CN111773205A - 香草酸在制备抗血小板、抗血栓形成药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了香草酸在抗血小板、抗血栓形成药物制备中的应用。本发明公开了香草酸抗血小板和抗血栓形成在体外和体内的作用机制，发现香草酸可以减轻脑缺血导致的脑水肿及梗死体积，能显著降低由二磷酸腺苷(ATP)、花生四烯酸(AA)引起的血小板聚集，抑制钙离子浓度，降低脑缺血导致的P‑选择素过度表达。香草酸可用于制备治疗抗血小板、抗血栓形成药物，减少不良反应，为疾病的治疗和预防提供一种安全、有效、经济的解决办法。

Description

香草酸在制备抗血小板、抗血栓形成药物中的应用

技术领域

本发明涉及香草酸在制备药物中的新应用，主要涉及香草酸在制备抗血小板和血栓形成的药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

血小板在病理性血栓形成过程中具有重要的作用，血栓引起的缺血性疾病是导致我国中老年人死亡的主要原因，随着人口老龄化逐年增长的趋势，其对人类生命健康和生活质量产生严重威胁。针对血小板聚集的抗血小板治疗已成为血栓性疾病治疗的重要方向之一。

现有的抗血小板治疗药物都有其相应的局限性。包括对血小板功能较弱的抑制作用，例如阿司匹林，仅阻断血小板聚集信号传导的一条途径，同时，部分患者对阿司匹林具有抵抗效应；氯吡格雷，经体内代谢后发挥药效，代谢时间长，药效差异大；αIIbβ3拮抗剂，静脉注射，给药途径单一，患者依从性低，出血风险高。因此，这些限制了现有的抗血小板药物的应用。

血小板聚集率是通过比浊法来进行检测，搅拌条件下加入诱导剂后，血小板聚集，透过率增加，通过光电信号的转化测定血小板聚集，是一种广泛使用的检测血小板聚集功能的方法。凝血四项用于血栓性疾病的检查，包括活化部分凝血活酶时间(APTT)、纤维蛋白原(FIB)、凝血酶原时间(PT)、血浆凝血酶时间(TT)，检测凝血四项可以评价药物对凝血系统的影响。脑缺血是血栓引起的缺血性疾病之一，电凝法制备的大鼠脑缺血动物模型更加符合脑缺血的形成，通过对脑缺血大鼠的行为学，脑梗死面积，脑含水量进行考察，评价香草酸的抗血栓形成作用，钙离子水平与血小板的过度活化密切相关，P-选择素是反映血小板分泌功能的一个指标，通过对钙离子和P-选择素水平的检测，进一步评价香草酸的抗血小板作用。

香草酸(Vanillic acid,VA)是植物次生代谢产生的酚类化合物，化学名：4-羟基-3-甲氧基苯甲酸，分子式C₈H₈O₄，分子量168.14，白色针状晶体，无气味，能升华，不分解，熔点210℃。易溶于乙醇，可溶于乙醚，微溶于水。在食品工业中常作为香料、食品添加剂、防腐剂得到了广泛使用。香草酸广泛存在自然界中，如大米、草莓、甘蔗、芒果、小麦等，其化学结构式如下：

近年来，对香草酸的抗氧化作用、降压、肝保护和抗凋亡的作用有所报道，但对其在制备抗血小板和/或血栓形成药物中的作用尚未见报道

发明内容

本发明解决的技术问题在于提供香草酸在制备抗血小板、抗血栓形成药物中的应用，从而为抑制血小板过度激活、缺血性疾病的治疗提供一种不良反应轻微的解决办法。

为此，本发明提供了如下技术方案：

本发明技术方案的一方面是提供了如式Ⅰ所示的香草酸在制备抗血小板、抗血栓形成及防治血小板活化和血栓形成相关疾病的药物中的应用；

所述抗血小板作用是香草酸通过降低血小板胞浆钙离子浓度和P-选择素的表达而产生的抑制血小板聚集的药理作用。

所述抗血栓形成是香草酸对动脉血栓和静脉血栓形成的抑制作用，从而实现在制备预防或/和治疗血栓性疾病的药物中的应用。

所述血小板活化和血栓形成相关疾病，是指动脉和/或静脉血栓形成引起的疾病，包括缺血性脑卒中、急性/慢性心肌梗死、急性肺栓塞、周围血管血栓性疾病。

本发明技术方案的第二方面是提供了一种药物组合物在制备抗血小板、抗血栓形成及防治血小板活化和血栓形成相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物包括式I所示的香草酸和药学上可接受的载体或赋形剂，

所述的药物组合物包括口服制剂在内的经消化道给予的固体或半固体或溶液制剂，非经消化道给药剂型的其他剂型。

所述的口服制剂在内的经消化道给予的固体或半固体或溶液制剂包括片剂、缓释剂、胶囊剂、控释剂、滴丸剂、液体制剂；非经消化道给药剂型的其他剂型包括肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、皮肤给药、粘膜给药的制剂。

进一步，所述香草酸可与药学上可接受的辅料按常规制剂方法制成各种剂型的抗血小板和/或抗血栓形成药物。

该组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过发明所述香草酸与一种或多种制药上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅料组合，制成与人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-99％。

本发明化合物可以单位剂量形式给药，给药途径可以为胃肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

所述的药物剂型包括口服制剂，注射给药剂型，皮肤黏膜途径给药剂型。

根据权利要求7的应用，其特征在于：所属的口服制剂包括片剂、缓释剂、胶囊剂、控释剂、滴丸剂、液体制剂，所述的注射给药剂型包括肌肉注射、静脉注射、静脉滴注。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羧丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、酷酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-100mg/kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

本发明的有益效果在于：本发明采用体外和体内血小板聚集模型、电凝法制备的脑缺血模型，对香草酸抗血小板和/或抗血栓形成作用进行了考察，结果显示，通过口服给药香草酸可显著抑制花生四烯酸(AA)、二磷酸腺苷(ADP)引起的学小板聚集，显著降低血浆钙离子水平，显著降低脑缺血手术后的动物行为学评分，同时减轻由于脑缺血引起的脑水肿，降低脑梗死面积，所以为血小板过度活化和/或血栓疾病的的预防与治疗提供了一种安全、有效、经济的解决办法。

附图说明

图1.体外实验中香草酸对血小板聚集的影响。A—香草酸对ADP诱导的血小板聚集的影响；B—香草酸对AA诱导的血小板聚集的影响；C—香草酸对THR诱导的血小板聚集的影响。

图2.体内实验中香草酸对血小板聚集的影响。A—香草酸对ADP诱导的血小板聚集的影响；B—香草酸对AA诱导的血小板聚集的影响；C—香草酸对THR诱导的血小板聚集的影响。

图3.香草酸对大鼠血液凝血四项的影响。A—香草酸对APTT的影响；B—香草酸对TT的影响；C—香草酸对PT的影响；D—香草酸对FIB的影响。

图4.香草酸对电凝法制备的脑缺血大鼠行为学的影响。A—香草酸对手术后脑缺血大鼠的行为学影响；B—手术24小时后，香草酸对脑缺血大鼠的行为学影响。

图5.香草酸对电凝法制备的脑缺血大鼠血浆钙离子和血清P-选择素的影响。A—香草酸对脑缺血大鼠血浆钙离子水平的影响；B—香草酸对脑缺血大鼠血清P-选择素水平的影响。

图6.香草酸对电凝法制备的脑缺血大鼠脑梗死体积和脑含水量的影响。A—大鼠脑梗死体积TTC染色；B—香草酸对脑缺血大鼠脑含水量的影响；C—香草酸对脑缺血大鼠脑梗死体积的影响。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案、优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述。

实验例1.体外实验中香草酸对血小板聚集的影响。

实验选用雄性SD大鼠，体重200～220g，水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，加入3.8％枸橼酸钠溶液1:9(抗凝剂：血)用于抗凝，1200rpm，室温(23℃)离心10min，待离心结束后，用移液枪小心吸取上层，避免吸入血细胞，所得上层即为PRP(富血小板)，将剩余下层再次离心，3000rpm，室温(23℃)离心10min，用移液器小心吸取上层，既得PPP(贫血小板)。取PRP室温(23℃)离心，1800rpm，10min，弃上清，得到血小板测定，加入血小板重悬液(7.7772mg/mL NaCl，0.048mg/mL Na₂HPO₄，0.217mg/mL KCL，1.008mg/mL NaHCO₃，0.9mg/mL葡萄糖,，0.095mg/mL MgCl₂，4.766mg/mL HEPES，0.35％BSA)，即为洗涤血小板。通过LG-PABER-I半自动凝血分析仪(北京世帝科学仪器公司)采用比浊法在37℃条件下测定血小板聚集率，洗涤血小板与药物孵育5min，加入诱导剂，测定5min。诱导剂的终浓度如下，二磷酸腺苷(ADP)：5μM；花生四烯酸(AA)：5mM；凝血酶(THR)：0.75u/ml；。结果显示(附图1)，在体外情况下，香草酸可以显著抑制ADP和AA诱导的血小板聚集，但是对强诱导剂THR诱导的血小板聚集抑制作用较弱。

实验例2.体内实验中香草酸对血小板聚集的影响。

实验选用雄性SD大鼠，体重200～220g，随机分为6组，每组5只，空白对照组给予0.5％CMC-Na(100g/mL)，早晚各一次、阿司匹林组：100mg/kg，早晚各一次、氯吡格雷组：30mg/kg，早晚各一次、香草酸低剂量组：10mg/kg，早晚各一次、香草酸中剂量组：30mg/kg，早晚各一次、香草酸高剂量组：100mg/kg，早晚各一次，连续给药5天后，在第6天测定血小板聚集。按上述实验方法制备PRP，PPP，通过LG-PABER-I半自动凝血分析仪(北京世帝科学仪器公司)采用比浊法在37℃条件下测定血小板聚集率，PRP孵育5min，加入诱导剂，测定5min。诱导剂的终浓度如下，二磷酸腺苷(ADP)：5μM；花生四烯酸(AA)：5mM；凝血酶(THR)：0.75u/ml。结果显示(附图2)，在体内情况下，香草酸可以显著抑制ADP和AA诱导的血小板聚集，且具有剂量依懒性，但是对强诱导剂THR诱导的血小板聚集抑制作用较弱。

实验例3.香草酸对大鼠血液凝血四项的影响。

雄性SD大鼠，210～230g，随机分为6组，每组5只，空白对照组给予0.5％CMC-Na(100g/mL)，早晚各一次、阿司匹林组：100mg/kg，早晚各一次、氯吡格雷组：30mg/kg，早晚各一次、香草酸组：100mg/kg(有上述体内实验确定的最佳剂量)，连续给药5天后，于第六天大鼠用水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，加入3.8％枸橼酸钠溶液1:9(抗凝剂：血)用于抗凝，3000rpm，室温(23℃)离心10min，待离心结束后，用移液枪小心吸取上层用于凝血四项的检测。结果显示(附图3)，香草酸对APTT和TT没明显影响，可以轻微延长PT和降低FIB，说明丹酚A具有一定的降纤及抗血栓作用。

实验例4.香草酸对电凝法制备的脑缺血大鼠行为学的影响。

雄性SD大鼠，210～230g，随机分为6组，每组5只，空白对照组给予0.5％CMC-Na(100g/mL)，早晚各一次、阿司匹林组：100mg/kg，早晚各一次、氯吡格雷组：30mg/kg，早晚各一次、香草酸组：100mg/kg(有上述体内实验确定的最佳剂量)，连续给药5天后，于第六天大鼠用水合氯醛麻醉，取仰卧位固定。剪开颈部皮肤，钝性分离颈外静脉，颈总动脉与颈外动脉，用动脉夹夹闭颈外动脉。剥离颈总静脉，将其放入血管电击夹的沟槽内，调整好高度和方向，使用1.00mA电流强度，预刺激1min，在持续电刺激4min。电刺激结束后，取下电击夹，使用动脉夹夹闭颈总动脉的远心端，使用长度为1cm的软质镊子夹动血栓，使其变为小块血栓，并见动脉恢复搏动并冲击碎栓，放开动脉夹，见到血栓进入颈内动脉后立即夹闭颈总动脉近心端15min，然后打开所有动脉夹，缝合大鼠颈部皮肤，待其清醒后，立即进行mNSS行为学评分。24小时后，再次进行测定mNSS行为学评分。结果显示(附图4)，香草酸可以显著降低脑缺血大鼠手术后的mNSS行为学评分，对24小时后的大鼠mNSS行为学有降低趋势。

实验例5.香草酸对电凝法制备的脑缺血大鼠血浆钙离子和血清P-选择素的影响。

上述各组大鼠在手术后24小时测定行为学评分后，水合氯醛麻醉大鼠，腹主动脉取血，其中取3mL于肝素化的管中，3000rpm，于4℃离心10min，取上清，用于血浆钙离子水平的测定。取3mL于普通EP管中，室温凝聚，3000rpm，与4℃离心10min，取上清用于血清P-选择素的测定，结果显示(附图5)，香草酸可以明显降低血桨钙离子水平，可以降低血清P-选择素的水平。

实验例6.香草酸对电凝法制备的脑缺血大鼠脑梗死体积和脑含水量的影响。

上述各组大鼠在手术后24小时测定行为学评分后，处死大鼠，小心剥取全脑，称取全脑湿重，称量结束后，迅速于-40℃冷冻并切片。每片厚度2mm。脑组织切片后，使用0.5％TTC溶液于37℃孵育15min，更换4％多聚甲醛孵育20min。然后按顺序摆放切片并拍摄照片。在进行数据处理时，应用图像分析软件image J处理并计算每张脑片的梗塞面积，乘以每片脑片的厚度2mm，每只动物所有脑片梗塞面积乘以厚度相加，即为脑梗塞体积。梗塞体积以所占大脑半球的百分率来表示，按下述公式计算梗死面积。脑梗塞体积(％)＝梗死面积/全脑面积×100％。待拍照结束后，取每只大鼠的所有脑片与烘箱55℃烘烤48小时，然后称量烘干后的全脑干重，然后按照下述公式计算大鼠全脑含水量。大鼠全脑含水量(％)＝(全脑湿重－全脑干重)/全脑湿重×100％。结果显示(附图6)，香草酸可以降低脑缺血的脑梗死面积和全脑含水量。

综上所述，本发明采用体外实验、体内实验、电凝法制备的脑缺血大鼠模型对香草酸抗血小板和/或抗血栓形成药物的作用进行了考察，结果显示，体外实验中，通过血小板与香草酸预孵育，可以显著抑制由ADP和AA诱导的血小板聚集。体内实验中，通过提前灌胃给药香草酸可显著抑制由ADP和AA诱导的血小板聚集。凝血四项结果显示，香草酸对APTT和TT没明显影响，可以轻微延长PT和降低FIB，说明香草酸具有一定的降纤及抗血栓形成作用。同时，在电凝法制备的大鼠脑缺血模型中，香草酸可以明显降低大鼠手术后mNSS评分，显著降低血浆钙离子水水平，并能降低脑梗死面积和脑含水量，同时降低血小板表面的P-选择素的表达。因此，香草酸有抗血小板和/或抗血栓形成作用。以香草酸为活性物质，单独使用或/与其他具有药理学活性的化合物和/或提取物组成复方使用，按照药学领域的常规制剂方法制成各种剂型的抗血小板和/或抗血栓形成药物，或与其他抗血小板药物和/或抗血栓形成药物等制成复方制剂，用于在保持疗效的情况下减少药物作用中的不良反应，可为血小板的过度激活和/或血栓疾病的治疗预防与治疗提供了一种安全、有效、经济的解决办法。

最后说明的是，以上实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本非发明的优选实施例已对本发明进行了描述，但本领域普通技术人员应当理解，可以在实行上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求说明书所限定的本发明的精神和范围。

Claims (7)

1.如式Ⅰ所示的香草酸在制备抗血小板、抗血栓形成及防治血小板活化和血栓形成相关疾病的药品中的应用；

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述抗血小板作用是香草酸通过降低血小板胞浆钙离子浓度和P-选择素的表达而产生的抑制血小板聚集的药理作用。

3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述抗血栓形成是香草酸对动脉血栓和静脉血栓形成的抑制作用，从而实现在制备预防或/和治疗血栓性疾病的药物中的应用。

4.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述血小板活化和血栓形成相关疾病，是指动脉和/或静脉血栓形成引起的疾病，包括缺血性脑卒中、急性/慢性心肌梗死、急性肺栓塞、周围血管血栓性疾病。

5.一种药物组合物在制备抗血小板、抗血栓形成及防治血小板活化和血栓形成相关疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物包括式I所示的香草酸和药学上可接受的载体或赋形剂，

6.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的药物组合物包括口服制剂在内的经消化道给予的固体或半固体或溶液制剂，非经消化道给药剂型的其他剂型。

7.根据权利要求7的应用，其特征在于，所述的口服制剂在内的经消化道给予的固体或半固体或溶液制剂包括片剂、缓释剂、胶囊剂、控释剂、滴丸剂、液体制剂；非经消化道给药剂型的其他剂型包括肌肉注射、静脉注射、静脉滴注、皮肤给药、粘膜给药的制剂。

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