CN111789870A - 响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法、蜂巢黄酮及作用 - Google Patents

响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法、蜂巢黄酮及作用 Download PDF

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Abstract

本发明属于超声提取技术领域,公开了一种响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法、蜂巢黄酮及应用,预测料液比1:30、乙醇浓度:60%、提取时间30min。本发明探讨超声提取蜂巢黄酮的最佳工艺并研究了蜂巢黄酮的抗氧化活性;在单因素实验的基础上,并根据响应面Box‑Benhnken原理,构建预测模型,进一步优化提取工艺,推动蜂巢资源开发利用。蜂巢黄酮的实际提取量为0.746%。本发明的方法提取出的蜂巢黄酮具有较强的羟基自由基清除能力、还原能力、抗菌能力。本发明以蜂巢为原料,采用响应面分析法对超声波提取蜂巢黄酮工艺进行优化,并分析提取的蜂巢黄酮抗氧化活性、抗菌能力作用。

Description

响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法、蜂巢黄酮及作用
技术领域
本发明属于超声提取技术领域,尤其涉及一种响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法、蜂巢黄酮及应用。
背景技术
蜜蜂巢脾是指由蜜蜂筑造的双面布满横切面为六角形巢房的脾状蜡质结构,是蜜蜂栖息、繁殖和储存食物的地方。由于在贮藏过程中果皮与蜂产品残渣的积累,随着养蜂代的增加,巢的颜色逐渐转变为棕色和黑色。蜂巢的组成成分较为复杂,有研究证实蜂巢中含有多糖、多酚、氨基酸、黄酮类等活性物质,并富含锌、硅、锰、钾、铜等微量元素。蜂巢作为中国传统中药材,其中发挥主要作用的活性物质是黄酮,其具有广谱抗菌作用,对大多数病原菌和病毒均有抑制生长的作用,能增强人体免疫力,并且还具有显著的抗氧化、抗炎、免疫调节等活性作用,被广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。
目前提取蜂巢黄酮常用的方法有溶剂提取法、微波辅助提取法、生物酶法和超临界流体提取法,这些方法耗时长、溶剂消耗量大、效率低;同时,高温也会破坏蜂巢的功能物质,不同的提取方式对提取时间的要求并不相同,例如索氏提取,一般在8小时左右,耗时长,浸泡则需要大量溶剂,生物酶法成本相对较高,微波在短时间会产生大量的热,导致高温,过高的温度会导致黄酮物质分解,效率也不明显。近年来,超声波提取方法逐渐进入公众视野,这是因为其在有机溶剂和吸附剂的使用、维护成本和能源消耗等方面的要求较低,反应时间较短,环保性能较好。超声波的优势与声学空化的产生有关,空化会导致固体基体表面的破坏或破碎,这一现象促进了分子从溶液到吸附剂的传质加速,使得吸附速率呈指数增长,平衡时间缩短。但超声效率受超声时间、料液比、溶剂浓度等具体参数的影响。
通过上述分析,现有技术存在的问题及缺陷为:目前提取蜂巢黄酮常用的方法耗时长、溶剂消耗量大、效率低;同时,高温也会破坏蜂巢的功能物质。
解决以上问题及缺陷的意义为:通过新的提取方式,并在其基础上进行优化,得出做好的提起工艺,对实际生产有很大的推动作用,提高蜂巢资源在相关领域的运用。
发明内容
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法、蜂巢黄酮及应用。
本发明是这样实现的,通过以下工艺流程所得:
干燥蜂巢粉0.5g→乙醇浸溶→超声波提取→抽滤过滤掉残渣A→滤液3000rpm/min离心5min→上清液A
残渣A→乙醇浸溶→超声波提取→抽滤过滤掉残渣B→滤液3000rpm/min离心5min→上清液B
残渣B→乙醇浸溶→超声波提取→抽滤过滤掉残渣C→滤液3000rpm/min离心5min→上清液C
冷却后将上清液A、B、C用90%乙醇定容于100mL棕色容量瓶中,待测
在提取工艺过程中,考虑溶剂浓度、料液比、提取时间三个提取因素不同水平对蜂巢黄酮含量的影响,选择所得蜂巢黄酮含量最佳的提取条件,在其基础上,根据响应面Box-Benhnken原理,构建模型,对提取工艺进行优化,得到回归方程:Y=-0.75-0.068A-0.042B-0.025C+0.013AB-2.10AC-0.020BC-0.13A2-0.069B2-0.079C2。得到预测值为料液比1∶29.76g/ml、乙醇浓度56.33%、提取时间28.88min。为了便于实际操作将优化工艺选择为提取时间30min,料液比1∶30g/ml、乙醇浓度60%。
本发明的另一目的在于提供一种由所述响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法提取的蜂巢黄酮。
本发明的另一目的在于提供一种所述蜂巢黄酮在对病原菌和病毒抑制生长中的用途。
本发明的另一目的在于提供一种所述蜂巢黄酮在增强人体免疫力中的用途。
本发明的另一目的在于提供一种所述蜂巢黄酮在抗氧化、抗炎、免疫调节活性作用中的用途。
结合上述的所有技术方案,本发明所具备的优点及积极效果为:本发明探讨超声提取蜂巢黄酮的最佳工艺并研究了蜂巢黄酮的抗氧化活性;在单因素实验的基础上,并根据响应面Box-Benhnken原理,构建预测模型,进一步优化提取工艺,推动蜂巢资源开发利用。结果表明:预测料液比1:29.76、乙醇浓度56.33%、提取时间28.88min,此条件下模型预测的蜂巢黄酮最大提取量为0.772%。最终优化工艺为提取时间30min,料液比1:30、乙醇浓度60%、此条件下蜂巢黄酮的实际提取量为0.746%,与理论值接近。本发明的方法提取出的蜂巢黄酮具有较强的羟基自由基清除能力和还原能力。本发明以蜂巢为原料,采用响应面分析法对超声波提取蜂巢黄酮工艺进行优化,并分析提取的蜂巢黄酮抗氧化活性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案,下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍,显而易见地,下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的乙醇浓度对总黄酮提取率的影响示意图。
图2是本发明实施例提供的料液比对总黄酮提取率的影响示意图。
图3是本发明实施例提供的提取时间对总黄酮提取率的影响示意图。
图4是本发明实施例提供的不同组合变量与黄酮提取量的关系响应曲面示意图;(a)、(b)和(c)不同因素两两相互作用对黄酮含量之间的影响。
图5是本发明实施例提供的蜂巢黄酮和Vc对羟基自由基抑制作用示意图。
图6是本发明实施例提供的蜂巢黄酮和Vc的还原能力示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题,本发明提供了一种响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法、蜂巢黄酮及应用,下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明提供的响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法包括以下步骤:预测料液比1:30、乙醇浓度:60%、提取时间30min。
本发明提供的响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施。
下面结合试验对本发明的技术方案作进一步的描述。
1材料与方法
1.1材料与试剂
蜂巢由江西汇仁集团提供。
芦丁标准品为光谱纯,硝酸铝、醋酸钾、无水乙醇DPPH、三氯乙酸、铁氰化钾、三氯化铁、水杨酸、邻苯三酚、抗坏血酸、硫酸亚铁、三羟甲基氨基甲酸(Tris)、双氧水、过硫酸钾、磷酸氢二钠,磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、无水碳酸钠、碳酸氢钠等均为分析纯。
1.2仪器与设备
FA2204B电子天平,上海精科天美科学仪器有限公司;GA-5200D超声波清洗机,无锡上佳生物科技有限公司;722G型可见分光光度计,上海仪电科学仪器股份有限公司;(型号)冷冻离心机,飞科科学仪器公司;HH-3数显恒温水浴锅,国华电器有限公司。
1.3试验方法
1.3.1总黄酮含量的测定
按照GB/T20574-2006标准方法进行测定。
1.3.1.1芦丁标准曲线的绘制
精密称取干燥至恒重的芦丁标准品10mg,用无水乙醇溶解并定容于50mL容量瓶中。此溶液中芦丁标准品浓度为0.2mg/mL。精密吸取上述芦丁标准品溶液1、2、3、4、5、6mL,分别置于50mL容量瓶中,加95%的乙醇至体积15mL,依次加100g/L的硝酸铝溶液1mL、9.8g/L的醋酸钾溶液1mL,摇匀,加蒸馏水定容至刻度。静置1h后,以30%乙醇溶液为空白对照,用1cm比色皿于415nm处测定吸光度。以总黄酮含量为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制标准曲线,线性回归方程为:y=0.4145x+0.001(R2=0.9997)
1.3.1.2蜂巢预处理
蜂巢经筛选去杂后置于-18℃下冷冻24h,在低温干燥状态下取样,快速粉碎,过200目筛,收集粉末,密封,于-18℃保存备用。
1.3.1.3蜂巢总黄酮提取
工艺流程:干燥蜂巢粉0.5g→乙醇浸溶→超声波提取→抽滤过滤掉残渣A→滤液3000rpm/min离心5min→上清液A
残渣A→无水乙醇浸溶→超声波提取→抽滤过滤掉残渣B→滤液3000rpm/min离心5min→上清液B
残渣B→无水乙醇浸溶→超声波提取→抽滤过滤掉残渣C→滤液3000rpm/min离心5min→上清液C
冷却后将上清液A、B、C用乙醇定容于100mL棕色容量瓶中,待测。
1.3.1.4黄酮得率的计算
精密吸取蜂巢提取液0.5mL于25mL容量瓶中,按上述方法测定样品中总黄酮含量。黄酮得率(%)按照以下公式计算:
Figure BDA0002627040940000051
式中:X-黄酮类化合物的总含量,%;m-由回归方程计算出样品比色液中总黄酮质量,mg;W-蜂巢质量,g;d-稀释倍数。
1.3.2蜂巢黄酮提取工艺优化
分别考察溶剂浓度、液料比、超声处理时间对提取率的影响,每次实验重复三次。
1.3.2.1乙醇浓度的选取
在料液比1:20、提取时间为20min的条件下,分别考察溶剂浓度为0%、20%、40%、60%、80%、100%的乙醇浓度对蜂巢黄酮提取率的影响,根据结果确定乙醇浓度。
1.3.2.2料液比的选取
在乙醇浓度60%,提取时间为20min的条件下,分别考察料液比为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60的料液比对蜂巢黄酮提取率的影响,根据结果确定料液比。
1.3.2.3提取时间的选取
在乙醇浓度60%、液料比1:30的条件下,分别考察提取时间为10min、20min、30min、40min、50min、60min对蜂巢黄酮提取率的影响,根据结果确定料液比。
1.3.3响应面法优化工艺条件
根据Box-Behnken试验设计原理进行三因素三水平试验设计,利用Design-Expert8.02软件进行数据拟合优化蜂巢黄酮提取工艺。在单因素试验的基础上,自变量的试验水平分别以-1、0、1进行编码,试验因素和水平见表1。
表1响应面试验水平因素
Figure BDA0002627040940000061
1.3.4抗氧化活性的研究
1.3.4.1清除羟基自由基
H2O2可与Fe2+生成有色物质,在510nm下有最大吸收,利用此原理对羟基自由基清除率进行测定。向体系中依次加入同样浓度8mmoL/L的FeSO4溶液和水杨酸-乙醇溶液各2mL,再加入体积分数0.03%的过氧化氢和不同质量浓度的蜂巢黄酮类化合物提取液各1mL。室温下反应0.5h,于510nm处测吸光度。
Figure BDA0002627040940000071
1.3.4.2还原力
取一定浓度的蜂巢黄酮类化合物提取液各1mL,分别吸取0.2moL/L磷酸盐缓冲液(pH6.6)和1%的三氯化铁各2.5mL混合50℃水浴20分钟,最后加2.5mL10%的三氯乙酸反应。吸2.5mL此溶液后,依次加入蒸溜水2.5mL和0.1%的FeCl30.5mL混匀后放置0.5h,在700nm处测吸光度As。加入蒸馏水空白对照,相同操作方法测得空白对照的吸光度Ac。实验以Vc为阳性对照。试验一式三份。吸光度值越高,还原能力越强。
1.4抑菌能力研究
1.4.1菌种来源
大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。由江西农业大学大学微生物学实验室提供。
1.4.2滤纸片法测定抑菌圈
滤纸片包扎为直径6mm的圆纸片,高温灭菌后,将滤纸片在不同浓度的蜂巢黄酮提取液中浸泡30min,取出、晾干。吸取0.2mL菌悬液滴于相应的培养基平板上。将滤纸片按蜂巢提取液浓度成正三角形放在培养基表面。浸有无菌水滤纸片作空白对照,恒温培养箱中培养,细菌[(36±1)℃,24h],酵母[37℃,48h]、霉菌[(28±1)℃,72h],测量抑菌圈直径[21]。
1.5数据处理
所有数据均为3次重复实验的平均值,运用Excel、SPSS数据处理软件和Design-Expert8.06统计软件进行数据分析。
2结果分析
2.1单因素实验
2.1.1乙醇浓度对总黄酮提取率的影响
由图1可知,随着乙醇浓度的增加,蜂巢总黄酮的提取率逐渐增大,当乙醇浓度为60%时,蜂巢总黄酮的提取率达最大,为0.836%;之后,随着乙醇浓度的增加,蜂巢总黄酮提取率逐渐下降。因此选择60%为蜂巢总黄酮提取的最佳乙醇浓度。
2.1.2料液比对总黄酮提取率的影响
由图2可知,在料液比为1:10至1:60的范围内,随着料液比的改变,总黄酮的提取率也发生改变,提取率分别为0.2%、0.409%、0.715%、0.683%、0.595%、0.433%。在料液比1:30的情况下提取率最高,但当料液比大于1:30时,总黄酮的提取率呈递减趋势。当料液比为1:60时,提取率下降至为0.433%。所以,选择1:30为蜂巢总黄酮的最佳料液比。
2.1.3提取时间对总黄酮提取率的影响
由图3可知,随着提取时间的增加,蜂巢总黄酮提取率的变化趋势是先迅速增加,到达提取率峰值之后开始下降,最后逐渐趋于不变。提取率由10min时的0.297%迅速增大到20min时的0.563%,然后缓慢增加为30min时的0.671%。当提取时间为40、50、60min时,提取率基本不再改变。所以,选择30min为蜂巢总黄酮的最佳提取时间。
2.2响应面分析
2.2.1响应面设计方案
选取乙醇浓度(A),料液比(B),提取时间(C)三个因素作为自变量,以蜂巢黄酮提取率作为响应值。Box-Benhnken试验设计与结果如表2所示。
表2 Box-Benhnken试验设计和结果
Figure BDA0002627040940000091
2.2.2方差分析及显著性检验
用软件Design-Expert.8.06对所得数据进行回归分析,分析结果如表3所示。对各因素进行回归拟合,得到回归方程:
蜂巢黄酮提取率(%)=-0.75-0.068A-0.042B-0.025C+0.013AB-2.10AC-0.020BC-0.13A2-0.069B2-0.079C2。该方程的二次项系数均为负数,说明抛物朝下,具有最大值,满足优化条件。由表4可知,回归模型方差分析显著性检验表明,该回归模型显著(p<0.0001),失拟项不显著(p=0.2319),表明该模型具有统计学意义。模型的确定系数R2=0.9848,R2 Adj=0.9651表明该模型拟合度较好,可以对超声波辅助提取蜂巢黄酮的工艺参数进行初步分析和预测。结果表明,方差的一次项A、B、二次项A2、B2、C2对响应值的影响极显著(P<0.01),C对响应值的影响显著(P<0.05)。三因素两两交互中BC项显著,说明提取时间和料液比两因素的交互作用影响显著。由F值可知各因素对蜂巢黄酮提取率的影响大小关系为:乙醇浓度>料液比>提取时间。
表3回归模型的方差分析
Figure BDA0002627040940000092
Figure BDA0002627040940000101
注:模型的确定系数R2=0.9848;模型的调整确定系数R2 Adj=0.9651;**差异极显著(p<0.01);*差异显著(p<0.05)。
2.2.3响应面优化分析
图4是各因素间交互作用的响应曲面3D分析图,等高线的形状可反映出交互作用的强弱,等高线呈椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形则表示不显著,同时有闭合的圆或椭圆表示有最大值。
图4显示,料液比处于0水平时,提取时间和乙醇浓度的交互作用并不强,当固定提取时间时,随着乙醇浓度增加,黄酮提取量也增大,但增大到一个峰值后又开始缓慢下降;响应面图显示,黄酮提取量在料液比的-1~0水平和乙醇体积分数的-1~0水平之间有最大值。提取时间与料液比的交互作用较弱,提取时间和料液比的交互作用显著。由Design-Expert8.0软件得出的黄酮的最佳提取条件为:料液比1:29.76、浸提乙醇浓度56.33%、提取时间28.88min,此条件下模型预测的最大提取量为0.772%。考虑到实际操作的局限性,将理论值修正为料液比1:30、乙醇浓度60%、提取时间30min,此条件下经试验验证,所得的蜂巢黄酮提取量为0.746%,与理论值接近,说明该模型能较好地预测实际提取量。
2.3蜂巢黄酮抗氧化活性测定
2.3.1清除羟基自由基
由图5可知,一定浓度范围内,OH·的清除率随蜂巢黄酮浓度的增加而增大,呈现一定的量效依赖关系,与已有的研究结果研究趋势类似。在相同浓度下,蜂巢黄酮较Vc的清除率要强。当羟基自由基清除率达到50%时,蜂巢黄酮和Vc所需的质量浓度分别是0.11mg/mL和0.33mg/mL,可见蜂胶黄酮较Vc具有更强的羟基自由基清除能力。
2.3.2还原力
由图6可知,一定浓度范围内,Vc和蜂巢黄酮的还原能力随浓度的增加而增大,呈现一定的量效依赖关系,该结果与曾林晖等研究结果基本一致。在相同浓度下,蜂巢黄酮比Vc的清除率要高。当质量浓度在同一水平时,蜂巢黄酮的吸光度远大于Vc,当吸光值达到0.45时,所需的蜂巢黄酮和Vc的浓度分别为0.012和0.048mg/mL,可见蜂巢黄酮具有较强的还原能力。
2.4蜂巢黄酮提取液的抑菌性
不同浓度的蜂巢黄酮提取液对供试菌的抑菌圈如表3所示,试验证实所用的蜂巢黄酮浓度对供试菌均有抑菌圈的存在。抑菌圈直径随着蜂巢黄酮提取液浓度的改变相应的发生变化,对金黄色葡萄球菌的抑制能力最强,蜂巢黄酮提取液的抗菌活性随浓度增加而增强;同浓度时,细菌的抑菌圈大于真菌,表明对细菌的抑制作用强于真菌。
表3蜂巢提取液的抗菌性(mm)
Figure BDA0002627040940000111
注:数据为5次试验平均值,“-”表示没有抑菌圈。
3结果
蜂巢作为一种中药材,在蜂巢中,黄酮类化合物是已知抗氧化特性及其有益的治疗特性的基础,它能够清除自由基,利用其功能性结构来对抗氧化应激,本试验通过响应面试验对超声波辅助提取蜂巢黄酮进行优化。在单因素试验的基础上,选定适合的影响因素和水平,建立了超声波辅助提取蜂巢黄酮的二次多项式数学模型,得到了超声波提取蜂巢黄酮的最佳工艺,并进行蜂巢黄酮抗氧化活性的研究。试验结果表明,超声提取时间、乙醇浓度、料液比对蜂胶黄酮提取率影响的大小关系是:乙醇浓度>料液比>提取时间。优化出的超声波辅助提取蜂巢黄酮的最佳工艺条件为:料液比1:29.76、浸提乙醇体积分数56.33%、提取时间28.88min,此条件下模型预测的最大提取量为0.772%。超声波提取得到的蜂巢黄酮具有较强的羟基自由基清除能力、还原能力、抗菌能力,是一种天然的抗氧化资源。
以上所述,仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法,其特征在于,所述响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法的预测料液比1:30、乙醇浓度:60%、提取时间30min。
2.一种由权利要求1所述响应面超声波辅助提取蜂巢黄酮方法提取的蜂巢黄酮。
3.一种如权利要求2所述蜂巢黄酮在对病原菌和病毒抑制生长中的用途。
4.一种如权利要求2所述蜂巢黄酮在增强人体免疫力中的用途。
5.一种如权利要求2所述蜂巢黄酮在抗氧化、抗炎、免疫调节活性作用中的用途。
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