CN111793606A - 一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法。本发明提供一种转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液,所述培养液包含基础培养液和p53蛋白小分子激动剂;所述p53蛋白小分子激动剂包括RITA、CTX1、Nutlin‑3中的一种或多种。本发明还提供利用所述培养液提高基因编辑的同源修复效率的方法。通过在转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液中添加p53蛋白的小分子激动剂,极大地提高了基因编辑过程的同源修复效率,进而提高了基因编辑效率,有效降低了阳性细胞的筛选工作量,同时具有操作简便、成本低等优势,应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,具体涉及一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法。
背景技术
在细胞或活体水平上进行遗传缺陷的修复,已经成为疾病的细胞治疗、新药开发、动物表型改善的重要手段。在动物的细胞治疗中,通过收集动物的活体细胞、在体外进行分离培养、利用基因编辑技术修正缺陷基因、质量控制后回输到动物体内,进而达到治疗某些疾病的目的。随着技术水平的不断提高,细胞治疗已经成为现代医学的重要发展方向。动物基因编辑主要用于获得生产性能提高的动物新品种、无免疫排斥基因或蛋白或组织器官(实现人源化)、生物活性物质(生物提取制药)等高附加值产品,如生物制药中的动物生物反应器、用于异种移植治疗器官衰竭的人源化器官生产、抗烈性传染病的畜禽新品种培育等诸多领域。目前已经获得的具有优良性状的基因编辑动物包括白化的基因编辑五指山猪、细毛产量明显增加的基因编辑羊、产肉性能与国际著名肉牛品种相当的基因编辑鲁西黄牛等,这些优良性状的获得是常规育种数十年都难以实现的,由此可见,基因编辑技术具有巨大优势和应用价值。
在疾病治疗或动物遗传育种的基因修复或定点插入新基因的过程中,如何进行高效修复与定点整合是制约治疗用细胞或基因编辑动物规模化生产的主要瓶颈。CRISPR/Cas9基因编辑技术是目前动物基因编辑的主要方法,目前的研究主要侧重于Cas9蛋白的功能与活性、编辑效率和脱靶性等方面,而关于基因编辑修复的研究较少,多数方法仍完全依赖细胞自身的修复系统实现修复,缺乏人为干预和控制方面的研究,因此,基因编辑修复效率的提升十分有限。目前,利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的同源修复效率仅为0.1%-5%,较低的同源修复效率大大增加了获得基因编辑纯合子的细胞筛选的工作量,增加了基因编辑筛选和鉴定工作的人力和物力消耗。因此,亟需开发提高同源修复效率的基因编辑方法。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法。
p53基因是动物体内的抑癌基因,是细胞生长周期的负调节因子,与细胞周期的调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。RITA、CTX1和Nutlin-3是以p53蛋白为靶标的抑癌药物,在细胞内作为p53蛋白的小分子激动剂,以不同的方式与p53蛋白或p53蛋白信号通路蛋白相互作用,促进p53蛋白发挥功能。发明人在进行细胞基因编辑的研究过程中,根据细胞DNA的修复机制以及细胞周期的调控机制,结合生物信息学分析,对于影响DNA同源修复的物质进行了大量的筛选,意外地发现RITA、CTX1和Nutlin-3的体外添加对于人为、有目的地进行细胞基因编辑时的同源修复效率具有显著的提升作用。
首先,本发明提供RITA、CTX1、Nutlin-3中的一种或多种在细胞基因编辑中的应用,为通过将RITA、CTX1、Nutlin-3中的一种或多种添加至转染后培养基因编辑细胞的培养液中实现。
本发明中,所述基因编辑为通过同源修复实现的精准基因编辑。
本发明中,通过同源修复实现的基因编辑可以为任意一种利用人工手段、在进行靶基因的替换、缺失、插入等各种基因突变过程中涉及同源修复的基因编辑;可以通过任意的基因编辑方法实现,例如:CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的基因编辑,利用锌指核酸内切酶(ZFN)介导的基因编辑,类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)介导的基因编辑。
作为本发明的优选方案,所述基因编辑为CRISPR/Cas9介导的通过同源修复实现的基因编辑。
优选地,在所述转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液中,所述RITA的浓度为2~15nM;所述CTX1的浓度为0.2~1.5μM;所述Nutlin-3的浓度为0.5~10μM。
另一方面,本发明提供一种转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液,所述培养液包含p53蛋白小分子激动剂;所述p53蛋白小分子激动剂包括RITA、CTX1、Nutlin-3中的一种或多种。
本发明中,所述细胞转染包括采用任何物理、化学或生物方法将核酸导入细胞的过程,包括但不限于电转染、脂质体转染、病毒感染转染。
优选地,在所述转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液中,所述RITA的浓度为2~15nM;所述CTX1的浓度为0.2~1.5μM;所述Nutlin-3的浓度为0.5~10μM。以特定的浓度添加RITA、CTX1和Nutlin-3能够在更有效地提高同源修复效率的同时,保证细胞较高的生长活力。
本发明中,所述细胞转染培养液还包含基础培养液,所述基础培养液包含细胞生长所需的碳水化合物、氨基酸、维生素和无机盐离子。
本发明中,RITA、CTX1、Nutlin-3在细胞培养液中的发挥促进同源修复,提高基因编辑效率的功能并不依赖于特定的培养基组分,因此,上述基础培养液可以为任意本领域允许的、能够满足细胞生长需要的细胞培养液,包括但不限于任意商品化或非商品化的细胞培养液例如:DMEM/F12、DMEM、Opti-MEM、RPMI-1640等。
另一方面,本发明还提供所述细胞培养液在细胞基因编辑中的应用,其中,所述基因编辑为通过同源修复实现的基因编辑;所述细胞为动物细胞。
另一方面,本发明提供一种提高基因编辑同源修复效率的方法,为在将待导入核酸转染至细胞后,采用本发明所述的转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液培养细胞。
具体地,本发明所述的提高基因编辑同源修复效率的方法包括如下步骤:
(1)待转染细胞和待导入核酸的制备;
(2)待导入核酸与转染细胞混合后进行转染;
(3)采用本发明所述的转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液培养细胞。
(4)筛选细胞,得到基因编辑阳性细胞。
优选地,上述步骤(3)中,所述培养为在37℃培养24~72h;优选为48h。
作为本发明的一种实施方式,所述基因编辑为采用CRISPR/Cas9系统进行,所述提高基因编辑同源修复效率的方法包括如下步骤:
(1)待转染细胞和待导入核酸的制备:培养并获得待转染的悬浮细胞;制备待导入的Cas9/sgRNA质粒和修复模板DNA;
(2)将待转染细胞与Cas9/sgRNA质粒和修复模板DNA混合均匀,加入电转液中在电转仪上进行电转染;
(3)将转染后的细胞转移至所述转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液中,放入37℃细胞培养箱中培养48h;
(4)筛选细胞,得到基因编辑阳性细胞。
作为本发明的一种优选实施方式,上述步骤(2)中,将待转染细胞80万个与15μgCas9/sgRNA质粒和8μg修复模板DNA混合均匀,加入电转液中在电转仪上进行电转染。
本发明中,所述细胞为动物细胞。
所述动物细胞包括受精卵或体细胞。
所述动物细胞来源于哺乳动物,包括但不限于牛、羊、猴等大型哺乳动物、猪、鼠等小型哺乳动物和鸡、鸭、鹅等家禽。
优选地,所述动物细胞来源于鼠、猪、牛、羊、猴。
作为本发明的一种实施方式,所述细胞来源于羊。
本发明的有益效果在于:本发明通过在转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液中添加p53蛋白的小分子激动剂RITA、CTX1、Nutlin-3中的一种或多种,促进p53蛋白发挥正常的功能,使得DNA修复的平衡更倾向于同源修复,从而极大地提高了基因编辑过程的同源修复效率和同源修复纯合子的比例,进而提高了基因编辑效率,有效降低了阳性细胞的筛选工作量以及人力、物料、时间的消耗。以CRISPR/Cas9基因编辑方法为例,通过在细胞转染的培养液中添加p53蛋白的小分子激动剂使得定点修复效率最高达到了15%左右,比现有技术的一般同源修复率提高了2倍以上。
本发明提供的提高基因编辑同源修复效率的方法可以有效缩短细胞基因编辑和筛选过程,更好地满足细胞治疗和基因编辑动物规模化生产的需求;同时不涉及基因编辑系统自身以及其它操作过程的改造和优化,具有操作简便、成本低等优势,具有极大的应用价值和市场空间。
附图说明
图1为本发明实施例1中SSA-EGFP发生同源修复的示意图。
图2为本发明实施例1中利用SSA报告系统分析不同浓度的RITA、CTX1、Nutlin-3对同源修复效率的影响结果,其中A为分别添加DMSO、15nM的RITA、1.5μM的CTX1、10μM的Nutlin 3组细胞的流式细胞检测结果,B为添加不同浓度的RITA、CTX1和Nutlin 3的SSA同源修复效率统计结果。
图3为本发明实施例2中绵羊MSTN基因CRISPR/Cas9基因编辑打靶及同源修复模板结构示意图,图中所示序列为绵羊MSTN基因相应打靶位点(crRNA序列)以及该位点的PAM区段;LA和RA分别代表左同源臂和右同源臂,长度均为1kb,方框内为待整合的外源红色荧光标记基因mCherry。
图4为本发明实施例3中同源修复效率的流式检测结果,其中,A为添加DMSO以及添加Pifithrin-β的对照组、添加不同的p53激动剂的各实验组的流式细胞检测图;B为根据流式细胞检测结果进行的同源修复效率统计。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的,并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下,可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
实施例1不同浓度RITA、CTX1、Nutlin-3对同源修复效率的影响
为验证不同浓度RITA、CTX1、Nutlin-3对同源修复效率的影响,构建了基于同源修复的SSA报告系统(SSA-EGFP质粒),SSA报告系统的构建方法如文献Li G,Zhang X,Zhong Cet al.,Small molecules enhance CRISPR/Cas9-mediated homology-directed genomeediting in primary cells,Scientific Reports,volume 7,Article number:8943(2017)记载。将SSA-EGFP质粒导入细胞,如果细胞内发生同源修复,则细胞会发出绿色荧光(SSA-EGFP发生同源修复的示意图如图1所示),具体检测方法如下:
(1)待转染细胞和质粒制备:准备待转染的悬浮细胞以及待转染的SSA-EGFP质粒;
(2)待转染细胞(约80万个)与SSA-EGFP质粒(10μg)加入电转液中,在电转仪上进行电转染(电转程序V024);
(3)将转染后的细胞分别转移至添加RITA、CTX1或Nutlin-3的6孔板DMEM/F12细胞培养液中,放入37℃的细胞培养箱中培养48h,培养过程无需换液;RITA、CTX1、Nutlin-3各设置三个浓度水平,其中,RITA的浓度分别为2nM、10nM、15nM;CTX1的浓度分别为0.2μM、1μM、1.5μM;Nutlin-3的浓度分别为0.5μM、2μM、10μM;同时设置添加DMSO的对照组。
(4)流式细胞检测仪分析荧光强度,分析同源重组效率。
利用SSA报告系统分析不同浓度的RITA、CTX1、Nutlin-3对同源修复效率的影响结果如图2所示,DMSO对照组的同源修复效率为18.4%,RITA组:当浓度为15nM时,同源修复效率最高(23.7%);CTX1组:当浓度为1.5μM时,同源修复效率最高(48.3%);Nutlin 3组:当浓度为10μM时,同源修复效率最高(52.2%)。
实施例2绵羊MSTN基因同源修复模板的制备
以绵羊MSTN基因为例,分析RITA、CTX1、Nutlin-3对基因编辑过程中同源修复的影响。
针对绵羊MSTN基因的第三外显子设计CRISPR/Cas9打靶位点和相应的sgRNA(序列如SEQ ID NO.1所示),将合成的sgRNA连接至px330质粒(该质粒可由CBh启动子驱动表达Cas9,U6启动子启动sgRNA的转录,即可同时表达Cas9蛋白和sgRNA),得到px330-MSTN质粒。通过PCR扩增分别得到长度均为1000bp的左侧同源臂和右侧同源臂(左侧和右侧同源臂的序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示),以及长度为800bp的T2A-mCherry片段(序列如SEQ ID NO.4所示),将上述左侧同源臂、T2A-mCherry片段和右侧同源臂连接至puc-57质粒,得到同源修复质粒MSTN-T2A-mCherry,打靶位点、同源臂和插入基因的结构如图3所示。
实施例3绵羊MSTN基因编辑和同源修复效率检测
将实施例2构建得到的px330-MSTN质粒及MSTN-T2A-mCherry同源修复质粒共转染绵羊成纤维细胞,具体步骤如如下:
(1)采集胎龄约40d的绵羊胎儿进行组织块立体培养,用无菌眼科剪剪取4mm3绵羊胎儿皮肤组织,置于无菌培养皿中。
(2)用75%酒精浸泡15s,含双抗的PBS洗涤5次,去除表面血污、表皮及脂肪组织。
(3)在10cm的大培养皿中用剪刀将组织块剪碎,用接种针把组织块分散,使碎块均匀的贴附于培养皿底面。
(4)在培养皿中加5ml细胞培养液,置于37℃的含有5%CO2的培养箱中培养,待细胞长满整个培养皿后,观察细胞形态,并进行传代。
(5)加入2ml胰酶替代物,培养箱中静置5min,轻轻反复吹打使细胞完全脱壁,加入2ml培养液终止消化。
(6)将细胞混合液移入15ml离心管并以2000rpm/min的速度离心5min,弃去上清并加入4ml PBS缓冲液重悬细胞,再次离心5min。
(7)弃去上清,加入细胞培养液重悬细胞,按照1:3的比例分置于15ml离心管中,加入相应的培养液后即可继续培养。
(8)取上述培养获得的待转染细胞(约80万个绵羊成纤维细胞),以100μl电转液(电转试剂盒:BasicKit for Primary Mammalian Fibroblasts,Lonza公司,货号为VPI-1002)重悬,加入15μg的px330-MSTN质粒和8μg的MSTN-T2A-mCherry质粒,混匀。将待转染细胞和质粒的混合物置于NucleofectorTM2b电转仪(Lonza公司)进行电转染(电转程序:V024)。
(9)将转染后的细胞分别转移至添加RITA、CTX1、Nutlin-3中的一种或多种的6孔板DMEM/F12细胞培养液中,于37℃,5%的CO2条件下,培养48h。
分别设置7个实验组和2个对照组,具体如下:
RITA组:DMEM/F12细胞培养液中添加15nM的RITA;
Nutlin 3组:DMEM/F12细胞培养液中添加10μΜ的Nutlin 3;
CTX1组:DMEM/F12细胞培养液中添加1.5μM的CTX1;
RITA和CTX1组:DMEM/F12细胞培养液中添加15nM的RITA和1.5μM的CTX1;
RITA和Nutlin 3组:DMEM/F12细胞培养液中添加15nM的RITA和10μΜ的Nutlin 3;
Nutlin 3和CTX1组:DMEM/F12细胞培养液中添加1.5μM的CTX1和10μΜ的Nutlin3;
RITA、Nutlin 3和CTX1组:DMEM/F12细胞培养液中添加15nM的RITA、10μΜ的Nutlin 3和1.5μM的CTX1;
空白对照组:DMEM/F12细胞培养液中添加等体积的DMSO;
反向对照组:DMEM/F12细胞培养液中添加10μM的Pifithrin-β(p53蛋白的小分子抑制剂)。
(10)细胞培养48h后,采用流式细胞仪检测同源修复效率:如果外源基因T2A-mCherry成功整合至MSTN靶点(同源修复),绵羊的成纤维细胞会发出红色荧光,如果没有成功整合(未发生同源修复),细胞则没有红色荧光。
结果如图4所示,不添加p53蛋白激动剂而添加等体积的DMSO的空白对照组的同源修复效率为4.13%;添加Pifithrin-β的反向对照组的同源修复效率为2.7%;添加p53蛋白激动剂的各实验组的同源修复效率分别为:5.94%(RITA组)、8.56%(CTX1组)、8.01%(Nutlin 3组)、13.70%(RITA+CTX1组)、6.66%(RITA+Nutlin 3组)、7.75%(CTX1+Nutlin3组)和5.56%(RITA+CTX1+Nutlin 3组)。与空白对照组相比,添加p53蛋白激动剂的各实验组的同源修复效率均有显著提升,其中添加RITA和CTX的同源修复效率最高(13.70%),较空白对照组提高了2.3倍。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种提高CRISPR/Cas9介导的同源修复效率的方法
<130> KHP181117537.4
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gacatctttg taggagtaca gcaa 24
<210> 2
<211> 1000
<212> DNA
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tagggatggt acgccatatg caagttacca ttcctattct gattgataca gtacattaat 660
agtttatgcc aatggtgcta atacaatagg ctgaatggct gatgttatca ggtttatcaa 720
gcaaaaaaca ttcagtaaag taataagttt ctcctttctt caggtgcatt tttacactcc 780
tccctatggg caatggattt tccataaaga aagaaaaatc atttttctag aggtctacat 840
tcaattctgt agcatacttg gagaagctgt gtttaaaagg cagtcaaaaa gtattcattt 900
ttgtcaaaat ttcaaaatta tagcctgcct ttgcaatact gcagctttta ggatgaaata 960
atggaaatga ctgattctat caatattgta taaaaagatt 1000
<210> 4
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg cccagtgagc 60
aagggcgagg aggataacat ggccatcatc aaggagttca tgcgcttcaa ggtgcacatg 120
gagggctccg tgaacggcca cgagttcgag atcgagggcg agggcgaggg ccgcccctac 180
gagggcaccc agaccgccaa gctgaaggtg accaagggtg gccccctgcc cttcgcctgg 240
gacatcctgt cccctcagtt catgtacggc tccaaggcct acgtgaagca ccccgccgac 300
atccccgact acttgaagct gtccttcccc gagggcttca agtgggagcg cgtgatgaac 360
ttcgaggacg gcggcgtggt gaccgtgacc caggactcct ccctgcagga cggcgagttc 420
atctacaagg tgaagctgcg cggcaccaac ttcccctccg acggccccgt aatgcagaag 480
aagaccatgg gctgggaggc ctcctccgag cggatgtacc ccgaggacgg cgccctgaag 540
ggcgagatca agcagaggct gaagctgaag gacggcggcc actacgacgc tgaggtcaag 600
accacctaca aggccaagaa gcccgtgcag ctgcccggcg cctacaacgt caacatcaag 660
ttggacatca cctcccacaa cgaggactac accatcgtgg aacagtacga acgcgccgag 720
ggccgccact ccaccggcgg catggacgag ctgtacaagt ag 762
Claims (10)
1.RITA、CTX1、Nutlin-3中的一种或多种在细胞基因编辑中的应用,其特征在于,将RITA、CTX1、Nutlin-3中的一种或多种添加至转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液中;所述基因编辑为通过同源修复实现的基因编辑。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,在所述转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液中,所述RITA的浓度为2~15nM;所述CTX1的浓度为0.2~1.5μM;所述Nutlin-3的浓度为0.5~10μM。
3.一种转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液,其特征在于,所述培养液包含p53蛋白小分子激动剂;
所述p53蛋白小分子激动剂包括RITA、CTX1、Nutlin-3中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的细胞培养液,其特征在于,在所述转染后培养基因编辑细胞的细胞培养液中,所述RITA的浓度为2~15nM;所述CTX1的浓度为0.2~1.5μM;所述Nutlin-3的浓度为0.5~10μM。
5.根据权利3或4所述的细胞培养液,其特征在于,所述培养液还包含基础培养液,所述基础培养液包含细胞生长所需的碳水化合物、氨基酸、维生素和无机盐离子。
6.权利要求3~5任一项所述的细胞培养液在细胞基因编辑中的应用,其特征在于,所述基因编辑为通过同源修复实现的基因编辑;所述细胞为动物细胞。
7.一种提高基因编辑同源修复效率的方法,其特征在于,将待导入核酸转染至细胞后,采用权利要求3~5任一项所述的细胞培养液培养转染后的细胞。
8.根据权利要求7所述的方法,其特征在于,包括如下步骤:
(1)待转染细胞和待导入核酸的制备;
(2)待导入核酸与转染细胞混合后进行转染;
(3)采用权利要求3~5任一项所述的细胞培养液培养转染后的细胞;
(4)筛选细胞,得到基因编辑阳性细胞。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤(3)中,所述培养为在37℃培养24~72h;优选为48h。
10.根据权利要求7~9任一项所述的方法,其特征在于,所述细胞为动物细胞;优选地,所述细胞来源于鼠、猪、牛、羊或猴。
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2522726A1 (en) * | 2011-05-12 | 2012-11-14 | Fundació Privada Centre de Regulació Genòmica (CRG) | Zinc finger nucleases for p53 editing |
CN103269715A (zh) * | 2010-11-05 | 2013-08-28 | 邓迪大学 | 用于改进流感病毒和疫苗种子的生产的方法 |
US20140018302A1 (en) * | 2010-11-12 | 2014-01-16 | The Salk Institute For Biological Studies Intellectual Property And Technology | Cancer Therapies and Diagnostics |
CN105793437A (zh) * | 2013-09-23 | 2016-07-20 | 芝加哥大学 | 关于dna损伤制剂用于癌症治疗的方法和组合物 |
CN108441519A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-08-24 | 中国农业大学 | 在crispr/cas9基因编辑中提高同源修复效率的方法 |
-
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- 2019-04-08 CN CN201910277216.5A patent/CN111793606B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103269715A (zh) * | 2010-11-05 | 2013-08-28 | 邓迪大学 | 用于改进流感病毒和疫苗种子的生产的方法 |
US20140018302A1 (en) * | 2010-11-12 | 2014-01-16 | The Salk Institute For Biological Studies Intellectual Property And Technology | Cancer Therapies and Diagnostics |
EP2522726A1 (en) * | 2011-05-12 | 2012-11-14 | Fundació Privada Centre de Regulació Genòmica (CRG) | Zinc finger nucleases for p53 editing |
CN105793437A (zh) * | 2013-09-23 | 2016-07-20 | 芝加哥大学 | 关于dna损伤制剂用于癌症治疗的方法和组合物 |
CN108441519A (zh) * | 2017-11-15 | 2018-08-24 | 中国农业大学 | 在crispr/cas9基因编辑中提高同源修复效率的方法 |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
ARMIN等: "Reactivating p53 and Inducing Tumor Apoptosis (RITA) Enhances the Response of RITA-Sensitive Colorectal Cancer Cells to Chemotherapeutic Agents 5-Fluorouracil and Oxaliplatin", 《NEOPLASIA》 * |
JANE等: "A p53-independent role for the MDM2 antagonist Nutlin-3 in DNA damage response initiation", 《BMC CANCER》 * |
KARAN等: "Identification of a small molecule that overcomes HdmX-mediated suppression of p53", 《MOL CANCER THER》 * |
张惠展: "《基因工程 第4版》", 31 January 2017 * |
Also Published As
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