CN101875958B

CN101875958B - 一种提高富硒产朊假丝酵母胞内谷胱甘肽含量的方法

Info

Publication number: CN101875958B
Application number: CN200910235175A
Authority: CN
Inventors: 卫功元; 葛晓光
Original assignee: Suzhou University
Current assignee: Suzhou University
Priority date: 2009-11-10
Filing date: 2009-11-10
Publication date: 2012-09-26
Anticipated expiration: 2029-11-10
Also published as: CN101875958A

Abstract

本发明属于微生物发酵领域，涉及一种富硒酵母发酵制备方法，具体公开了一种提高富硒产朊假丝酵母胞内谷胱甘肽含量的方法，出发菌株经斜面培养和种子培养后，接种在含有亚硒酸钠的发酵培养基中进行发酵培养至少24小时，其中，采用产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01为出发菌株，并且，在发酵液中添加L-谷氨酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸或L-谷氨酰胺中的一种，氨基酸添加时间为0～12小时，添加浓度2～16mmol/L。由于本发明所得富硒产朊假丝酵母能够在胞内积累谷胱甘肽，在补充硒的同时还可以提高畜禽的免疫力，因此将具有更为广阔的市场和应用前景。

Description

一种提高富硒产朊假丝酵母胞内谷胱甘肽含量的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，涉及一种富硒酵母发酵制备方法，具体涉及一种提高富硒产朊假丝酵母胞内谷胱甘肽含量的方法。

背景技术

硒和谷胱甘肽(GSH)对生物体有诸多益处。

硒是人体必需的14种微量元素之一，具有抗癌、保护心脏、抗肝坏死、防治近视和白内障、解毒、提高免疫力、延缓衰老和增强生殖功能等多种药理作用；硒是生物体内谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的重要组成部分，以硒代半胱氨酸的形式存在于其活性中心。GSH-Px可以分解生物体内的有害过氧化物，清除自由基，防止细胞膜氧化受损和体内重金属的积累。

谷胱甘肽作为一种重要的生理活性物质，在抗辐射、肿瘤、癌症、氧中毒、衰老和协调内分泌的治疗中效果明显且无副作用，可以广泛应用于医药、保健品、化妆品及食品和饲料添加剂等多种领域：(1)辅助治疗癌症，减少癌症化疗的副作用，增强治疗效果；(2)保护心脏、心血管，并能维持机体正常的血压水平；(3)抗衰老，可作为抗衰老保健品或者化妆品的活性成分；(4)对于重金属、农药和药物具有解毒作用；(5)抗病毒、提高免疫力；(6)保护视力、内脏及防治糖尿病和地方病；(7)食品及饲料添加剂中的硒对于提高人们健康水平、防止缺硒引起的各种疾病具有特殊意义，GSH在增强食品营养价值和强化食品风味的同时对人体又有保健作用，是食品抗氧化剂发展的必然趋势。

硒的补充可以通过摄入无机硒或有机硒而得以实现。无机硒的毒性较高，因而限制了它的广泛使用，有机硒的安全性能和利用率虽然远远优于无机硒，但纯的硒代蛋氨酸价格昂贵，因此必须寻找一种有机硒的廉价生产方法。利用微生物如酵母将无机硒生物转化为有机硒被认为是一条安全高效的途径。

现有技术中，富硒酵母的制备采用的是微生物富集法。生产方法是在酵母菌的培养基中添加适当浓度的亚硒酸钠等无机硒添加剂，在优化的培养条件下进行发酵以最大程度地将无机硒转化为酵母细胞内的有机硒，发酵结束后收集发酵液中的酵母细胞即为富硒酵母。富硒酵母细胞中的硒有90％以上是有机硒，其中50％左右以硒代蛋氨酸的形式存在，是无机硒有机化的理想载体，可以安全添加至食品或饲料中。

上述技术方案中，酵母细胞在将亚硒酸钠进行有机转化的同时，提高了谷胱甘肽过氧化物酶的活性，增加了胞内GSH的氧化；另外，亚硒酸钠也会导致GSH向胞外泄漏。因此，非常有必要采取相关措施在制备富硒酵母的同时提高胞内GSH含量。

产朊假丝酵母富含必需氨基酸和维生素，蛋白质含量达到520g/kg，并且脂肪含量低，其营养价值与鱼粉、黄豆不相上下。作为一种GRAS(美国食品药物主管机构给予的检验标记)安全生物，产朊假丝酵母被美国FDA(食品及药物管理局)认证为可作为食品添加剂的酵母，并能运用于食品和制药行业。

专利号为03113418.1的中国发明专利公开了一种提高产朊假丝酵母发酵生产谷胱甘肽产量的方法，采用产朊假丝酵母为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中进行摇瓶培养或发酵罐培养，在发酵培养基中添加L-半胱氨酸，增加发酵液中L-半胱氨酸的供应，以提高产品谷胱甘肽的合成速度和产量。该发明的优点是在其它培养条件相同的情况下，在发酵液中添加L-半胱氨酸后可以将谷胱甘肽的产量和胞内含量提高将近一倍，但是该发明无法同时提供有机硒；而且该发明是使用合成谷胱甘肽的前体氨基酸L-半胱氨酸以提高酵母发酵生产谷胱甘肽的产量。

因此，制备出能够在胞内积累谷胱甘肽的富硒产朊假丝酵母，在补充硒的同时还可以提高机体的免疫力，势必将具有更为广阔的市场和应用前景。

发明内容

本发明目的是提供一种提高富硒产朊假丝酵母胞内谷胱甘肽含量的方法。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案是：一种提高富硒产朊假丝酵母胞内谷胱甘肽含量的方法，出发菌株经斜面培养和种子培养后，接种在含有亚硒酸钠的发酵培养基中进行发酵培养至少24小时，其中，采用产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01为出发菌株，并且，在发酵液中添加L-谷氨酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸或L-谷氨酰胺中的一种，氨基酸添加时间为0～12小时，添加浓度2～16mmol/L。

上述技术方案中，所述菌株产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01由苏州大学工业微生物实验室保藏，该菌株已在文献(葛晓光，卫功元，聂敏，邵娜.富硒产朊假丝酵母的制备条件研究.粮食与饲料工业，2009，10：31-33)中公开。

上述技术方案中，发酵条件为：

(1)菌株：

产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01；

(2)培养基：

每1L所述斜面培养基含有：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，琼脂20g，所述斜面培养基pH为6.0～6.5；

每1L所述种子培养基含有：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏10g，所述种子培养基pH为6.0～6.5；

每1L所述发酵培养基含有：葡萄糖30g，硫酸铵8g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁0.25g，所述发酵培养基pH为5.5～6.0；

(3)种子培养：

斜面种子活化4小时后接入装有种子培养基的三角瓶中进行振荡培养，装液量为30～50mL种子培养基/500mL，培养温度25～30℃，摇床转速150～250rpm，培养时间18～24小时；

(4)发酵培养：

将过滤灭菌(滤膜直径0.25μm)的亚硒酸钠溶液加入发酵培养基(30～50mL培养基/500mL三角瓶)中，加入的量为：每1L所述发酵培养加入8～12mg亚硒酸钠；并按5～10％的接种量(10％为体积比，如40mL发酵培养基接种量4mL)接入种子，在摇床中进行发酵培养；培养温度25～30℃，摇床转速150～250rpm，培养时间24～30小时；在发酵培养的0～12小时，向培养液中添加L-谷氨酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸或L-谷氨酰胺中的一种，添加浓度2～16m mol/L。

上述技术方案中，所述斜面培养、种子培养和发酵培养都是现有技术，具体地，本领域技术人员可参考以下步骤，但以下步骤不以任何方式限制本发明，一种提高富硒产朊假丝酵母胞内谷胱甘肽含量的方法，具体包括以下步骤：

(1)菌株

产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01，苏州大学工业微生物实验室保藏；

(2)培养基

斜面培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，琼脂20g，pH 6.0；

种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，pH 6.0；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖30，硫酸铵8，磷酸二氢钾3，硫酸镁0.25，pH 5.5；

(3)种子培养

斜面种子活化4小时后接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中进行振荡培养，培养温度30℃，摇床转速200rpm，培养时间20小时；

(4)发酵培养

按照初始亚硒酸钠浓度为10mg/L的设计(即每1L所述发酵培养基加入10mg亚硒酸钠)，将过滤灭菌(滤膜直径0.25μm)的亚硒酸钠溶液加入发酵培养基(40mL培养基/500mL三角瓶)中，并按10％的接种量接入种子，在摇床中进行发酵培养；培养温度27℃，摇床转速200rpm，培养时间30小时；在发酵培养的0～12小时，向培养液中添加L-谷氨酸、L-酪氨酸、L-亮氨酸或L-谷氨酰胺中的一种，添加浓度2～16mmol/L；

(5)酵母生物量的测定

以细胞干重(DCW)表示酵母生物量。取25mL发酵液，3500rpm离心10min，蒸馏水离心洗涤3次，收集菌体，70℃烘干至恒重；

(6)胞内谷胱甘肽的提取及测定

发酵培养得到的新鲜酵母用蒸馏水洗涤3次后，30℃下在40％乙醇溶液中处理2小时，离心取上清液作为待测样品；谷胱甘肽采用DTNB[5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)]-谷胱甘肽还原酶循环法进行测定；

(7)样品的消化

取5mL发酵液，在3500rpm下离心10min，蒸馏水离心洗涤3次，收集湿菌体。将湿菌体置于小烧杯中并加入10mL混合酸(浓HNO₃∶浓HClO₄＝4∶1)，加热直到溶液上面有白烟时停止加热，此时溶液变成无色，冷却后，定容至50mL进行硒的检测；

(8)胞内总硒的测定

向25mL比色管中依次加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)溶液1mL、HCl-KCl缓冲液2mL、氯酸钾2mL、变色酸2mL、盐酸苯肼1mL和待测样品2mL，混匀，在沸水浴中加热20min，于冷水中迅速冷却后，利用酶标仪测定520nm下吸光值；

(9)胞内无机硒的测定

取10mL发酵液，3500rpm离心10min后收集菌体，蒸馏水离心洗涤3次；将湿菌体悬浮于5mL去离子水中，沸水浴30min，离心，测定上清液中硒的浓度；

(10)Se有机转化率的定义

上述技术方案中，当发酵培养基中添加的氨基酸为L-谷氨酸时，最佳添加时间为0小时，最佳添加浓度为12mmol/L；当发酵培养基中添加的氨基酸为L-谷氨酰胺时，最佳添加时间为0小时，最佳添加浓度为12mmol/L；当发酵培养基中添加的氨基酸为L-酪氨酸时，最佳添加时间为0小时，最佳添加浓度为14mmol/L；当发酵培养基中添加的氨基酸为L-亮氨酸中时，最佳添加时间为0小时，最佳添加浓度为10mmol/L。

由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点：

1.本发明在发酵培养富硒产朊假丝酵母时添加谷胱甘肽的前体氨基酸L-谷氨酸或者非前体氨基酸L-酪氨酸、L-亮氨酸及L-谷氨酰胺，富硒产朊假丝酵母的胞内谷胱甘肽含量均可以提高5倍以上，从而大大提高了富硒产朊假丝酵母的营养价值和应用前景。

2.本发明所得产朊假丝酵母可以广泛应用在食品和饲料添加剂中，由于本发明所得富硒产朊假丝酵母能够在胞内积累谷胱甘肽，在补充硒的同时还可以提高畜禽的免疫力，因此将具有更为广阔的市场和应用前景。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步描述：

实施例一：发酵制备富硒产朊假丝酵母，摇瓶中不添加氨基酸，具体包括以下步骤：

(1)菌株

(2)培养基

种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母膏10，pH 6.0；

(3)种子培养

(4)发酵培养

按照初始亚硒酸钠浓度为10mg/L的设计(即每1L所述发酵培养基加入10mg亚硒酸钠)，将过滤灭菌(滤膜直径0.25μm)的亚硒酸钠溶液加入发酵培养基(40mL培养基/500mL三角瓶)中，并按10％的接种量接入种子，在摇床中进行发酵培养；培养温度27℃，摇床转速200rpm，培养时间30小时；

(5)酵母生物量的测定

(6)胞内谷胱甘肽的提取及测定

(7)样品的消化

(8)胞内总硒的测定

(9)胞内无机硒的测定

(10)Se有机转化率的定义

结果：

细胞干重：9～10g/L；GSH产量：10～15mg/L；GSH含量：0.1～0.15％；Se有机转化率：88.9～90.2％。

实施例二：按照实施例一所述发酵条件制备富硒产朊假丝酵母，摇瓶中添加L-谷氨酸的实验结果：

添加时间：0小时～12小时；添加浓度：2～14mmol/L；

细胞干重：10～12.5g/L；GSH产量：15～110mg/L；GSH含量：0.2％～0.9％；Se有机转化率：89.7～91.3％。

最佳添加时间为0小时；最佳添加浓度为12mmol/L。

实施例三：按照实施例一所述发酵条件制备富硒产朊假丝酵母，摇瓶中添加L-酪氨酸的实验结果：

添加时间：0小时～12小时；添加浓度：2～16mmol/L；

细胞干重：9～10g/L；GSH产量：15～90mg/L；GSH含量：0.2％～0.9％；Se有机转化率：88.7～91.2％。

最佳添加时间为0小时；最佳添加浓度为14mmol/L。

实施例四：按照实施例一所述发酵条件制备富硒产朊假丝酵母，摇瓶中添加L-亮氨酸的实验结果：

添加时间：0小时～12小时；添加浓度：2～12mmol/L；

细胞干重：9～11g/L；GSH产量：15～80mg/L；GSH含量：0.2％～0.8％；Se有机转化率：88.9～90.1％。

最佳添加时间为0小时；最佳添加浓度为10mmol/L。

实施例五：按照实施例一所述发酵条件制备富硒产朊假丝酵母，摇瓶中添加L-谷氨酰胺的实验结果：

添加时间：0小时～12小时；添加浓度：2～14mmol/L；

细胞干重：9～11g/L；GSH产量：15～90mg/L；GSH含量：0.2％～0.8％；Se有机转化率：88.5～90.4％。

最佳添加时间为0小时；最佳添加浓度为12mmol/L。

上述所得产朊假丝酵母可以广泛应用在食品和饲料添加剂中，由于本发明所得富硒产朊假丝酵母能够在胞内积累谷胱甘肽，在补充硒的同时还可以提高畜禽的免疫力，因此将具有更为广阔的市场和应用前景。

Claims

1.一种提高富硒产朊假丝酵母胞内谷胱甘肽含量的方法，出发菌株经斜面培养和种子培养后，接种在含有亚硒酸钠的发酵培养基中进行发酵培养至少24小时，其特征在于，采用产朊假丝酵母(Candida utilis)SZU 07-01为出发菌株，并且，在发酵液中添加L-酪氨酸或L-亮氨酸中的一种，氨基酸添加时间为0～12小时，添加浓度2～16mmol/L。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵条件为：

将过滤灭菌的亚硒酸钠溶液加入发酵培养基中，加入的量为：每1L所述发酵培养基中加入8～12mg亚硒酸钠；并按5％～10％的接种量接入种子，在摇床中进行发酵培养，装液量为30～50mL发酵培养基/500mL；培养温度25～30℃，摇床转速150～250rpm，培养时间24～30小时；在发酵培养的0～12小时，向培养液中添加L-酪氨酸或L-亮氨酸中的一种，添加浓度2～16mmol/L。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基中添加的氨基酸为L-酪氨酸，添加时间为0小时，添加浓度为14mmol/L。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵培养基中添加的氨基酸为L-亮氨酸，添加时间为0小时，添加浓度为10mmol/L。