CN111763695A - 一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，公开了一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，包括如下步骤：将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选密封干燥保存；将处理好的甘蔗渣放入预处理溶液中进行预处理；预处理完成的甘蔗渣加入纤维素酶进行酶解；将酶解完成的甘蔗渣进行分步或同步糖化发酵；所述预处理溶液为磷酸钠溶液；本发明采用磷酸钠作为预处理溶液，预处理过程时间短，木质素去除率高，酶解效率也得到提升，有利于提高乙醇得率，且在乙醇发酵过程中耗时也更短。

Description

一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，更具体地，涉及一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法。

背景技术

近年来，由于经济社会快速发展，出现了化石燃料的供应紧缺、生态环境污染严重等问题。不可再生资源化石燃料日渐枯竭，而且化石燃料燃烧会产生一系列危害人类健康和造成环境污染的气体和颗粒物，例如CO₂、CO、NO₂、SO₂、碳粒和粉尘等。这一现象引起了世界各国的广泛关注，使得世界各国学者开始寻找可以替代化石燃料的绿色可再生物质^[3]。特别是我国，人口数量持续增加和人民生活水平全面提高，国内的能源很可能将会面临供应不足的问题，使得我国对能源的需求更加迫切。

木质纤维素等可再生生物质生产的新型生物燃料，即第二代生物乙醇燃料。植物生物量是地球上最丰富和未充分利用的生物资源之一，是最有希望的燃料和生物质原料。植物生物质虽然可以简单地燃烧以产生热量和电能，但是使用植物生物质生产液体生物燃料具有巨大的潜力，第二代生物燃料的生产不仅能显著减少化石燃料的燃烧和二氧化碳的产生，并且不与粮食作物竞争，由植物生物质生产的生物燃料和生物产品还将减轻全球变暖。但是，目前此类燃料的生产在实现其潜力之前，还有许多障碍需要克服。为了克服结构上的障碍并增强酶和微生物的可及性，预处理是必不可少的步骤，对整个生物转化过程中的其他所有操作都具有普遍影响。当第二代生物燃料的生产商业性化时，第二代生物燃料的成本可能与标准汽油，柴油相提并论，并且将是生产可再生低碳能源最具经济效益的途径。

我国的甘蔗资源十分丰富，是仅次于巴西和印度的世界第三大甘蔗种植国家。甘蔗是我国制糖产业主要的糖类原料，甘蔗渣则是甘蔗提取蔗汁后剩下的主要固体残渣废弃物，这部分废弃物约占总量的24-28％，是一种典型廉价的可再生生物质。

中国专利“一种以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法与应用”公开了一种以甘蔗渣为原料同步发酵生产乙醇和丁二酸的方法与应用。本发明是将甘蔗渣通过过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理，将其作为酵母菌发酵乙醇和丁二酸的碳源，添加在发酵培养基中，发酵培养基还含纤维素酶，发酵生产得到乙醇和丁二酸。本发明以甘蔗渣为原料，首次采用过硫酸氢钾联合脱乙酰化预处理甘蔗渣，高度有效，去除木质素和乙酰基的同时可保留住综纤维素，采用高底物结合低酶使用量的方式，显著降低了生产成本，同时实现乙醇和丁二酸的同步生产，提高了底物利用率和生产效率，对实现可持续发展有积极的经济和社会效益。

但上述发明在预处理过程需要采用过硫酸氢钾联合乙酰化预处理，还要在强碱条件下预处理，且预处理时间长，在后续发酵时耗时也长。

发明内容

本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷(不足)，提供一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，用于解决预处理过程复杂、预处理及发酵时间长的问题。

本发明采取的技术方案是，一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，包括如下步骤：

A.将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选密封干燥保存；

B.将步骤A处理好的甘蔗渣放入预处理溶液中进行预处理；

C.预处理完成的甘蔗渣加入纤维素酶进行酶解；

D.将酶解完成的甘蔗渣进行分步或同步糖化发酵；

所述预处理溶液为磷酸钠溶液。

进一步地，所述预处理溶液还可以为磷酸钠溶液与过氧化氢溶液的混合溶液。

进一步地，所述磷酸钠溶液的浓度为2～10％，所述过氧化氢溶液的浓度为0.5～2.5％。

进一步地，所述步骤B具体为：将步骤A处理好的甘蔗渣放入预处理溶液中，充分混匀后升温至60～140℃预处理20～100min，待反应结束后，冷却至室温，用布氏漏斗进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，置于60～80℃的烘箱中烘干至恒重。

进一步地，所述步骤B中甘蔗渣与预处理溶液的固液比为1：10。

进一步地，所述步骤C具体为：称取甘蔗渣样品置于干净的血清瓶中，经高温灭菌后，在血清瓶中加入已含有四环素和制霉菌素的乙酸-乙酸钠缓冲液及二代纤维素酶CTec2，然后在恒温培养箱中酶解，酶解完成后用沸水浴进行灭酶活处理，待冷却至室温后，高速离心收集上清液，加入H₂SO₄酸化处理后离心，离心后经滤膜过滤。

进一步地，所述步骤C具体为：准确称取0.5±0.0005g甘蔗渣样品置于干净的50ml血清瓶中，经高温121℃灭菌20min后，按底物浓度2％(w/v)的量，在血清瓶中加入25ml、pH4.8的已含有四环素和制霉菌素的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，然后在50℃，200rpm的恒温培养箱中酶解72h，然后沸水浴10min进行灭酶活处理，待冷却至室温后，12000rpm离心10min收集950μL上清液，加入50μL10％H₂SO₄酸化处理后离心，离心后经0.22μm滤膜过滤。

进一步地，步骤D中所述甘蔗渣进行分步糖化发酵的具体过程为：称取甘蔗渣0.5±0.0005g于血清瓶中，经121℃灭菌20min，冷却至室温。在无菌条件下，分别向血清瓶中加入25mL pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，在50℃，200rpm的条件下水解72h后，补加蛋白胨至浓度为20g/L，按照发酵液起始OD600为0.5的比例接入发酵菌种，混匀后于30℃，200rpm下进行乙醇发酵。

进一步地，步骤D中所述甘蔗渣进行同步糖化发酵的具体过程为：称取甘蔗渣0.5±0.0005g于血清瓶中，经121℃灭菌20min，冷却至室温。在无菌条件下，分别向血清瓶中加入25mL pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，使酶与底物充分混合后，加入无菌蛋白胨使其终浓度为20g/L，然后以发酵液起始OD600为0.5的比例接入发酵菌种，混匀后置于30℃恒温震荡培养箱中，200rpm下进行乙醇发酵。

进一步地，步骤D中所述发酵菌种的制备包括如下步骤：

1)菌种培养：将酿酒酵母1445的甘油菌按1％的接种量接入5mL的YPD培养基中，先在30℃，200rpm的恒温震荡培养箱中活化24h，然后按1％的接种量转接至100mL的YPD培养基中，在30℃，200rpm的恒温震荡培养箱中培养12h，即为发酵种子液；

2)菌体悬液的制备：在无菌条件下将上述发酵种子液在冷冻离心机于4℃，4800rpm离心2min，倒去上清液，菌体用无菌去离子水洗涤2-3次，然后对湿菌体进行称重，加入一定体积无菌去离子水制成菌体悬液，以接种量为4g/L进行发酵。

磷酸钠作为一种碱性盐，相对于其它碱性盐具有更强的碱性，且磷酸基团是一种强亲核基团，可以大大促进木质素的酚式b-芳基醚键的裂解，有效去除木质素，酶解效率更高，使得酶解出较多的葡萄糖更有利于制乙醇，从而提高乙醇得率。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明采用磷酸钠作为预处理溶液，预处理过程时间短，木质素去除率高，酶解效率也得到提升，有利于提高乙醇得率，且在乙醇发酵过程中耗时也更短。

附图说明

图1为本发明不同浓度磷酸钠预处理对酶解的总还原糖浓度和纤维素酶解效率的对比图。

图2本发明的实施例1及对比例1的甘蔗渣的SEM对比图。

图3为本发明的实施例1及对比例1的甘蔗渣的结晶度对比图。

图4为本发明的实施例1及对比例1的红外光谱对比图。

具体实施方式

本发明附图仅用于示例性说明，不能理解为对本发明的限制。为了更好说明以下实施例，附图某些部件会有省略、放大或缩小，并不代表实际产品的尺寸；对于本领域技术人员来说，附图中某些公知结构及其说明可能省略是可以理解的。

实施例1

一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，包括如下步骤：

1)将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200目的颗粒密封干燥保存；

2)称取5g甘蔗渣放入250ml的锥形瓶中，加入50ml的含有8％的磷酸钠，充分混匀后，于121℃预处理60min；

3)待反应结束后，立即冷却至室温，然后用布氏漏斗进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，置于60℃的烘箱烘干至恒重；

4)准确称取0.5g甘蔗渣样品置于干净的50ml血清瓶中，经高温121℃灭菌20min后，按底物浓度2％(w/v)的量，在血清瓶中加入25ml、pH 4.8的已含有四环素和制霉菌素的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，然后在50℃，200rpm的恒温培养箱中酶解72h，然后沸水浴10min进行灭酶活处理，待冷却至室温后，12000rpm离心10min收集950μL上清液，加入50μL10％H₂SO₄酸化处理后离心，离心后经0.22μm滤膜过滤；

5)称取甘蔗渣0.5g于血清瓶中，经121℃灭菌20min，冷却至室温。在无菌条件下，分别向血清瓶中加入25mL pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，在50℃，200rpm的条件下水解72h后，补加蛋白胨至浓度为20g/L，按照发酵液起始OD600为0.5的比例接入发酵菌种，混匀后于30℃，200rpm下进行乙醇发酵。

实施例2

一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，包括如下步骤：

1)将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200目的颗粒密封干燥保存；

2)称取5g甘蔗渣放入250ml的锥形瓶中，加入50ml的含有2％的磷酸钠，充分混匀后，于60℃预处理20min；

3)待反应结束后，立即冷却至室温，然后用布氏漏斗进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，置于75℃的烘箱烘干至恒重；

4)准确称取0.5g甘蔗渣样品置于干净的50ml血清瓶中，经高温121℃灭菌20min后，按底物浓度2％(w/v)的量，在血清瓶中加入25ml、pH 4.8的已含有四环素和制霉菌素的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，然后在50℃，200rpm的恒温培养箱中酶解72h，然后沸水浴10min进行灭酶活处理，待冷却至室温后，12000rpm离心10min收集950μL上清液，加入50μL10％H₂SO₄酸化处理后离心，离心后经0.22μm滤膜过滤；

5)称取甘蔗渣0.5g于血清瓶中，经121℃灭菌20min，冷却至室温。在无菌条件下，分别向血清瓶中加入25mL pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，使酶与底物充分混合后，加入无菌蛋白胨使其终浓度为20g/L，然后以发酵液起始OD600为0.5的比例接入发酵菌种，混匀后置于30℃恒温震荡培养箱中，200rpm下进行乙醇发酵。

实施例3

一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，包括如下步骤：

1)将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200目的颗粒密封干燥保存；

2)称取5g甘蔗渣放入250ml的锥形瓶中，加入50ml的含有10％的磷酸钠溶液，充分混匀后，于140℃预处理100min；

3)待反应结束后，立即冷却至室温，然后用布氏漏斗进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，置于80℃的烘箱烘干至恒重；

4)准确称取0.5g甘蔗渣样品置于干净的50ml血清瓶中，经高温121℃灭菌20min后，按底物浓度2％(w/v)的量，在血清瓶中加入25ml、pH 4.8的已含有四环素和制霉菌素的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，然后在50℃，200rpm的恒温培养箱中酶解72h，然后沸水浴10min进行灭酶活处理，待冷却至室温后，12000rpm离心10min收集950μL上清液，加入50μL10％H₂SO₄酸化处理后离心，离心后经0.22μm滤膜过滤；

5)称取甘蔗渣0.5g于血清瓶中，经121℃灭菌20min，冷却至室温。在无菌条件下，分别向血清瓶中加入25mL pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，在50℃，200rpm的条件下水解72h后，补加蛋白胨至浓度为20g/L，按照发酵液起始OD600为0.5的比例接入发酵菌种，混匀后于30℃，200rpm下进行乙醇发酵。

实施例4

一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，包括如下步骤：

1)将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200目的颗粒密封干燥保存；

2)称取5g甘蔗渣放入250ml的锥形瓶中，加入50ml的含有8％的磷酸钠和2％的过氧化氢，充分混匀后，于121℃预处理60min；

3)待反应结束后，立即冷却至室温，然后用布氏漏斗进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，置于60℃的烘箱烘干至恒重；

4)准确称取0.5g甘蔗渣样品置于干净的50ml血清瓶中，经高温121℃灭菌20min后，按底物浓度2％(w/v)的量，在血清瓶中加入25ml、pH 4.8的已含有四环素和制霉菌素的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，然后在50℃，200rpm的恒温培养箱中酶解72h，然后沸水浴10min进行灭酶活处理，待冷却至室温后，12000rpm离心10min收集950μL上清液，加入50μL10％H₂SO₄酸化处理后离心，离心后经0.22μm滤膜过滤；

5)称取甘蔗渣0.5g于血清瓶中，经121℃灭菌20min，冷却至室温。在无菌条件下，分别向血清瓶中加入25mL pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，在50℃，200rpm的条件下水解72h后，补加蛋白胨至浓度为20g/L，按照发酵液起始OD600为0.5的比例接入发酵菌种，混匀后于30℃，200rpm下进行乙醇发酵。

实施例5

一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，包括如下步骤：

1)将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200目的颗粒密封干燥保存；

2)称取5g甘蔗渣放入250ml的锥形瓶中，加入50ml的含有8％的磷酸钠，充分混匀后，于121℃预处理60min；

3)待反应结束后，立即冷却至室温，然后用布氏漏斗进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，置于60℃的烘箱烘干至恒重；

4)准确称取0.5g甘蔗渣样品置于干净的50ml血清瓶中，经高温121℃灭菌20min后，按底物浓度2％(w/v)的量，在血清瓶中加入25ml、pH 4.8的已含有四环素和制霉菌素的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，然后在50℃，200rpm的恒温培养箱中酶解72h，然后沸水浴10min进行灭酶活处理，待冷却至室温后，12000rpm离心10min收集950μL上清液，加入50μL10％H₂SO₄酸化处理后离心，离心后经0.22μm滤膜过滤；

5)称取甘蔗渣0.5g于血清瓶中，经121℃灭菌20min，冷却至室温。在无菌条件下，分别向血清瓶中加入25mL pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，使酶与底物充分混合后，加入无菌蛋白胨使其终浓度在20g/L，然后以发酵液起始OD600为0.5的比例接入发酵菌种，混匀后置于30℃，200rpm下进行乙醇发酵。

对比例1

仅将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选100～200颗粒密封干燥，不做预处理。

对比例2

将实施例1中的磷酸钠替换为碳酸钠，其它实施条件与实施例1一致。

将经过对比例2处理的甘蔗渣进行酶解、发酵，结果发现经对比例2处理的甘蔗渣酶解效率明显低于实施例1的，发酵后乙醇浓度也低于实施例1的。

将实施例1～3及对比例1处理后的甘蔗渣进行酶解，不同预处理对甘蔗渣成分和酶解效果的影响如表1所示。

表1不同预处理对甘蔗渣成分和酶解效果的影响

未预处理的甘蔗渣中含有34.15％纤维素、29.38％半纤维素和24.80％木质素。甘蔗渣经过不同浓度磷酸钠预处理后，各成分发生了明显变化。随着磷酸钠浓度的升高，固体回收率呈下降的趋势(表1)，磷酸钠浓度2％增加到10％，固体回收率从81.92％降低到66.99％。随着磷酸钠浓度的升高，木质素的含量明显降低，当磷酸钠浓度从2％增加到10％时，木质素的含量从21.04％降低到7.07％，与之相应，木质素的去除率从27.46％增加到76.58％。表明磷酸钠预处理能够有效地去除木质素，而且提高磷酸钠浓度能够增加木质素的去除率。然而，当Na₃PO₄浓度从8％增加到10％时，木质素含量并没有显着差异，表明继续增加Na₃PO₄浓度不会提高木质素的去除率，这与先前的研究结果一致。Na₃PO₄预处理能够去除木质素，是因为Na₃PO₄作为碱盐，能使细胞壁基质中的酯键和糖苷键裂解，从而导致木质素结构的改变，导致纤维素的溶胀和纤维素的部分脱结晶。因此，磷酸钠能够明显破坏木质纤维素的内部结构，并且去除了大部分木质素。

随着木质素的去除，葡聚糖含量也随磷酸钠浓度的升高而升高，当磷酸钠浓度从2％升高到8％时，葡聚糖的含量从38.86％显著增加到45.96％，但当磷酸钠浓度从8％增加到10％，葡聚糖含量不再明显增加。当10％Na₃PO₄预处理SCB时，葡聚糖含量达到最高为46.51％。木聚糖随着磷酸钠浓度的升高，含量缓慢增加，当磷酸钠浓度从2％增加到10％时，木聚糖含量从31.82％增加到37.02％。当10％Na₃PO₄预处理SCB时，达到最高的木聚糖含量为36.36％。

综上所述，Na₃PO₄对甘蔗渣进行预处理，可以使木质纤维素的结构发生改变，有效地去除木质素，提高纤维素和半纤维素所占比例。当10％Na₃PO₄预处理SCB时，葡聚糖和木聚糖的含量达到最高，木质素的去除率也达到最高。

不同浓度磷酸钠预处理对酶解的总还原糖浓度和纤维素酶解效率影响如图1所示。由图可知，未预处理的甘蔗的纤维素酶解效率和总还原糖只有9.23％和0.62g/L。经过Na₃PO₄预处理的底物，纤维素的酶解效率和总还原糖浓度明显升高。当Na₃PO₄浓度为2％时，总还原糖浓度为3.82g/L，纤维素的酶解效率为20.42％。Na₃PO₄浓度从2％增加到8％时，总还原糖浓度从3.12g/L增加到11.92g/L，纤维素的酶解效率达到72.94％。当Na₃PO₄浓度从8％增加到10％时，酶解效率增加无显著性差异(p>0.05)，总还原糖浓度从11.92g/L轻微增加到12.11g/L,纤维素的酶解效率从72.94％轻微增加到73.09％。

采用场发射扫描电子显微镜SEM观察实施例1及对比例1预处理后的甘蔗渣的表面形态结构，如图2(Aa表示对比例1，Bb表示实施例1)所示：

对比例1(A,a)甘蔗渣的SEM图显示出高度有序，表面光滑完整、无孔且规则排列的纤维结构，表面还吸附着多个尘土颗粒。经过磷酸钠预处理后，实施例1(B,b)甘蔗渣的形态结构发生了明显变化，甘蔗渣的尺寸变小，高度不规则，表面出现明显的分裂、断裂、多孔结构。研究表明甘蔗渣的表面积越大，粗糙程度越高，就能增加纤维素酶对甘蔗渣的接触面积，从而提高酶解效率。因此，磷酸钠预处理(实施例1)的甘蔗渣表面结构受到严重破坏，能够增加酶对底物的可及性，最大化的促进酶解。

利用X-射线衍射法对实施例1及对比例1预处理后的甘蔗渣的结晶度进行测定，如图3(A表示对比例1，B表示实施例1)所示：

结晶度能够表征纤维素晶体的结晶区和无定形区的比例，结晶区范围越大则结晶度越高，结晶区和无定形区的比值决定纤维素的结晶系数(CrI)。不同预处理前后甘蔗渣的X-衍射图谱没有发生明显变化，均有两个典型的纤维素峰面，分别在16°和22°处，说明经过不同预处理后甘蔗渣的晶体类型没有发生变化。未处理的甘蔗渣(对比例1)的CrI为52.36％，经过磷酸钠预处理(实施例1)，甘蔗渣纤维素的结晶度增至57.82％，结晶度的增加是由于磷酸钠预处理甘蔗渣去除了更多的木质素和非结晶半纤维素等无定形成分。

利用傅里叶红外光谱对实施例1及对比例1预处理后的甘蔗渣的物质组成和结构进行分析，如图4(A表示对比例1，B表示实施例1)所示：

利用FTIR检测预处理前后甘蔗渣的化学官能团的变化、特征峰的数量和强度分析木质素和碳水化合物中发生的化学变化。不同预处理前后甘蔗渣成分在4000-500cm^-1波数范围的红外光谱图如图3所示。

波数3420cm^-1和2914cm^-1附近的宽带与羟基伸展振动和亚甲基的不对称伸展振动有关，波数在1648cm^-1、1382cm^-1、1029cm^-1、899cm^-1分别表示吸收水的弯曲振动、CH弯曲振动、C-O、C-C振动和C-O-C伸展振动。木质素相关峰在波数1725cm^-1，是半纤维素的羧基与木质素的酚羟基之间形成的糖醛酸酯键振动，波数1604cm^-1和1514cm^-1来源于木质素中的芳族骨架结构振动，波数1240cm^-1和831cm^-1处振动是由于木质素与碳水化合物间中的β-酯键振动和木质素结构中的丁香基团振动。不同预处理后的甘蔗渣波数2914cm^-1和899cm^-1处的振动有不同程度地增强，这跟甘蔗渣中碳水化合物含量的增加有关。与未预处理甘蔗渣(对比例1)相比，经磷酸钠预处理甘蔗渣(实施例1)，其峰在波数831cm^-1、1604cm^-1处的振动均消失了，波数1725cm^-1、1514cm^-1、1240cm^-1处的振动明显减弱或几乎消失，这些与木质素相关峰的减弱或几乎消失表明磷酸钠预处理(实施例1)去除了甘蔗渣样品中的大部分木质素。

分别对实施例1～5及对比例1～2的甘蔗渣酶解后糖浓度及发酵后乙醇浓度(乙醇得率)进行测定，发现单独使用磷酸钠预处理时(实施例1-3)随着磷酸钠浓度的增加，酶解效率逐渐增加，当Na₃PO₄为10％时，总还原糖浓度和纤维素酶解效率最高。但是8％Na₃PO₄与10％Na₃PO₄预处理SCB的酶解效率无显著性差异，考虑到成本因素，我们认为Na₃PO₄浓度为8％时最佳，此时总还原糖浓度和纤维素酶解效率分别为11.92g/L和72.94％。与对比例1-2比较，对比例1为未处理的甘蔗渣，其酶解效率显著弱于其它方案。同等浓度下磷酸钠(实施例1)和碳酸钠(对比例2)相比，磷酸钠预处理后的酶解效率优于碳酸钠预处理的。作为更优选方案(实施例4)，加入过氧化氢混合预处理后，总还原糖浓度和酶解效率，均优于实施例1和3，达到14.55g/L和82.22％。

发酵后乙醇得率趋势与酶解效率的趋势一致，实施例4的乙醇浓度最高，优于实施例1和3。同等浓度下，磷酸钠预处理(实施例1)优于碳酸钠预处理(对比例2)。对比例1的乙醇浓度最低。由于同步糖化发酵工艺中(实施例5)酶解效率过低，最终乙醇浓度也远低于相同预处理条件却采用分步糖化发酵的结果(实施例1)。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A.将甘蔗渣风干后进行粉碎，筛选密封干燥保存；

B.将步骤A处理好的甘蔗渣放入预处理溶液中进行预处理；

C.预处理完成的甘蔗渣加入纤维素酶进行酶解；

D.将酶解完成的甘蔗渣进行分步或同步糖化发酵；

所述预处理溶液为磷酸钠溶液。

2.根据权利要求1所述的一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，其特征在于，所述预处理溶液还可以为磷酸钠溶液与过氧化氢溶液的混合溶液。

3.根据权利要求2所述的一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，其特征在于，所述磷酸钠溶液的浓度为2～10％，所述过氧化氢溶液的浓度为0.5～2.5％。

4.根据权利要求1-3任一所述的一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，其特征在于，所述步骤B具体为：将步骤A处理好的甘蔗渣放入预处理溶液中，充分混匀后升温至60～140℃预处理20～100min，待反应结束后，冷却至室温，用布氏漏斗进行固液分离，固体部分用热水洗至中性，收集固体残渣，置于60～80℃的烘箱中烘干至恒重。

5.根据权利要求4所述的一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，其特征在于，所述步骤B中甘蔗渣与预处理溶液的固液比为1：10。

6.根据权利要求1所述的一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，其特征在于，所述步骤C具体为：称取甘蔗渣样品置于干净的血清瓶中，经高温灭菌后，在血清瓶中加入已含有四环素和制霉菌素的乙酸-乙酸钠缓冲液及二代纤维素酶CTec2，然后在恒温培养箱中酶解，酶解完成后用沸水浴进行灭酶活处理，待冷却至室温后，高速离心收集上清液，加入H₂SO₄酸化处理后离心，离心后经滤膜过滤。

7.根据权利要求6所述的一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，其特征在于，所述步骤C具体为：准确称取甘蔗渣样品置于干净的50ml血清瓶中，经高温121℃灭菌20min后，按底物浓度2％(w/v)的量，在血清瓶中加入25ml、pH 4.8的已含有四环素和制霉菌素的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，然后在50℃，200rpm的恒温培养箱中酶解72h，然后沸水浴10min进行灭酶活处理，待冷却至室温后，12000rpm离心10min收集950μL上清液，加入50μL10％H₂SO₄酸化处理后离心，离心后经0.22μm滤膜过滤。

8.根据权利要求1所述的一种用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，其特征在于，步骤D中所述甘蔗渣进行分步糖化发酵的具体过程为：称取甘蔗渣于血清瓶中，经121℃灭菌20min，冷却至室温。在无菌条件下，分别向血清瓶中加入25mL pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，在50℃，200rpm的条件下水解72h后，补加蛋白胨至浓度为20g/L，按照发酵液起始OD600为0.5的比例接入发酵菌种，混匀后于30℃，200rpm下进行乙醇发酵。

9.根据权利要求1所述的用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，其特征在于，步骤D中所述甘蔗渣进行同步糖化发酵的具体过程为：称取甘蔗渣于血清瓶中，经121℃灭菌20min，冷却至室温。在无菌条件下，分别向血清瓶中加入25mL pH为4.8的乙酸-乙酸钠缓冲液，按照30FPU/g加入二代纤维素酶CTec2，使酶与底物充分混合后，加入无菌蛋白胨使其终浓度为20g/L，然后以发酵液起始OD600为0.5的比例接入发酵菌种，混匀后置于30℃恒温震荡培养箱中，200rpm下进行乙醇发酵。

10.根据权利要求8或9所述的用磷酸钠预处理甘蔗渣制备乙醇燃料的方法，其特征在于，步骤D中所述发酵菌种的制备包括如下步骤：

1)菌种培养：将酿酒酵母1445的甘油菌按1％的接种量接入5mL的YPD培养基中，先在30℃，200rpm的恒温震荡培养箱中活化24h，然后按1％的接种量转接至100mL的YPD培养基中，在30℃，200rpm的恒温震荡培养箱中培养12h，即为发酵种子液；

2)菌体悬液的制备：在无菌条件下将上述发酵种子液在冷冻离心机于4℃，4800rpm离心2min，倒去上清液，菌体用无菌去离子水洗涤2-3次，然后对湿菌体进行称重，加入一定体积无菌去离子水制成菌体悬液，以接种量为4g/L进行发酵。

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