질병, 자가 면역 질환 등과 같은 모든 유전적 결함을 예방하거나 치료하는 방법을 말한다. 이러한 유전자 치료는 암 치료 또는 유전병 치료에 매우 유용한 기술로 다양한 질병의 원인이 되는 유전자 변형에 의한 질병을 치료할 수 있는 획기적인 치료 방법으로 주목을 받고 있다.
따라서 최근에는 효과적인 유전자 치료를 위하여, 치료 효과를 지닌 유전물질을 세포 내부로 전달할 수 있는 효과적인 전달체 시스템(gene delivery system)의 개발에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 전달체 시스템으로는 크게 바이러스성 전달체와 비바이러스성 전달체로 나눠진다. 바이러스성 전달체는 유전자 전달 효율이 매우 높으나, 돌연변이 유발, 발암 유발, 면역반응 야기 등의 한계점을 가지고 있기 때문에, 최근에는 고분자, 덴드리머, 리포좀 등을 이용한 비바이러스성 전달체의 전달 효율을 증가시키는 방법에 대한 연구가 활발히 이루어지고 있다.
비바이러스성 전달체로 많이 사용되는 양이온성 고분자에는 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI), 키토산(chitosan), 폴리아미도아민(polyamidoamine, PAMAM) 등이 있다. 이중 고분자량의 폴리에틸렌이민은 유전자 전달 효율은 매우 높으나, 독성을 가지고 있어 유전자 전달체로 이용되는데 한계를 가지고 있다. 반면 저분자량의 폴리에틸렌이민은 고분자량의 폴리에틸렌이민에 비하여 상대적으로 낮은 독성을 가지고 있으나 전달 효율이 낮다(Namgung, R. et. al. Biomaterials, 2010, 31, 4204-4213).
이와 같이 효과적인 유전자 치료를 위해서는, 낮은 독성 및 높은 유전자 전달 효율을 가지는 유전자 전달체의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
한편, 탄소 기반의 형광 나노물질들이 낮은 독성을 가지고 있으며, 안정한 발광성을 가지고 있다는 것이 알려지면서 주목을 받고 있다. 대표적인 탄소 기반의 나노물질 중의 하나인 산화그래핀(Graphene oxide)은 탄소 기반의 나노물질들이 가지는 고립된 다환방향성(polyaromatic) 구조를 가지고 있으나, 낮은 방출 효율 때문에 광발광이 거의 관찰되지 않는다. 광발광이 관찰되지 않는 이유는 산화그래핀의 카르복실기와 에폭시기 등이 국지된 전자-양공쌍(electron-hole pair)의 비방사 재조합(non-radiative recombination)을 야기하기 때문으로 알려져 있다. 최근에는 산화그래핀의 에폭시기와 카르복실기를 친핵성 반응을 통하여 결합시킴으로써 국지된 전자-양공쌍 비방사 재조합을 방지할 수 있다는 것이 보고된 바 있다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 유전자 치료용으로 사용 가능한 낮은 독성 및 높은 유전자 전달 효율을 가지는 유전자 전달체를 제공하기 위하여, 가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine) 및 산화그래핀(Graphene oxide)이 화학적으로 결합된 유전자 전달용 나노 구조체를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine) 및 산화그래핀(Graphene oxide)이 화학적으로 결합된 유전자 전달용 나노 구조체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 폴리에틸렌이민은 분자량이 1kDa 내지 22kDa인 저분자인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 유전자 전달체는 가지형 폴리에틸렌이민의 아민기(amine group)와 산화그래핀의 카르복실기(carboxyl group)가 화학적으로 결합된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유전자 전달체는 양전하를 띠는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유전자 전달체는 세포 영상제로 사용되는 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine) 및 산화그래핀(Graphene oxide)이 화학적으로 결합된 유전자 전달용 나노 구조체, 및 DNA 또는 RNA를 포함하는 유전자 전달 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 유전자 전달 복합체는 유전자 전달용 나노 구조체에 DNA 또는 RNA가 이온결합에 의하여 결합된 것을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 유전자 전달용 나노 구조체는 저분자의 가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine) 및 산화그래핀(Graphene oxide)을 화학적으로 결합시킴으로써 독성은 낮추며 유전자 전달 효율은 현저히 증가시켰을 뿐만 아니라, 산화그래핀의 발광능을 증가시켜 효과적인 유전자 치료용 유전자 전달체 및/또는 세포 영상제로 사용 가능하다. 따라서 다양한 유전자 치료용 DNA 또는 RNA 등을 자유자재로 본 발명의 나노 구조체에 도입하여 다양한 유전자 치료에 응용할 수 있는 원천기술로 기대된다.
도 1 은 가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine) 및 산화그래핀(Graphene oxide)이 화학적으로 결합된 유전자 전달용 나노 구조체의 제조 방법을 간략히 나타내는 모식도이다.
도 2 는 BPEI-GO의 화학 결합을 FT-IR 분광법으로 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 3 은 BPEI-GO의 형태 및 크기를 원자힘현미경(AFM)으로 관찰한 결과를 나타내는 도면이다.
도 4 는 BPEI-GO의 콜로이드 안정성을 확인한 결과를 나타내는 도면이다.
도 5 는 BPEI-GO의 표면전위를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 6 은 BPEI-GO/pDNA 착물의 결합정도(a) 및 표면전위(b)를 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 7 은 BPEI-GO/pDNA 착물의 유전자 발현효율을 HeLa 세포주(a) 및 PC-3 세포주(b)에서 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 8 은 BPEI-GO/pDNA 착물의 세포독성을 HeLa 세포주(a) 및 PC-3 세포주(b)에서 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9 는 BPEI-GO의 흡광(a), 빛 여기(excitation) 및 방출(emission)(b), 여기 파장에 따른 방출 스펙트럼(c), 및 방출 스펙트럼(d)을 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
도 10 은 BPEI-GO/pDNA의 광발광을 PC-3 세포에서 측정한 결과를 나타내는 도면이다.
본 발명자들은 세포에 독성을 유발하지 않으며, 높은 유전자 전달 효율을 가지는 유전자 전달체에 대하여 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine) 및 산화그래핀(Graphene oxide)이 화학적으로 결합된 유전자 전달용 나노 구조체를 제공한다.
본 발명자들은 세포에 독성을 유발하지 않는 유전자 전달체를 개발하고자 분자량이 1kDa 내지 22kDa인 저분자 가지형 폴리에틸렌이민과 산화그래핀을 이용하였다. 폴리에틸렌이민과 산화그래핀의 무게비가 5 내지 30이 되도록 가지형 폴리에틸렌이민의 아민기(amine group)와 산화그래핀의 카르복실기(carboxyl group)를 화학적으로 결합시켜 나노 구조체를 형성하였다. 상기 나노 구조체의 크기는 나노 크기라면 제한이 없다. 바람직하게는 직경은 100nm 내지 200nm이고, 높이는 6nm 내지 8nm이다.
폴리에틸렌이민의 아민기가 산화그래핀의 카르복실기, 에폭시기에 결합하여 국지된 전자-양공쌍(electron-hole pair)의 비방사 재조합(non-radiative recombination)을 방지하여 산화그래핀의 발광능을 증가시켜, 상기 나노 구조체는 세포 영상제로 사용가능하다. 또한, 상기 나노 구조체는 양전하를 띠고 있어 DNA 및/또는 RNA와 같은 음전하를 띠는 유전물질과 이온 결합을 통하여 결합되어 유전물질을 외부의 물질로부터 안전하게 보호하는 역할을 하게 된다. 따라서 상기 나노 구조체에 결합시킬 수 있는 유전물질은 음전하를 띠고 있는 유전물질이라면 제한이 없다. 바람직하게는 유전자 치료용으로 사용 가능한 shRNA, siRNA, 플라스미드 DNA, antisense DNA 등이 있다. 이에 본 발명은 상기 나노 구조체에 유전물질이 결합된 유전자 전달 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에서는 상기 유전자 전달 복합체가 DNA를 세포 내로 안정적으로 유입할 뿐만 아니라, 단백질이 정상적으로 발현되는 것을 확인하였으며(실시예 5 참조), 다른 실시예에서는 상기 유전자 전달 복합체가 세포에 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다(실시예 6 참조).
상기 결과로부터, 본 발명의 유전자 전달 복합체는 유전자 치료에 적용될 수 있을 것으로 기대된다. 이에 본 발명은 상기 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 유전자 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용 가능한 담체는 생리식염수, 폴리에틸렌글리콜, 에탄올, 식물성 오일, 및 이소프로필미리스테이트 등을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 다른 측면은 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 약제학적 유효량을 개체에 투여하여 질병을 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명에서 개체란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 쥐(rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다. 또한, 본 발명에서 약제학적 유효량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하게 조절될 수 있음은 당업자에게 명백하다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직하게는, 1일 0.001 내지 100 mg/체중kg으로, 보다 바람직하게는 0.01 내지 30 mg/체중kg으로 투여한다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 여러번 나누어 투여할 수도 있다. 본 발명의 유전자 전달 복합체는 전체 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1 중량%의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여방법에는 제한이 없으며, 예를 들면, 경구, 직장, 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막, 또는 뇌혈관(intra cerbroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 가지형 폴리에틸렌이민- 산화그래핀 나노 구조체의 제조
가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, BPEI)과 산화그래핀(graphene oxide, GO)을 결합시키기 위하여, GO을 탈이온수(deionized water)에 0.5mg/L의 농도로 분산시킨 후에 0.4mmol의 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimide) 용액과 0.4mmol의 NHS(N-hydroxysuccinimide) 용액을 첨가하였다. 그리고 TEA(triethylamine)가 첨가된 BPEI 용액을 한 방울 첨가하여 상기 산화그래핀 용액에 0.396g의 BPEI를 첨가한 후, 실온에서 24시간 동안 반응시켜 가지형 폴리에틸렌이민-산화그래핀 나노 구조체(BPEI-GO)를 제조하였다. 상기 가지형 폴리에틸렌이민은 분자량 1.8kDa를 가진 BPEI를 polyscience에서 구매하여 사용하였다. 반응이 종료된 후에 결합되지 않은 여분의 BPEI 및 GO는 투석(dialysis, MWCO 3500)을 통하여 제거하여 정제된 BPEI-GO를 수득하였다. 상기 실험에 대한 개략적인 모식도는 도 1에 나타내었다. GO에 결합된 BPEI를 정량하기 위하여, PEI와 구리 이온(copper(II))으로 형성된 구리 암모니아 복합체(cuprammonium complex)의 흡광도(630nm)를 이용하여 정량한 결과 BPEI/GO의 무게비가 22임을 확인하고, 상기 제조된 구조체를 BPEI-GO22라 명명하였다.
또한, BPEI와 EDC/NHS의 농도를 각기 다르게 하여 상기와 동일한 방법으로 구조체를 제조한 결과, BPEI/GO의 무게비가 다른 구조체가 제조된다는 것을 확인하였다. 그 결과는 표 1에 나타내었다.
[표 1]
Figure 112012015996715-pat00001

실시예 2. BPEI - GO 의 화학 결합 확인
가지형 폴리에틸렌이민(branched polyethyleneimine, BPEI)과 산화그래핀(graphene oxide, GO)의 화학 결합을 확인하기 위하여, FT-IR 분광법(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)을 수행하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타난 바와 같이, GO의 카르복실기(carboxyl group)와 BPEI의 아민기(amine group)의 결합으로 형성된 아미드(amide) 결합의 진동수인 1630-1695cm-1가 관찰되었다. 상기 결과를 통하여, BPEI와 GO가 화학적 결합을 통하여 구조체를 이루고 있다는 것을 확인하였다.
실시예 3. BPEI - GO 의 형태 및 크기 확인
BPEI-GO의 형태 및 크기를 확인하기 위하여, 원자힘현미경(atomic force microscope, AFM)을 이용하여 관찰하였다. BPEI-GO와 DNA의 결합을 확인하기 위하여, pcDNA3(Invitrogen) 플라스미드에 루시퍼레이즈(luciferase) 유전자를 삽입시킨 플라스미드를 BPEI-GO 또는 GO에 처리한 후(N/P=10)에 관찰하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타난 바와 같이, GO는 500 내지 600nm의 직경과 0.6 내지 1.3nm의 높이를 가지고 있는 것을 확인하였고, GO에 pDNA를 처리한 경우에는 pDNA와 GO가 결합되지 않아 어떠한 형태적 변화도 나타나지 않는 것을 확인할 수 있었다. BPEI-GO22의 직경은 100 내지 200nm이고, 높이는 6 내지 8nm의 구조체인 것을 확인하였다. 그리고 pDNA를 처리한 경우에는 pDNA가 구조체에 결합하여 직경이 300 내지 400nm로, 높이는 16 내지 18nm로 증가된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, BPEI-GO는 DNA와 결합할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 4. BPEI - GO 의 안정성 확인
콜로이드(colloid)의 안정성은 생물학적 응용을 위해서는 필수적이기 때문에 BPEI-GO의 콜로이드 안정성을 확인하였다. 안정성을 확인하기 위하여, 탈이온수, PBS(phosphate buffered saline), 및 10% FBS(fetal bovine serum)이 포함되어 있는 DMEM 배지에 실시예 1에서 제조된 BPEI-GO를 첨가한 후에 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타난 바와 같이, BPEI 및 GO를 혼합시킨 수용액에서는 30분 만에 침전이 일어났지만, BPEI-GO의 경우에는 1시간 이상이 경과하여도 침전이 일어나지 않는 것을 확인하였다. FBS가 포함되어 있는 배지에서도 침전이 일어나지 않는 것을 통하여, BPEI-GO는 BPEI/GO의 무게비와 관계없이 모두 생체 내에서도 우수한 안정성을 가진다는 것을 확인하였다.
BPEI-GO는 양전하를 띠기 때문에, 음전하를 가지고 있는 유전자와 정전기적 상호작용을 통하여 착물을 형성하고, 외부 환경으로부터 결합된 유전자를 보호할 수 있다. 따라서 BPEI-GO가 DNA와 결합할 수 있는지 확인하기 위하여, GO, BPEI, 및 BPEI-GO의 표면전위(zeta potential)를 측정하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, GO는 강한 음전하를 띠고 있으며, BPEI는 강한 양전하를 띠고 있는 것을 확인하였다. 또한 BPEI-GO는 BPEI에 비하여 더욱 강한 양전하를 띠고 있는 것을 확인하였다.
또한 다양한 N/P 비율(PEI의 amine 수/pDNA의 phosphate 수)에서 pDNA와 안정적으로 착물을 형성하는지 확인하기 위하여 BPEI/pDNA 착물 및 BPEI-GO/pDNA 착물을 제조한 후 전기영동을 통하여 BPEI-GO/pDNA 착물이 형성되었는지 확인하였고, N/P 비율에 따른 표면전위의 변화를 측정하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.
도 6A에 나타난 바와 같이, GO는 pDNA와 결합하지 못하였고, BPEI 25K 는 N/P 비율이 2 이상인 경우 pDNA와 결합함을 확인하였다. BPEI-GO의 경우에는 BPEI/GO의 무게비가 증가할수록 DNA와의 결합 효율이 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. BPEI-GO22의 경우에는 BPEI 25K 와 유사한 결합 효율을 보여주었다.
도 6B에 나타난 바와 같이, N/P 비율이 5 이상에서는 제조된 착물 모두 표면에 양전하를 띠고 있는 것을 확인할 수 있었고, BPEI/pDNA 착물의 경우에는 GO가 존재하는 경우에 비하여 상대적으로 낮은 표면전위를 갖는 것을 확인하였다. 또한 BPEI/GO의 무게비가 클수록 BPEI-GO/pDNA 착물의 표면전위도 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, BPEI-GO가 상대적으로 높은 전하 밀도를 가지고 pDNA와 착물을 형성한다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 5. BPEI - GO 의 유전자 전달 효율 측정
BPEI-GO의 유전자 전달 효율을 측정하기 위하여, HeLa 세포주, PC-3 세포주를 각각 10%의 혈청이 포함된 DMEM, RPMI 안에 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 배양한 후 혈청이 포함되지 않은 배양액으로 교체한 다음 여러 N/P 비율의 BPEI-GO/pDNA 착물을 처리하여 4시간 배양하였다. 혈청이 포함된 배양액으로 교체한 후 18시간 배양하고 DPBS로 세척한 후, 형광측정을 통해 루시퍼레이즈가 발현된 양을 측정하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타난 바와 같이, BPEI 1.8K/pDNA 착물의 경우에는 유전자 전달 효율이 매우 낮은 반면 BPEI-GO22의 경우에는 현저히 증가된 유전자 전달 효율을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과를 통하여, BPEI-GO22는 세포 투과성이 높을 뿐만 아니라, 세포 내로 유전자를 효율적으로 전달할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 6. BPEI - GO / pDNA 착물의 세포 독성 측정
BPEI-GO/pDNA 착물의 세포 독성을 측정하기 위하여, HeLa 세포주, PC-3 세포주를 각각 10%의 혈청이 포함된 DMEM, RPMI 안에 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 배양한 후 혈청이 포함되지 않은 배양액으로 교체한 다음 여러 N/P 비율의 BPEI-GO/pDNA 착물을 처리하여 4시간 배양하였다. 혈청이 포함된 배양액으로 교체한 후 18시간 배양하고 DPBS로 세척한 후 MTT assay를 통하여 착물의 세포 독성을 측정하였다. 생존률은 시료를 처리하지 않은 세포에 대한 활성을 100%로 하여 상대적으로 산출하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타난 바와 같이, BPEI-GO 및 BPEI-GO/pDNA 착물 모두 생존률이 80% 이상으로 세포의 생존률에 큰 영향을 미치지 않는다는 것을 확인하였다. 상기 결과는 BPEI-GO를 안정적으로 진단 및 치료에 적용할 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 7. BPEI - GO / pDNA 착물의 세포 영상제 특성 분석
7-1. BPEI - GO 의 광발광 측정
GO는 탄소 기반의 나노물질들이 가지는 고립된 다환방향성(polyaromatic) 구조를 가지고 있으나, 낮은 방출 효율 때문에 광발광(photoluminescence, PL)이 거의 관찰되지 않는다. BPEI-GO는 광발광이 관찰되는지 확인하기 위하여, 형광계를 이용하여 측정하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, BPEI-GO는 GO에 비하여 광발광이 증가된 것을 확인할 수 있었다. 상기 결과는 BPEI의 아민기가 GO의 카르복실기, 에폭시기에 결합하여 국지된 전자-양공쌍(electron-hole pair)의 비방사 재조합(non-radiative recombination)을 방지한다는 것을 의미한다. 또한 520nm에서 최대 방출 파장을 가지는 것을 확인하였다.
7-2. 세포 내에서의 BPEI - GO 의 광발광 측정
BPEI-GO의 광발광이 세포 내에서도 관찰되는지 확인하기 위하여, PC-3 세포주에 BPEI-GO, BPEI-GO/pDNA, GO/pDNA, 및 BPEI/pDNA를 4시간 동안 처리한 후에 confocal microscopy를 이용하여 세포를 관찰하였다. DNA는 TOTO 염색 시약으로 염색하여 관찰하였다. 그 결과는 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, BPEI-GO만 처리한 세포에서 녹색 형광을 관찰할 수 있었고, 상기 결과를 통하여 BPEI-GO를 세포 영상제(cell imaging agent)로 사용가능하다는 것을 확인하였다. 또한 GO/pDNA 및 BPEI/pDNA 착물에 비하여 BPEI-GO/pDNA 착물을 처리한 세포의 세포질 및 세포핵에서 pDNA(빨간색)가 많이 관찰되는 것을 통하여 BPEI-GO가 DNA를 효과적으로 세포 내로 전달한다는 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통하여, BPEI-GO는 유전자 전달체 뿐만 아니라 세포 영상제로도 사용가능하다는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (8)

1.8 kDa의 가지형 폴리에틸렌이민(Branched polyethyleneimine) 및 산화그래핀(Graphene oxide)이 5 내지 30의 무게비로 하여, 화학적으로 결합된 유전자 전달 복합체로서, 상기 복합체는 유전자 전달용 나노 구조체와 DNA 또는 RNA를 포함하는 구조인 것을 특징으로 하는, 유전자 전달 복합체.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 유전자 전달용 나노 구조체는 가지형 폴리에틸렌이민의 아민기(amine group)와 산화그래핀의 카르복실기(carboxyl group)가 화학적으로 결합된 것을 특징으로 하는, 유전자 전달 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 유전자 전달용 나노 구조체는 양전하를 띠는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달 복합체.
제 1 항에 있어서,
상기 유전자 전달용 나노 구조체는 세포 영상제로 사용되는 것을 특징으로 하는, 유전자 전달 복합체.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 유전자 전달 복합체는 유전자 전달용 나노 구조체에 DNA 또는 RNA가 이온결합에 의하여 결합된 것을 특징으로 하는, 유전자 전달 복합체.
제 1 항의 유전자 전달 복합체를 유효성분으로 포함하는, 유전자 치료용 약학적 조성물.
KR1020120019928A 2012-02-27 2012-02-27 가지형 폴리에틸렌이민 및 산화그래핀을 포함하는 유전자 전달체, 및 이의 이용 KR101368170B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120019928A KR101368170B1 (ko) 2012-02-27 2012-02-27 가지형 폴리에틸렌이민 및 산화그래핀을 포함하는 유전자 전달체, 및 이의 이용

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120019928A KR101368170B1 (ko) 2012-02-27 2012-02-27 가지형 폴리에틸렌이민 및 산화그래핀을 포함하는 유전자 전달체, 및 이의 이용

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20130098090A KR20130098090A (ko) 2013-09-04
KR101368170B1 true KR101368170B1 (ko) 2014-03-19

Family

ID=49450170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120019928A KR101368170B1 (ko) 2012-02-27 2012-02-27 가지형 폴리에틸렌이민 및 산화그래핀을 포함하는 유전자 전달체, 및 이의 이용

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101368170B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107805642B (zh) * 2016-09-09 2021-11-30 南京理工大学 一种多功能石墨烯基因载体的构建与应用
US11530178B2 (en) 2018-01-18 2022-12-20 Memsift Innovations Pte. Ltd. Hyper-branched compounds, synthesis and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C A R B O N 5 0 ( 2 0 1 2 ) 3 4 0 7 -3 4 1 5; Available online 9 February 2012 *
J. Mater. Chem., 2011, 21, 7736-7741 *

Also Published As

Publication number Publication date
KR20130098090A (ko) 2013-09-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Mohammadinejad et al. Shedding light on gene therapy: Carbon dots for the minimally invasive image-guided delivery of plasmids and noncoding RNAs-A review
Mohajeri et al. Biomedical applications of carbon nanomaterials: Drug and gene delivery potentials
Feng et al. Charge-convertible carbon dots for imaging-guided drug delivery with enhanced in vivo cancer therapeutic efficiency
Kiew et al. Assessing biocompatibility of graphene oxide-based nanocarriers: A review
Mousavi et al. Applications of graphene oxide in case of nanomedicines and nanocarriers for biomolecules: review study
Czapar et al. Tobacco mosaic virus delivery of phenanthriplatin for cancer therapy
Yao et al. Construction of magnetic-carbon-quantum-dots-probe-labeled apoferritin nanocages for bioimaging and targeted therapy
Hwang et al. Applications of functionalized carbon nanotubes for the therapy and diagnosis of cancer
Venkatesan et al. The potential of celecoxib-loaded hydroxyapatite-chitosan nanocomposite for the treatment of colon cancer
Zhang et al. Tumor acidic microenvironment targeted drug delivery based on pHLIP-modified mesoporous organosilica nanoparticles
Wu et al. Current applications of graphene oxide in nanomedicine
Kim et al. Graphene oxide–polyethylenimine nanoconstruct as a gene delivery vector and bioimaging tool
Zhou et al. Controlled release of doxorubicin from graphene oxide based charge-reversal nanocarrier
Wang et al. Synergistic anticancer effect of RNAi and photothermal therapy mediated by functionalized single-walled carbon nanotubes
Patil et al. Nanotechnology derived nanotools in biomedical perspectives: An update
Thambi et al. Hypoxia-responsive polymeric nanoparticles for tumor-targeted drug delivery
Gao et al. Arginine-chitosan/DNA self-assemble nanoparticles for gene delivery: In vitro characteristics and transfection efficiency
Poon et al. Targeting B16 tumors in vivo with peptide-conjugated gold nanoparticles
Liu et al. Polyamidoamine-grafted multiwalled carbon nanotubes for gene delivery: synthesis, transfection and intracellular trafficking
Yan et al. Stacking of doxorubicin on folic acid-targeted multiwalled carbon nanotubes for in vivo chemotherapy of tumors
Gao et al. Fluorine-doped carbon dots with intrinsic nucleus-targeting ability for drug and dye delivery
Tomuleasa et al. Nanopharmacology in translational hematology and oncology
Wu et al. Synergistic anticancer activity of photo-and chemoresponsive nanoformulation based on polylysine-functionalized graphene
Hao et al. Multifunctional nanosheets based on folic acid modified manganese oxide for tumor-targeting theranostic application
You et al. Graphene oxide-based nanocarriers for cancer imaging and drug delivery

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
LAPS Lapse due to unpaid annual fee