CN111790460B - 一种基于太赫兹超材料的微流控芯片、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种基于太赫兹超材料的微流控芯片、制备方法及其应用，其中微流控芯片的芯片本体上开设有样品池、清洗池、测量室以及废液池；样品池与测量室之间通过流入通道连通；清洗池与测量室之间通过清洗通道相连通；废液池与测量室之间通过流出通道相连通；测量室包括基底层和涂覆于基底层上的传感层；传感层为超材料亚波长金属周期阵列；将本发明的微流控芯片应用于贴壁细胞的浓度测量时，贴壁细胞通过流入通道流入测量室中，与超材料相接触，从高阻硅底部垂直入射的太赫兹波与超材料相互耦合导致电磁诱导透明效应；本发明具有工艺简单、操作简便的特点，可实现对贴壁细胞浓度快速测量。

Description

一种基于太赫兹超材料的微流控芯片、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物测量技术领域，具体涉及一种基于太赫兹超材料的微流控芯片、制备方法及其应用。
背景技术
生物体易受外界环境的影响，表现出生物信号的变化，并根据其浓度变化来维持生命体自身的稳定；当然，在生物工程领域里的科研及生产实践中,微生物细胞浓度的测量是一个经常遇到的问题，其对科研及生产实践产生了巨大的影响。由此，对细胞浓度测量的重要性油然而生。细胞浓度的测量方法大体上分为两种，一种是直接测量法，另一种是间接测量法。1.直接测量法从具体上分为4种：(1)细胞干重法，其原理是把一定体积的培养液离心、收集细胞、洗涤、干燥、称重；该方法测量的是所有细胞的浓度。(2)显微技术法，其原理是利用显微镜和血球计数器测定单位体积培养液中的细胞个数；该方法不适用于多细胞或丝状生物体的计数、也不能区分死细胞和活细胞。(3)平板计数法，其原理是将微生物培养液样品用无菌生理盐水进行一系列的稀释，取一定量的稀释液均匀地涂布在培养皿中的固体平板培养基上，经一段时间的培养，从平板上长出的菌落数、涂布的稀释液体积及稀释倍数可以算出培养液中的微生物浓度；该方法操作复杂。(4)浊度法，其原理是培养液的浊度或光密度与细胞的浓度成正比，因而可通过比色测定培养液中的细胞浓度；该方法测定的误差较大。2.间接测量法，其原理是培养基中存在较多的不溶性物质时，可以通过测定结构细胞的大分子物质(如蛋白质、RNA、DNA等)来确定细胞的浓度，采用这种方法时要确保测定组分在细胞中的含量基本保持不变。上述方法对贴壁细胞浓度测量的方法操作复杂、用时长、需消耗大量的试剂、难以定量分析、不具有通用性。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种基于太赫兹超材料的微流控芯片，结构巧妙合理，操作简便，能够用于贴壁细胞浓度的快速检测。
本发明的目的之二在于提供一种基于太赫兹超材料的微流控芯片的制备方法，制备过程简单。
本发明的目的之三在于提供一种基于太赫兹超材料的微流控芯片的应用，解决了对贴壁细胞浓度检测的方法操作复杂、用时长、需消耗大量的试剂、难以定量分析、不具有通用性的问题。使得测量操作得到简化，具有高效、简易、成本低等特点。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
技术方案一：
一种基于太赫兹超材料的微流控芯片，包括芯片本体，所述芯片本体上开设有样品池、清洗池、测量室以及废液池；所述样品池与所述测量室之间通过流入通道连通；所述清洗池与所述测量室之间通过清洗通道相连通；所述废液池与所述测量室之间通过流出通道相连通；
所述测量室包括基底层和涂覆于所述基底层上的传感层；待测液流出通道与基底层未涂覆传感层的部分用于贴壁细胞的测量；
所述传感层为超材料亚波长金属周期阵列；
所述流入通道、清洗通道和流出通道构成微流通道。
作为本发明的进一步改进，所述微流通道均采用聚二甲基硅氧烷材料制备而成。
作为本发明的进一步改进，整个所述微流通道的结构呈Y字型。
作为本发明的进一步改进，所述传感层亚波长金属周期阵列的单个周期结构由一个x方向长方形片和两个y方向长方形片组成；周期尺寸Px＝120μm，Py＝120μm,基底厚度h＝50μm，x方向长方形片的宽w1＝20μm,x方向长方形片的长L1＝180μm，y方向两长方形片的长L2＝L3＝85μm,宽w2＝w3＝20μm,y方向两长方形片分别与x方向长方形片相隔g1＝3μm,g2＝10μm，传感层的厚度t＝0.4μm。
作为本发明的进一步改进，基底层为高阻硅材料层；所述传感层为传感金层(金层下面的很薄钛层作为粘附材料)。
技术方案二：
一种基于太赫兹超材料的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
S1、在基底层上涂覆传感层：
a)根据仿真滤波器结构的材料、尺寸参数，利用L-Edit软件画光刻板版图；其中L-Edit软件以及利用L-Edit软件画光刻板版图的具体过程均为本领域公知常识，在此不做赘述；
b)光刻板画好之后，选取50μm厚度的5000Ω·cm的高阻硅作为基底；
c)对高阻硅片清洗及烘干；
d)在高阻硅片上旋涂涂胶，胶厚为1.68μm；
e)对涂好光刻胶的高阻硅片前烘，涂胶后的高阻硅片放于热板上，热板温度设定为110℃，前烘的时间为100s；
f)利用光刻掩膜版对烘好的高阻硅片曝光，曝光前测试光刻机的光功率为9mW，曝光时间为10s；其中利用光刻掩膜版对烘好的高阻硅片曝光的具体过程为本领域公知常识，且并非发明要点，在此不做赘述；
g)对高阻硅片后烘，曝光后的高阻硅片放于热板上，热板温度设定为100℃，后烘时间为80s；
h)对曝光后的光刻胶进行显影及烘干，显影时间为90s；其中对曝光后的光刻胶进行显影的具体操作为本领域公知常识，且并非发明要点，在此不做赘述；
i)利用等离子去胶机去掉显影后残留薄膜胶层，去胶机的功率为100w，打胶时间为40s；等离子去胶机的结构与使用方法为本领域公知常识，且并非发明要点，在此不做赘述；
j)用磁控溅射的方法，在显影后的图案表面溅射沉积厚度为20nm钛和0.4μm金；所述磁控溅射方法为本领域公知常识，在此不做赘述；
k)利用丙酮浸泡和超声去掉基板上的光刻胶，得到高阻硅片上的超材料阵列结构。
S2、在基底层上制备微流通道：
A.在SU-8胶上利用光刻技术得到微流控通道结构的阳模；
B.在阳模上浇注混合好的聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物，加热固化；
C.对固化后的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料从阳模上剥落；
D.得到聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具；
E.在聚二甲基硅氧烷(PDMS)层底部涂明胶；
F.将已经涂覆传感结构的高阻硅片与具有微流通道结构的聚二甲基硅氧烷层封接后就得到微流控芯片。
技术方案三：
一种基于太赫兹超材料的微流控芯片的应用，用于测量贴壁细胞浓度测量。
作为本发明的进一步改进，测量贴壁细胞浓度的方法包括如下步骤：
i.对所述样品池进行灭菌消毒处理；
ii.用注射器向样品池中注入不同浓度的贴壁细胞液；
iii.贴壁细胞液通过流入通道流向测量室，与传感层接触；
iv.从基底层底部垂直入射太赫兹波，太赫兹波与传感层超材料相互耦合导致电磁诱导透明效应，从而实现对贴壁细胞浓度的快速测量。
作为本发明的进一步改进，在对贴壁细胞浓度测量之前，对贴壁细胞液进行吹干处理。
进一步的，所述贴壁细胞液培养方法包括如下步骤：
I.首先将超净室工作台用紫外光照射灭菌20-30分钟；
II.关闭超净工作台内的紫外光灯，点燃酒精灯使所有操作均在酒精灯火焰下进行；
III.将消毒过的所用物品放入超净工作台中；
IV.将培养好的贴壁细胞培养皿放入超净工作台中；
V.用无菌吸管将细胞上原有的培养液吸净；
VI.取1毫升0.25％胰酶消化液放入培养皿中；
VII.将加有胰酶消化液的培养皿放入37℃温箱中消化1分钟；
VIII.从温箱中取出培养皿后，用手轻轻拍打培养皿的边缘；
IX.用倒置式显微镜观察细胞是否完全脱落；
X.待细胞完全脱离后，加入适量的含血清的培养基终止反应(优选为5:1，即培养基含量与血清含量质量比为5:1)；
XI.用吸头多次吹打，以使细胞完全散开为止，此悬浮液作为细胞母液；
XII.依次取5组培养不同天数的贴壁细胞液，并放入37℃、5％浓度的二氧化碳培养箱中传代培养。
与现有技术相比，本发明的优点及有益效果如下：
本发明中激励源太赫兹波的频率范围为0.4～1.2THz，太赫兹波电场极化方向为y方向，在太赫兹波激励下，在x方向长方形金属片与y方向的两长方形金属片组合中，x方向长方形金属片谐振表现为“暗模”，而y方向的两长方形金属片谐振表现为“明模”，明暗模之间相互耦合，产生破坏性干涉，实现EIT效应。贴壁细胞液通过流入通道流入测量室中，与超材料相接触，从高阻硅底部垂直入射的太赫兹波与超材料相互耦合导致电磁诱导透明效应(ETI效应)。由于超材料表现出对外界环境敏感等特性，当贴壁细胞浓度变化时，即贴壁细胞的折射率发生变化，在太赫兹时域光谱仪(THz-TDS)中可观察到透射峰的偏移。根据透射峰偏移量与折射率的关系，可计算出贴壁细胞浓度。
本发明将超材料传感技术与微流技术结合在一起，极大地简化了测量贴壁细胞浓度的步骤，从而实现设备的微型化、测量精细化；本发明的微流控芯片具有消耗待测液更少,测量速度快,易于操控等优势。而且，利用具有光子能量小的太赫兹波进行测量不会引起生物组织的光离化；聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料具有的低毒、生物相容性及对氧、二氧化碳等的通透性的，使得该芯片成为该项研究极为重要的平台。
本发明的太赫兹超材料具有结构简单、便于加工，利用太赫兹超材料与太赫兹波相互作用产生EIT效应以及光谱法，实现贴壁细胞浓度测量，在0～9.0×10^5cell/ml范围的贴壁细胞浓度测量具有可行性。
附图说明：
附图1是本发明的微流控芯片结构示意图；
附图2是附图1中A部分局部放大图；
附图3为附图2中B部分局部放大图；
附图4为附图3中C部分局部放大示意图；
其中：1-样品池；2-流入通道；3-清洗池；4-清洗通道；5-测量室；6-流出通道；7-废液池；10-传感层；11-基底层；12-太赫兹波；
附图5为本发明的制备方法过程示意图；
附图6为x方向长方形金属片、y方向两个长方形金属片组合、x方向和y方向三个长方形金属片组合透射谱线图；
附图7为在TE极化的太赫兹波激励下，谐振器组合结构在两透射谷0.89THz，1.04THz和透射峰0.99THz处的表面电流分布图；
附图8为5组不同浓度贴壁细胞样品的透射谱图；
附图9为5组不同贴壁细胞样品浓度对应的折射率、共振峰偏移量关系图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、详细地描述。所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例。
实施例1：制备基于太赫兹超材料的微流控芯片
如附图1-3所示，本实施例中基于太赫兹超材料的微流控芯片结构如下：包括芯片本体，所述芯片本体上开设有样品池1、清洗池3、测量室5以及废液池7；所述样品池1与所述测量室5之间通过流入通道2连通；所述清洗池3与所述测量室5之间通过清洗通道4相连通；所述废液池7与所述测量室5之间通过流出通道6相连通；所述测量室5包括高阻硅材料制备的基底层11和涂覆于所述基底层11上的传感层10；所述传感层10为金属金层；待测液流出通道与基底层11未涂覆传感层10的部分便于测量；所述流入通道2、清洗通道4、流出通道6构成微流通道；所述微流通道均采用聚二甲基硅氧烷材料制备而成；整个所述微流通道的结构呈Y字型。
如图4所示，所述传感层10为超材料亚波长金属周期阵列；阵列的单个周期结构由一个x方向长方形片和两个y方向长方形片组成；周期尺寸Px＝120μm，Py＝120μm,基底厚度h＝50μm，x方向长方形片的宽w1＝20μm,x方向长方形片的长L1＝180μm，y方向两长方形片的长L2＝L3＝85μm,宽w2＝w3＝20μm,y方向两长方形片分别与x方向长方形片相隔g1＝3μm,g2＝10μm，传感层10的厚度t＝0.4μm。
如图5所示，本实施例中的基于太赫兹超材料的微流控芯片的制备方法，包括如下步骤：
S1、在基底层11上涂覆传感层10：
a)根据仿真滤波器结构的材料、尺寸参数，利用L-Edit软件画光刻板版图；
b)光刻板画好之后，选取50μm厚度的5000Ω·cm的高阻硅作为基底；
c)对高阻硅片清洗及烘干；
d)在高阻硅片上旋涂涂胶，胶厚为1.68μm；
e)对涂好光刻胶的高阻硅片前烘，涂胶后的高阻硅片放于热板上，热板温度设定为110℃，前烘的时间为100s；
f)利用光刻掩膜版对烘好的高阻硅片曝光，曝光前测试光刻机的光功率为9mW，曝光时间为10s；
g)对高阻硅片后烘，曝光后的高阻硅片放于热板上，热板温度设定为100℃，后烘时间为80s；
h)对曝光后的光刻胶进行显影及烘干，显影时间为90s；
i)利用等离子去胶机去掉显影后残留薄膜胶层，去胶机的功率为100w，打胶时间为40s；
j)用磁控溅射的方法，在显影后的图案表面溅射沉积厚度为20nm钛和0.4μm金；
k)利用丙酮浸泡和超声去掉基板上的光刻胶，得到高阻硅片上的超材料阵列结构。
S2、在基底层11上制备微流通道：
A.在SU-8胶上利用光刻技术得到微流控通道结构的阳模；
B.在阳模上浇注混合好的聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物，加热固化；
C.对固化后的聚二甲基硅氧烷(PDMS)材料从阳模上剥落；
D.得到聚二甲基硅氧烷(PDMS)模具；
E.在聚二甲基硅氧烷(PDMS)层底部涂明胶；
F.将已经涂覆传感结构的高阻硅片与具有微流通道结构的聚二甲基硅氧烷层封接后就得到微流控芯片。
实施例2：
将实施例1中制备的基于太赫兹超材料的微流控芯片用于测量贴壁细胞浓度，具体方法包括如下步骤：
首先需要先制备贴壁细胞液，贴壁细胞液的培养方法包括如下步骤：I.首先将超净室工作台用紫外光照射灭菌20-30分钟；
II.关闭超净工作台内的紫外光灯，点燃酒精灯使所有操作均在酒精灯火焰下进行；
III.将消毒过的所用物品放入超净工作台中；
IV.将培养好的贴壁细胞培养皿放入超净工作台中；
V.用无菌吸管将细胞上原有的培养液吸净；
VI.取1毫升0.25％胰酶消化液放入培养皿中；
VII.将加有胰酶消化液的培养皿放入37℃温箱中消化1分钟；
VIII.从温箱中取出培养皿后，用手轻轻拍打培养皿的边缘；
IX.用倒置式显微镜观察细胞是否完全脱落；
X.待细胞完全脱离后，加入适量的含血清的培养基终止反应优选为5:1；
XI.用吸头多次吹打，以使细胞完全散开为止，此悬浮液作为细胞母液；
XII.依次取5组分别培养1天、3天、5天、7天、9天的贴壁细胞液，并放入37℃、5％浓度的二氧化碳培养箱中传代培养。
然后对贴壁细胞进行浓度测量，在对贴壁细胞浓度测量之前，对贴壁细胞液进行吹干处理，此做法是为了减少贴壁细胞液中的水对太赫兹波的吸收。
测量方法如下：
i.对所述样品池1进行灭菌消毒处理；
ii.用注射器向样品池1中注入不同浓度的贴壁细胞液；
iii.贴壁细胞液通过流入通道2流向测量室5，与传感层10接触；
iv.从基底层11底部垂直入射太赫兹波12，太赫兹波与传感层10超材料相互耦合导致电磁诱导透明效应，从而实现对贴壁细胞浓度的快速测量。
本发明的测量方法是光谱法，如图6所示，在TE极化的太赫兹波的激励下，单独的y方向上的两谐振长方形金属片的共振模式能够被激发，被激发的模式为“明模”，而单独x方向上的谐振长方形金属片的共振模式在外场激励下不能直接被激发，只能通过在y方向两谐振金属片与x方向一个谐振金属片组合结构中被“明模”间接激发，间接被激发的模式为“暗模”，明模式与暗模式谐振器之间的破坏性干涉产生电磁诱导透明效应，导致在一个宽的吸收峰中产生一个透明窗口。如图7所示，y方向两谐振金属片与x方向一个谐振金属片组合结构在两透射谷0.89THz，1.04THz和透射峰0.99THz处的表面电流分布，0.89THz处x方向金属片与其较近的金属片有向上的感应电流，辐射模式被激发，0.99THz处，非辐射模式被很好地被激发，并且这两种模式之间的相干干涉实现了EIT效应，在1.04THz,y方向表面电流朝内，x方向金属片表面电流朝外，非辐射模式转变为辐射模式，辐射模式占主导。
当贴壁细胞浓度在0～9.0×10^5cell/ml范围内，不同浓度贴壁细胞与相应的折射率有很好的线性关系，其关系式为：n＝C*10^(-8)+1.330,其中n为贴壁细胞的折射率，C为贴壁细胞的浓度，显然当C＝0，即没有贴壁细胞浓度，折射率n＝1.330；当贴壁细胞浓度大于9.0×10^5cell/ml，贴壁细胞的折射率n＝1.339将保持不变。
如图8所示，在CST软件中理论仿真了分析物厚度20μm折射率1.330，1.331,1.333,1.335,1.335,1.337,1.339及透过率曲线，随着折射率的增大，曲线发生明显的红移现象，即共振频率向减小方向移动。
如图9所示，以折射率为1.330共振峰频率为参照点，给出折射率分别为1.331,1.333.1.335,1.337,1.339相对折射率为1.330共振峰偏移量与贴壁细胞浓度的关系，随着浓度的增加，共振峰偏移量呈较好线性减小的趋势。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种基于太赫兹超材料的微流控芯片，包括芯片本体，其特征在于，所述芯片本体上开设有样品池(1)、清洗池(3)、测量室(5)以及废液池(7)；所述样品池(1)与所述测量室(5)之间通过流入通道(2)连通；所述清洗池(3)与所述测量室(5)之间通过清洗通道(4)相连通；所述废液池(7)与所述测量室(5)之间通过流出通道(6)相连通；所述测量室(5)包括基底层(11)和涂覆于所述基底层(11)上的传感层(10)；所述传感层(10)为超材料亚波长金属周期阵列；所述流入通道(2)、清洗通道(4)和流出通道(6)构成微流通道；
所述传感层(10)亚波长金属周期阵列的单个周期结构由一个x方向长方形片和两个y方向长方形片组成；周期尺寸Px＝120μm，Py＝120μm,基底厚度h＝50μm，x方向长方形片的宽w1＝20μm,x方向长方形片的长L1＝180μm，y方向两长方形片的长L2＝L3＝85μm,宽w2＝w3＝20μm,y方向两长方形片分别与x方向长方形片相隔g1＝3μm,g2＝10μm，传感层(10)的厚度t＝0.4μm；
所述微流通道均采用聚二甲基硅氧烷材料制备而成；
整个所述微流通道的结构呈Y字型。
2.根据权利要求1所述的基于太赫兹超材料的微流控芯片，其特征在于，基底层(11)为高阻硅材料层；所述传感层(10)为金属金层。
3.一种根据权利要求2所述的基于太赫兹超材料的微流控芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、在基底层(11)上涂覆传感层(10)：
a)根据仿真滤波器结构的材料、尺寸参数，利用L-Edit软件画光刻板版图；
b)光刻板画好之后，选取50μm厚度的5000Ω·cm的高阻硅作为基底；
c)对高阻硅片清洗及烘干；
d)在高阻硅片上旋涂涂胶，胶厚为1.68μm；
e)对涂好光刻胶的高阻硅片前烘，涂胶后的高阻硅片放于热板上，热板温度设定为110℃，前烘的时间为100s；
f)利用光刻掩膜版对烘好的高阻硅片曝光，曝光前测试光刻机的光功率为9mW，曝光时间为10s；
g)对高阻硅片后烘，曝光后的高阻硅片放于热板上，热板温度设定为100℃，后烘时间为80s；
h)对曝光后的光刻胶进行显影及烘干，显影时间为90s；
i)利用等离子去胶机去掉显影后残留薄膜胶层，去胶机的功率为100w，打胶时间为40s；
j)用磁控溅射的方法，在显影后的图案表面溅射沉积厚度为20nm钛和0.4μm金；
k)利用丙酮浸泡和超声去掉基板上的光刻胶，得到高阻硅片上的超材料阵列结构；
S2、在基底层(11)上制备微流通道：
A.在SU-8胶上利用光刻技术得到微流控通道结构的阳模；
B.在阳模上浇注混合好的聚二甲基硅氧烷预聚物，加热固化；
C.对固化后的聚二甲基硅氧烷材料从阳模上剥落；
D.得到聚二甲基硅氧烷模具；
E.在聚二甲基硅氧烷层底部涂明胶；
F.将已经涂覆传感结构的高阻硅片与具有微流通道结构的聚二甲基硅氧烷层封接后就得到微流控芯片。
4.一种如权利要求1-2任一项所述的基于太赫兹超材料的微流控芯片的应用，其特征在于，用于测量贴壁细胞浓度测量。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，测量贴壁细胞浓度的方法包括如下步骤：
i.对所述样品池(1)进行灭菌消毒处理；
ii.用注射器向样品池(1)中注入不同浓度的贴壁细胞液；
iii.贴壁细胞液通过流入通道(2)流向测量室(5)，与传感层(10)接触；
iv.从基底层(11)底部垂直入射太赫兹波(12)，太赫兹波与传感层(10)超材料相互耦合导致电磁诱导透明效应，从而实现对贴壁细胞浓度的快速测量。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在对贴壁细胞浓度测量之前，对贴壁细胞液进行吹干处理。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述贴壁细胞液培养方法包括如下步骤：
I.首先将超净室工作台用紫外光照射灭菌20-30分钟；
II.关闭超净工作台内的紫外光灯，点燃酒精灯使所有操作均在酒精灯火焰下进行；
III.将消毒过的所用物品放入超净工作台中；
IV.将培养好的贴壁细胞培养皿放入超净工作台中；
V.用无菌吸管将细胞上原有的培养液吸净；
VI.取1毫升0.25％胰酶消化液放入培养皿中；
VII.将加有胰酶消化液的培养皿放入37℃温箱中消化1分钟；
VIII.从温箱中取出培养皿后，用手轻轻拍打培养皿的边缘；
IX.用倒置式显微镜观察细胞是否完全脱落；
X.待细胞完全脱离后，加入适量的含血清的培养基终止反应；
XI.用吸头多次吹打，以使细胞完全散开为止，此悬浮液作为细胞母液；
XII.依次取5组培养不同天数的贴壁细胞液，并放入37℃、5％浓度的二氧化碳培养箱中传代培养。
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