CN111793688A - 消化道肿瘤标记物检测的引物探针组、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种消化道肿瘤标记物，所述标记物为甲基化的CLIP4基因，存在至少1个修饰的CpG位点，本发明还公开了一种消化道肿瘤标记物检测的引物探针组及试剂盒，所述的引物探针组序列上包含至少1个可以与修饰CPG位点互补配对的碱基位点。本发明对消化道恶性肿瘤高危人群和患者的生物样本中的特异性DNA甲基化标记物CLIP4基因检测，可以为消化道恶性肿瘤的早期筛查、早期诊断及个性化治疗提供一种高灵敏度且非侵入性的检测手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种消化道肿瘤标记物检测的引物探针组、试剂盒及其应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
根据世界卫生组织(WHO)公布的最新恶性肿瘤发病率和死亡率数据显示，中国在2018年有4,285,033例恶性肿瘤新发病例，有2,865,174例恶性肿瘤的死亡病例。其中消化道恶性肿瘤(结直肠癌、胃癌、肝癌、食管癌和胰腺癌)在所有恶性肿瘤的发病率和死亡率中均排名在前十位以内，而在全球范围内，中国胃癌和食管癌的发病率和死亡率均占据了全球发病率和死亡率的50％以上，而结直肠癌的发病率在中国也呈现出逐渐上升的趋势。因此，消化道恶性肿瘤是目前危害我国居民健康最常见的恶性肿瘤门类。
在中国，所有的消化道肿瘤都呈现出早诊早治率低的现象，没有实现消化道恶性肿瘤的早诊早治，是导致我国消化道恶性肿瘤发病率和死亡率高的重要原因。消化道肿瘤早期诊断的金标准都是内镜检测。内镜检测具有准确性高，特异性强的优势，而且可以对病灶位置直接观察并进行活检。但是内镜检测方法还存在着诸多缺陷：1.由于传统观念以及人们对内镜筛查带来益处的认知不足、早诊早治的意识不强，同时对内镜检查带来的不适存在较大顾虑，因此居民参与内镜筛查的意愿不高；2.目前仅在我国少部分消化道恶性肿瘤高发地区的高危人群中试行了政府主导的内镜免费筛查项目，绝大部分地区并没有将内镜筛查纳入政府医保支付范围，而我国仍然是一个发展中国家，即使在江苏这样发达省份的农村地区，内镜筛查对普通家庭来说仍然是一笔较高的费用，限制了居民主动寻求内镜筛查的积极性。3.内镜筛查需要具有丰富经验的内镜医师及昂贵的内镜设备、完善的内镜清洗消毒设施等诸多条件，因此在我国这样一个人口众多的国家，由于缺少必要的医疗卫生资源以及内镜医师人力资源，无法实现便捷的内镜筛查，在经济发展水平较落后的地区困难尤为突出。同时大部分医院内镜检查需要提前预约，耗时耗力，也限制了内镜检查成为一线的消化道恶性肿瘤筛查手段。4.内镜筛查作为一种侵入性的筛查手段，需要提前准备，比如服用泻药或麻药，且在检测过程中痛苦较大，对传统观念较强的中国人而言，侵犯隐私，因此接受度很低。而其他的一些现有的蛋白肿瘤标记物如CEA、CA199只能检测出少部分晚期的癌症，对早期癌症和癌变检出率不足30％，根本无法用于消化道恶性肿瘤的早期筛查。而中国需要进行消化道早期筛查的人群有近8亿(>40岁)，而真正已经参与到早期筛查的人群连5％都不到，这意味着中国的消化道肿瘤早诊早治还面临着巨大挑战，同时也意味着这是一个具有上千亿级别的市场亟待开发和爆发。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种消化道肿瘤标记物检测的引物探针组、试剂盒及其应用，通过对消化道恶性肿瘤高危人群和患者的生物样本中的特异性DNA甲基化标记物检测，可以为消化道恶性肿瘤的早期筛查、早期诊断及个性化治疗提供一种高灵敏度且非侵入性的检测手段。
为解决上述技术问题，本发明提供一种消化道肿瘤标记物，所述标记物为甲基化的CLIP4基因，存在至少1个修饰的CpG位点，所述CLIP4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
优选地，所述修饰包括经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。
本发明还提供消化道肿瘤标记物检测的引物探针组，所述的引物探针组序列上包含至少1个可以与修饰CPG位点互补配对的碱基位点，所述引物探针组的序列如以下任意一组或多组：
引物探针组1：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
引物探针组2：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
引物探针组3：SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；
引物探针组4：SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；
引物探针组5：SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17；
引物探针组6：SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。
本发明还提供消化道肿瘤标记物检测的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物探针组。
优选地，所述试剂盒还包含内参基因ACTB的引物探针组，所述内参基因ACTB的引物探针组序列如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22和SEQ ID NO.23所示。
本发明还公开上述的试剂盒在消化道恶性肿瘤及其癌前病变的早期诊断和筛查中的应用，包括：
人源生物样本中的DNA提取；
将提取的DNA经甲基化亚硫酸氢盐转化，将未甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U；
采用上述的试剂盒进行甲基化实时荧光定量PCR反应；
根据CLIP4基因的Ct值进行判读，判断是否患有消化道肿瘤。
优选地，所述甲基化实时荧光定量PCR反应的条件为：
第一阶段：(95℃15-30min)×1个循环；
第二阶段：(95℃10s，55-60℃30s，72℃10-15s)×50个循环；
第三阶段：(40℃1min)×1个循环。
优选地，根据CLIP4基因的Ct值进行判读的方法为：
a.阳性外质控检测结果为阳性，
b.阴性外质控检测结果为阴性，
c.所有生物样本均可检测到ACTB信号，且Ct值≤40，
d.符合上述标准后再根据CLIP4的Ct值、平均值或有效反应数进行判读。
优选地，所述的人源生物样本包括血液、粪便、唾液、痰液、尿液、组织中的一种或多种；所述的消化道肿瘤包括胃癌、胃部不典型增生、胃腺瘤、结直肠癌、结直肠不典型增生、结直肠腺瘤中的一种或多种。
本发明所达到的有益效果：本发明对消化道恶性肿瘤高危人群和患者的生物样本中的特异性DNA甲基化标记物CLIP4基因检测，可以为消化道恶性肿瘤的早期筛查、早期诊断及个性化治疗提供一种高灵敏度且非侵入性的检测手段。
附图说明
图1是本发明实施例1引物探针和试剂盒检测转化后的结直肠进展期腺瘤、结直肠癌和胃癌基因组DNA扩增曲线；
图2是本发明实施例2引物探针组合试剂盒检测结直肠癌、结直肠癌旁组织结果；
图3是本发明实施例3引物探针组合试剂盒检测结直肠癌、结直肠癌旁组织结果；
图4是本发明实施例4引物探针组合试剂盒检测胃癌、癌旁组织结果；
图5是本发明实施例5检测结直肠癌和正常对照样本ROC曲线。
具体实施方式
下面对本发明作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。
实施例1
以亚硫酸氢盐转后的结直肠进展期腺瘤、结直肠癌和胃癌基因组DNA溶液为检测对象。以引物探针组1配制荧光定量PCR反应体系，荧光定量PCR反应体系为：引物浓度为0.4mM，探针浓度0.1mM，1×PCR缓冲液，6mM MgCl2溶液，0.1U/ul DNA聚合酶，PCR反应混合体积为15ul，DNA模板体积为15ul，反应条件为95℃20分钟，(95℃10秒，56℃30秒，72℃10秒)×50个循环，40℃1分钟。
结果如图1所示，其中，1为结直肠癌，2为结直肠进展期腺瘤，3为胃癌，本发明的引物探针组和试剂盒对转化后的结直肠进展期腺瘤、结直肠癌和胃癌基因组DNA有明显的扩增曲线，呈阳性。
实施例2
以5对结直肠癌和癌旁组织为检测对象，采用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒提取DNA后，采用苏州唯善生物科技有限公司的亚硫酸氢盐快速转化试剂盒进行转化和纯化。以引物探针组2配制荧光定量PCR反应体系为：引物浓度0.2mM，探针浓度0.1Mm,1×PCR缓冲液，6mM MgCl2溶液，0.12U/ul DNA聚合酶，PCR反应混合体积为15ul，DNA模板体积为15ul，反应条件为95℃20分钟，(95℃10秒，60℃30秒，72℃15秒)×50个循环，40℃30秒。
检测结果如图2所示，CLIP4基因在结直肠癌的甲基化水平明显高于癌旁组织，证明甲基化的CLIP4基因可以用来区分结直肠癌的癌症组织和非癌症组织。
实施例3
以5对结直肠癌和癌旁组织为检测对象，采用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒提取DNA后，采用苏州唯善生物科技有限公司的亚硫酸氢盐快速转化试剂盒进行转化和纯化。以引物探针组3配制荧光定量PCR反应体系为：引物浓度0.4mM，探针浓度0.1Mm,1.5×PCR缓冲液，6mM MgCl2溶液，0.12U/ul DNA聚合酶，PCR反应混合体积为15ul，DNA模板体积为15ul，反应条件为95℃20分钟，(95℃10秒，60℃30秒，72℃15秒)×50个循环，40℃30秒。
检测结果如图3所示，CLIP4基因在结直肠癌的甲基化水平明显高于癌旁组织，证明甲基化的CLIP4基因可以用来区分结直肠癌的癌症组织和非癌症组织。
实施例4
以7对胃癌和癌旁组织为检测对象，采用QIAGEN DNeasy Blood&Tissue试剂盒提取DNA后，采用苏州唯善生物科技有限公司的亚硫酸氢盐快速转化试剂盒进行转化和纯化。以引物探针组4配制荧光定量PCR反应体系为：引物浓度0.4mM,探针浓度0.1Mm,1×PCR缓冲液，6mM MgCl2溶液，0.12U/ul DNA聚合酶，PCR反应混合体积为15ul，DNA模板体积为15ul，反应条件为95℃ 20分钟，(95℃ 10秒，60℃30秒，72℃10秒)×50个循环，40℃30秒。
检测结果如图4所示，CLIP4基因在胃癌的甲基化水平明显高于癌旁组织，证明甲基化的CLIP4基因可以用来区分胃癌的癌症组织和非癌症组织。
实施例5
以35例结直肠癌和22例正常对照样本的粪便为检测对象，采用苏州唯善生物科技有限公司的粪便人源基因组DNA提取试剂盒提取DNA后，采用苏州唯善生物科技有限公司的亚硫酸氢盐快速转化试剂盒进行转化和纯化。以引物探针组3配制荧光定量PCR反应体系为：引物浓度0.4mM,探针浓度0.1Mm,1.5×PCR缓冲液，6mM MgCl2溶液，0.12U/ul DNA聚合酶，PCR反应混合体积为15ul，DNA模板体积为15ul，反应条件为95℃ 20分钟，(95℃ 10秒，60℃30秒，72℃15秒)×50个循环，40℃ 30秒。
该检测对所有样本进行3个重复的PCR检测，以CLIP4的3个PCR结果均有信号且Ct<35为判别阈值。得到本发明对结直肠癌粪便样本的检出灵敏度高达94.2％，特异性高达100％(表1)。如图5所示，绘制ROC曲线可发现AUC＝0.997(95％CI：0.990-1.000)，证明该发明试剂盒检测结直肠癌具有足够的灵敏度和特异性。
表1.本发明引物探针组合试剂盒检测结直肠癌及正常人粪便样本
实施实例6
以18例结直肠癌和19正常对照样本的血浆为检测对象，采用苏州唯善生物科技有限公司的血浆游离核酸提取试剂盒提取cfDNA后，采用苏州唯善生物科技有限公司的亚硫酸氢盐快速转化试剂盒进行转化和纯化。以引物探针组5配制荧光定量PCR反应体系为：引物浓度0.4mM，探针浓度0.1Mm,1.5×PCR缓冲液，6mM MgCl2溶液，0.12U/ul DNA聚合酶，PCR反应混合体积为15ul，DNA模板体积为15ul，反应条件为95℃ 20分钟，(95℃ 10秒，60℃ 30秒，72℃ 15秒)×50个循环，40℃ 30秒。
表2.本发明引物探针组合试剂盒检测结直肠癌及正常人血浆样本
该检测仅有1个PCR重复，以CLIP4的Ct值<45为阳性，可以看出该试剂盒可以检出55.6％的结直肠癌血浆样本，特异性高达84.2％(表2)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 苏州唯善生物科技有限公司
<120> 消化道肿瘤标记物检测的引物探针组、试剂盒及其应用
<160> 23
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 567
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
gttttttata gtaagcgttg ttagtaggga attggtggat gtatttttga ttacgttcgg 60
ttggattttg gggagtttaa gacgggtaag attaggtttt cggttttagt agttggtggg 120
ggcgtcgtag gttagagacg tgaggtcgcg aggttgaggg ttgtgaaggc ggtgggtacg 180
tacggcgtgt cggggtcgtt tggtttcgcg gcgggggagg taatattgcg atatttcgta 240
gacgttgtta gtcggggtcg cggtttcgcg tgcgttcgat tatttgattg ttggggagtg 300
cgggggcgcg ggagttaggc gagttagcgt aggcgcgcgt tgtttttttc gtttttatcg 360
agtttttagc gcgtgcgcgg ggtcgtggtc gaggtttgcg cgtcgttcgg tcgtttgtat 420
tgcgcgcgcg tttatttcgc gtgggaggta gcgggagggg ttcggagagg tgtggagcgg 480
cgcggcggga ggtttcgtgg gcggttacgg gagatagcgt cggcgggagc gcgtttttcg 540
gttttttttt cgcgttttcg cgttttt 567
<210> 2
<211> 324
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
ttttcgggtt ttttcggagc ggtcggttgg ggacgcgggg gcgcggagga aaggtcgaga 60
ggcgcgtttt cgtcggcgtt gtttttcgtg gtcgtttacg gagtttttcg tcgcgtcgtt 120
ttatattttt tcgggttttt ttcgttgttt tttacgcggg gtgggcgcgc gcgtagtgta 180
ggcggtcggg cggcgcgtag gtttcggtta cggtttcgcg tacgcgttgg ggattcggtg 240
gggacggagg aggtagcgcg cgtttgcgtt ggttcgtttg gttttcgcgt tttcgtattt 300
tttagtagtt agatgatcgg gcgt 324
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgcggcggg aggtttc 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcgctcccgc cgacgct 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgggcggtta cgggagat 18
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggaggggttc ggagaggtg 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgccgacgc tatctcccg 19
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggcgggaggt ttcgtgggcg g 21
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggggttcgg agaggtg 17
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgccgacgct atctcccg 18
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcgggaggtt tcgtgggcg 19
<210> 12
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgcgaggttg agggttgt 18
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgaaatatcg caatattacc tc 22
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggggtcgttt ggtttcgcgg cg 22
<210> 15
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gaggaaaggt cgagaggc 18
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aactccgtaa acgaccacg 19
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgttttcgtc ggcgttgttt 20
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggacggagga ggtagc 16
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
tacgaaaacg cgaaaacca 19
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgcgtttgcg ttggttcgt 19
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tagggagtat ataggttggg gaagtt 26
<210> 22
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aacacacaat aacaaacaca aattcac 27
<210> 23
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cgactgcgtg tggggtggtg atggaggagg tttaggcagt cg 42
Claims (10)
1.消化道肿瘤标记物，其特征是，所述标记物为甲基化的CLIP4基因，存在至少1个修饰的CpG位点，所述CLIP4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2 所示。
2.根据权利要求1所述的消化道肿瘤标记物，其特征是，所述修饰包括经DNA甲基转移酶催化胞嘧啶转化为5-甲基胞嘧啶。
3.权利要求1所述的消化道肿瘤标记物检测的引物探针组，其特征是，所述的引物探针组序列上包含至少1个可以与修饰CPG位点互补配对的碱基位点，所述引物探针组的序列如以下任意一组或多组：
引物探针组1：SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5；
引物探针组2：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；
引物探针组3：SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11；
引物探针组4：SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14；
引物探针组5：SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17；
引物探针组6：SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。
4.消化道肿瘤标记物检测的试剂盒，其特征是，所述试剂盒包含权利要求3所述的引物探针组。
5.根据权利要求4所述的消化道肿瘤标记物检测的试剂盒，其特征是，所述试剂盒还包含内参基因ACTB的引物探针组，所述内参基因ACTB的引物探针组序列如SEQ ID NO.21、SEQID NO.22和SEQ ID NO.23所示。
6.权利要求4或5所述的试剂盒在消化道恶性肿瘤及其癌前病变的早期诊断和筛查中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征是，包括：
人源生物样本中的DNA提取；
将提取的DNA经甲基化亚硫酸氢盐转化，将未甲基化的胞嘧啶C转化为尿嘧啶U；
采用权利要求4或5所述的试剂盒进行甲基化实时荧光定量PCR反应；
根据CLIP4基因的Ct值进行判读，判断是否患有消化道肿瘤。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述甲基化实时荧光定量PCR反应的条件为：
第一阶段：（95℃ 15-30 min）× 1个循环；
第二阶段：（95℃ 10s，55-60℃ 30s， 72℃10 - 15 s）× 50个循环；
第三阶段：（40℃ 1min）× 1个循环。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征是，根据CLIP4基因的Ct值进行判读的方法为：
a.阳性外质控检测结果为阳性，
b.阴性外质控检测结果为阴性，
c.所有生物样本均可检测到ACTB信号，且Ct值≤40，
d. 符合上述标准后再根据CLIP4的Ct值、平均值或有效反应数进行判读。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征是，所述的人源生物样本包括血液、粪便、唾液、痰液、尿液、组织中的一种或多种；所述的消化道肿瘤包括胃癌、胃部不典型增生、胃腺瘤、结直肠癌、结直肠不典型增生、结直肠腺瘤中的一种或多种。
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| WO2022143226A1 (zh) * | 2020-12-30 | 2022-07-07 | 苏州唯善生物科技有限公司 | 消化道肿瘤标志物组合、检测试剂盒及其用途 |
-
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| WO2022143226A1 (zh) * | 2020-12-30 | 2022-07-07 | 苏州唯善生物科技有限公司 | 消化道肿瘤标志物组合、检测试剂盒及其用途 |
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