CN111763693A - 用于核移植盲吸法去核体积的数学模型构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于核移植盲吸法去核体积的数学模型构建方法，主要包括以下步骤:将绵羊排出第一极体的成熟卵母细胞移入染色液中染色，放入显微镜下观察染色体与第一极体的相对位置，呈现一定规律等；在不同时间段,成熟卵母细胞染色体与第一极体的距离关系；不同时间段成熟卵母细胞去核体积比计算；不同时间段卵母细胞去核量在去核针中的理论度量；成熟卵母细胞核移植去核的实际度量值的简化。本发明可以在核移植盲吸法去核操作中,使操作员能够进行量化去核体积,可对去核量进行精确度量,而且减少对卵母细胞染色紫外示核的次数，降低对卵母细胞损伤，提高重构胚后期发育质量，其推演合理、经济实用。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种体细胞核移植受体细胞染色体和胞质精确去除量的用于核移植盲吸法去核体积的数学模型构建方法。
背景技术
目前在哺乳动物体细胞核移植去核方面主要应用的方法有半卵去核法、盲吸去核法，DNA染色示核去核法，相差成像示核去核法、化学诱导去核法等方法，而用于绵羊上,以盲吸去核法和染色示核去核法应用最为广泛。
DNA染色示核去核法是将卵母细胞用10μg/mL Hoechst33342处理10-15min,然后放入显微镜下，借助激发器激发紫外光观察第一极体及卵母细胞核的位置，用注射针将第一极体及其下方1/6-1/5的细胞质吸掉，然后再次观察是否去核完整在逐个进行。由于该方法使用紫外光照射示核染色体与第一极体，因此会造成每个卵母细胞的损伤，尤其是线粒体的损伤而导致后期克隆胚胎的发育质量下降。
盲吸法不借助其他化学物质，可以减少某些化学物质可能给卵母细胞造成的损伤和其操作简捷、迅速而被普遍采用。盲吸法存在的最大问题是细胞核位置不可见，去核操作时不能保证是否去掉细胞核，操作者只能凭借经验进行去核操作，不同技术熟练度操作人员的去核率存在较大差异，去核操作的一致性与可重复性比较差。
盲吸法去核，通常是在卵母细胞第一极体刚排出时，利用染色体位于极体附近，用显微去核针吸取第一极体以及附近的部分细胞质以便达到去核的目的。随着去核操作时间的延长会造成同批次未去核的卵母细胞发生第一极体与卵母细胞染色体位置较大的分离，因此就造成了卵母细胞去核胞质量的增多(卵子细胞质体积量的1/6-1/4不等)，去核效率从95％下降到71％，这种含有多核的重构胚会增加后期发育胚胎染色体的异常概率，从而降低克隆动物的获得。
发明内容
针对上述现有技术中的不足,本发明的目的在于提供一种经济实用，推演合理，在核移植盲吸法去核操作中,使操作员能够进行量化去核体积,可对去核进行精确度量,而且减少对卵母细胞染色紫外示核的次数，降低对卵母细胞损伤，提高重构胚后期发育质量的用于核移植盲吸法去核体积的数学模型构建方法。
本发明公开了一种用于核移植盲吸法去核体积的数学模型构建方法，其特征在于主要包括以下步骤:
(一)、将绵羊排出第一极体的成熟卵母细胞移入10μg/mL Hoechst33342染色液中染色10-15min，放入显微镜下观察染色体与第一极体的相对位置:将第一极体与染色在成熟卵母细胞里的位置看成一个钟表的模型,则以第一极体的位置作为钟表12点的位置，成熟卵母细胞染色体在12:00-2:00点之间位置出现变化，以成熟卵母细胞中心为顶点,以第一极体所在半径为一边，以染色体所在半径为另一边，所形成的夹角设为a，当染色体位于指向12：30的表指针位置上时，则夹角a为15°,当染色体位于指向13：00的表指针位置上时，则夹角a为30°,以此类推；对体外成熟时间：16-26h的成熟卵母细胞染色体与第一极体相对位置进行染色观察，成熟卵母细胞在各个成熟阶段，染色体与第一极体的相对位置变化呈现如下规律：
(1)、成熟时间在18h之内，成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，全部在夹角a为0°-15°之间，以表指针的位置表示，在12:00-12:30之间；
(2)、成熟时间在20h之内，有98.30％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；
(3)、成熟时间22h之内，94％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；98％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，出现在夹角a为0°-45°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间，以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间；
(4)、成熟时间在24h之内，95.03％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；97.67％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-45°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间，以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间；
(5)、成熟时间在26h之内，96.07％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；98.03％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，出现在夹角a为0°-45°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间，以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间；
综上所述，卵母细胞染色体与第一极体之间的位置，在夹角a为0°-60°之间变化，且96.925％的成熟卵母细胞染色体与第一极体之间的位置，在夹角a为0°-30°之间变化，98.84％的成熟卵母细胞染色体与第一极体之间的位置，在夹角a为0°-45°之间变化；
(二)、在不同时间段,成熟卵母细胞染色体与第一极体的距离关系：
(1)、卵母细胞直径R测量:
因成熟的卵母细胞形态质量较好，可以近似的认定为球体，现将卵母细胞假设为一个球体；将含有第一极体的成熟卵母细胞通过显微镜目镜测量卵母细胞的直径和透明带厚度，成熟卵母细胞的直径R在152.19-155.86μm之间；
(2)、卵母细胞染色体在球体模型中与第一极体所在球缺高度h：
因卵母细胞核移植去核，去除的是第一极体和染色体及周围少量的细胞质，因此平剜去核的相对体积可以看作为一个球体的球缺，则将第一极体与染色体所在球体内部体积设定为球缺；
设定上述球体的半径为r，直径为R，球缺高度为h，染色体与第一极体在球体中所形成的夹角为夹角a，利用正余玄关系求染色体与第一极体所在球缺高度h，则计算结果如下：因为夹角a在0-60°之间变化，R＝152.19-155.86μm，则半径r＝76.09-77.93μm，h＝r(1-Cosa)；
当a＝15°时，
则h＝2.59-2.65μm；
当a＝30°时，
则h＝10.19-10.44μm；
当a＝45°时，
则h＝22.29-22.83μm；
当a＝60°时，
则h＝38.04-38.96μm；
因此可得，成熟卵母细胞染色体与第一极体在卵母细胞中所在球缺高度h范围为2.59-38.96μm；
(三)、不同时间段成熟卵母细胞去核体积比计算：
(1)、成熟卵母细胞细胞质体积V：
因成熟的卵母细胞形态质量较好，可以近似的认定为球体，根据球体体积公式可知，
r＝76.09-77.93μm，则卵母细胞的体积如下：
V＝18844383.11-1981446.79μm3；
(2)、成熟卵母细胞核移植去核球缺体积V1：
卵母细胞核移植去核时,因去除的是第一极体和染色体及周围少量的细胞质，平剜去核的相对体积可以看作为一个球体的球缺,因此球缺V1＝πh2(r-h/3)，r＝76.09-77.93由上述去核球缺高度h计算球缺体积V1结果如下：
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则V1＝510.52-547.26μm3；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则V1＝7548.19-8114.57μm3；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则V1＝34113.32-36651.41μm3；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则V1＝91756.91-98576.29μm3；
(3)、成熟卵母细胞核移植去核量的体积比例:
卵母细胞去核程度直接影响着后续胚胎的发育潜力，去核体积越多，越不利于重构胚的发育，去核越少则可能达不到干净去核的目的，因此可以通过球缺与球体的体积比计算，可知去核量的比例如下：
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则V1/V＝0.000847-0.000859≈8/10000；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则V1/V＝0.01472-0.01474≈1/68；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则V1/V＝0.05807-0.05808≈1/17；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则V1/V＝0.1562-0.1778≈1/6；
(四)、不同时间段卵母细胞去核量在去核针中的理论度量:
(1)、球缺与去核针的数学模型关系:
因成熟卵母细胞去核需要去除的体积假设为上述的球缺，而去核工具为摩尖的去核针，形状如同圆柱体，因此卵母细胞去核的体积可以换算为去核针圆柱体的长度，因此存在以下数学函数关系：πh2(r-h/3)＝πr柱 2L；其中r柱为圆柱体截面半径,L为去核针吸入长度；
(2)、不同品种绵羊的供体细胞直径测量:
将不同品种绵羊的成纤维细胞直径进行测量比较，成纤维细胞直径数值在20μm周围变化；
(3)、体细胞核移植去核的理论度量：
从上述成纤维细胞的直径测量结果看，制作的去核针直径为20μm就能够达到要求，因此设定去核针直径2r柱为20μm，则卵母细胞去核量，在去核针圆柱体中的体积高度，可换算为去核针的吸入长度L，也叫理论去核体积量，或换算为成纤维细胞个数的多少，来实现去核量的量化度量；
由πh2(r-h/3)＝πr2 柱L，r＝76.09-77.93μm，已知2r柱＝20μm，可知L＝h2(r-h/3)/r2 柱；
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则L＝5.10-5.47μm，或L＝0.25个成纤维细胞的长度；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则L＝75.48-81.14μm，或L＝3.77-4.05个成纤维细胞的长度；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则L＝341.13-366.51μm，或L＝17.11-18.33个成纤维细胞的长度；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则L＝917.57-985.76μm，或L＝45.88-49.29个成纤维细胞的长度。
由上可知，以钟表指针指向12点的位置为第一极体的位置，当卵母细胞染色体在夹角a＝15°的位置时,即表指针指向12:30的位置时，理论去核体积量L为0.25个成纤维细胞的长度；当染色体在夹角a＝30°的位置时,即表指针指向13:00的位置时，理论去核体积量L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；当染色体在在夹角a＝45°的位置时,即表指针指向13:30的位置时，理论去核体积量L为17.11-18.33个成纤维细胞的长度；当染色体在在夹角a＝60°的位置时,即表指针指向14:00的位置时，理论去核体积量L为45.88-49.29个成纤维细胞的长度；
(4)、体细胞核移植去核的实际度量值：
因为卵母细胞的第一极体为减数分裂染色体高度浓缩的球体，染色体也是近似球体，当在上述第(四)的(3)步当中进行理论去核体积量的计算时，把第一极体和染色体简化为两个莹光点，计算出来的理论去核体积量L，与实际去核体积量相比，相差两个的半球体体积量，这两个的半球体体积量，通过测量，其大小与1个成纤维细胞的体积量相当，因此实际去核体积量＝所述理论去核体积量L+1个成纤维细胞的体积量。
(5)、去核针的制作与度量：
去核针为经过打弯处理的去核针，其结构包含尖端、去核段、延长段，所述尖端设有为30°-45°的斜角切口，所述去核段的长度S为360-400μm，所述去核段与延长段之间打弯并弧形过渡；以绵羊的成纤维细胞的直径为参照，去核针内径为一个成纤维细胞的直径，即20μm，所述去核段的长度S为去核临界点；
经测量，所述尖端的容量体积，相当于1个成纤维细胞的体积量；而余下的去核量的度量以上述理论去核体积量L的计算结果为准；
多数成熟卵母细胞的染色体在夹角a是0°-30°范围内变化，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间变化，因此只需要完成夹角a0 °-30°范围内的去核，便可实现大部分成熟卵母细胞的去核，理论计算去核比例为96.07％-96.92％；
当操作人员未能熟练掌握显微操作仪进行去核，或去核内容物为松散的、不连续的细胞质时，采用去核针打弯处长度进行最大值去核，完成夹角a是0°-45°范围内的去核，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间的范围内去核，形成最大去核数量比例的成熟卵母细胞染色体的去核，理论计算去核比例为98.84％；
后序通过紫外观察，观察染色体与第一极体是否去除,或者卵母细胞是否还含有染色体，观察到未去核干净的卵母细胞丢弃即可；
(五)、成熟卵母细胞核移植去核的实际度量值的简化：
由上述数学模型构建方法的推演过程，进一步将成熟卵母细胞核移植去核实际度量值进行简化如下：
(1)、首先将成熟的卵母细胞进行染色，然后用所述去核针度量去核染色体和第一极体以及周围细胞质的量，进行盲吸法去核，所述去核操作如下：根据成熟卵母细胞的成熟延续时间段，来确定去核量，所述去核量是以去核针吸入的染色体和第一极体以及周围细胞质的长度L来计量：
成熟卵母细胞的成熟延续时间16h-18h时：去核针吸入的长度L为0.25个成纤维细胞的长度；
成熟卵母细胞的成熟延续时间18h-20h时：去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；
成熟卵母细胞的成熟延续时间超过20h时：去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；当出现去核内容物为松散的、不连续的细胞质时，去核针吸入的长度L为17.11-18.33个成纤维细胞的长度，或者按去核临界点S的长度确定去核针吸入的长度L，即S＝L；
(2)、只进行一次紫外观察，观察染色体与第一极体是否去除或者卵母细胞是否还含有染色体，观察到未去核干净的卵母细胞直接丢弃。
本发明所提供的去核体积的度量方法,其推导过程及原理如下：
一、在研究中发现，卵母细胞各个成熟阶段染色体与第一极体的相对位置变化呈现一定的规律：
将排出第一极体的成熟卵母细胞移入10μg/mL Hoechst33342染色液中染色10-15min，放入显微镜下观察染色体与第一极体的相对位置，因成熟的卵母细胞形态质量较好，可以近似的认定为球体，将卵母细胞设定为球体，以球体中心为顶点，以第一极体所在半径为一边，以染色体所在半径为另一边，所形成一个夹角设为夹角a；以第一极体的位置作为钟表12点的位置，以卵母细胞染色体从12:00-14:00点之间出现的位置为结果绘图，参照附图3所示：成熟卵母细胞染色体与第一极体相对位置图谱。当染色体位于指向12：30的表指针位置上时，则夹角a为15°,当染色体位于指向13：00的表指针位置上时，则夹角a为30°,以此类推；对体外成熟不同时间(16-26h)的卵母细胞染色体与第一极体相对位置进行染色观察统计，以每2h为一组，统计如下：
表1不同时间段成熟卵母细胞染色体与第一极体相对位置
如表1所示：
1、成熟时间在18h之内，成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，全部在夹角a为0°-15°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-12:30之间)；
2、成熟时间在20h之内，有98.30％(58/59＝98.30％)的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间)；
3、成熟时间22h之内，94％(47/50＝94％)的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间)；98％(49/50＝98％)的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，出现在夹角a为0°-45°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间)。全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间)；
4、成熟时间在24h之内，95.03％(41/43＝95.03％)的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间)；97.67％(42/43＝97.67％)的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-45°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间)；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间)；
5、成熟时间在26h之内，96.07％(49/51＝96.07％)的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间)；98.03％(50/51＝98.03％)的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，出现在夹角a为0°-45°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间)；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间(即以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间)；
6、由上可知，卵母细胞染色体与第一极体的位置变化，基本在夹角a为0°-60°之间变化，且96.925％(252/260＝96.92％)的成熟卵母细胞染色体与第一极体的位置变化，在夹角a为0°-30°之间变化，98.84％(257/260＝98.84％)的成熟卵母细胞染色体与第一极体的位置变化，在夹角a为0°-45°之间变化。
二、在不同时间段,成熟卵母细胞染色体与第一极体的距离关系：
1.卵母细胞直径R测量:
将含有第一极体的成熟卵母细胞,通过显微镜目镜测量卵母细胞的直径和透明带厚度，不均匀及异常卵母细胞不进行测量。测量结果如下如表2所示。
表2不同直径卵泡内卵母细胞和透明带直径的差异
通过测量结果可知，卵母细胞的直径R变化在152.19-155.86μm之间。
2、卵母细胞染色体在球体模型中与第一极体的球缺高度h。
因成熟的卵母细胞形态质量较好，可以近似的认定为球体，将卵母细胞设定为球体；因卵母细胞核移植去核，去除的是第一极体和染色体及周围少量的细胞质，因此平剜去核的相对体积可以看作为一个球体的球缺，则将第一极体与染色体所在球体内部体积设定为球缺。
设定上述球体的半径为r，直径为R，球缺高度为h，染色体与第一极体在球体中的夹角为a，利用正余玄关系求染色体与第一极体所在球缺高度h，则计算结果如下：
因为a在0-60°之间变化，R＝152.19-155.86μm，即r＝76.09-77.93，h＝r(1-Cosa)；
当a＝15°时，
则h＝2.59-2.65μm；
当a＝30°时，
则h＝10.19-10.44μm；
当a＝45°时，
则h＝22.29-22.83μm；
当a＝60°时，
则h＝38.04-38.96μm。
因此可得，全部成熟卵母细胞染色体与第一极体在卵母细胞中所在球缺高度h范围为2.59-38.96μm。
三、不同时间段卵母细胞去核胞质量的比例计算。
1.卵母细胞细胞质体积V：
因成熟的卵母细胞形态质量较好，可以近似的认定为球体，根据球体体积公式可知，
r＝76.09-77.93μm，则卵母细胞的体积如下：
V＝18844383.11-1981446.79μm3。
2.卵母细胞核移植去核球缺体积V1：
卵母细胞核移植去核时因为去除的是第一极体和染色体及周围少量的细胞质，因此平剜去核的相对体积可以看作为一个球体的球缺。因此球缺V1＝πh2(r-h/3)，r＝76.09-77.93由上述去核球缺高度计算球缺体积结果如下：
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则V1＝510.52-547.26μm3；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则V1＝7548.19-8114.57μm3；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则V1＝34113.32-36651.41μm3；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则V1＝91756.91-98576.29μm3。
3.卵母细胞核移植去核的比例:
卵母细胞去核程度直接影响着后续胚胎的发育潜力，去核体积越多，越不利于重构胚的发育，去核越少则可能达不到干净去核的目的，因此确定去核量并进行可视化的度量非常必要，通过球缺体积比计算可知去核量：
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则V1/V＝0.000847-0.000859≈8/10000；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则V1/V＝0.01472-0.01474≈1/68；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则V1/V＝0.05807-0.05808≈1/17；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则V1/V＝0.1562-0.1778≈1/6。
四、不同时间段卵母细胞去核量在去核针中的度量。
1.球缺与去核针的数学模型关系:
因成熟卵母细胞去核需要去除的体积假设为上述的球缺，如图2所示；去核工具为利用磨针仪摩尖的去核针，形状如同圆柱体，如图1所示；去核过程参照图4，因此卵母细胞去除的体积可以换算为去核针圆柱体的长度，因此存在以下数学函数关系：πh2(r-h/3)＝πr柱 2L。
2.不同品种绵羊的供体细胞直径测量:
用组织块法将不同品种绵羊的耳皮肤细胞建系，简述如下：用刀片剔除耳部边缘的绒毛，75％酒精棉球擦洗耳组织2–3次，消毒30s后，用取样钳夹取耳组织投入生理盐水(含双抗)中带回实验室，移入超净台用眼科剪和镊子剔除软骨组织，生理盐水清洗4–5次，再投入75％酒精中浸15–20s，移入30mm平皿中剪碎耳部皮肤组织，组织块法培养，培养液为DMEM加15％FCS。原代培养3–5d后观察组织块贴壁和成纤维细胞迁出情况，每隔2d换液一次。待原代成纤维细胞生长至80％–90％连成片后，用胰酶消化3min，用含15％FBS的DMEM培养液(含EGF10 ng/mL，IGF10 ng/mL)进行传代培养，每2d换液1次，传3–5代之后冻存。供体细胞使用前3d解冻到24孔板培养，使用前PBS清洗1–2次，胰酶消化，2 500r/mim离心收集至1.5mL EP管，100μL培养液重悬浮供体细胞以备用。
将供体细胞移入液滴中，通过倒置显微镜目镜刻度记录直径，结果如下：
表3.常见绵羊品种成纤维细胞的直径。
从上述几个常见品种绵羊的成纤维细胞直径测量来看，成纤维细胞直径在20μm周围变动。
3.体细胞核移植去核的理论度量：
从上述成纤维的直径测量结果看，制作的去核针直径为20μm就能够达到要求，因此设定去核针直径2r柱为20μm，则卵母细胞去核量，在去核针圆柱体中的体积高度可换算为去核针的吸入长度L(也叫理论去核体积量)，或换算为成纤维细胞个数的多少，就可以实现去核量的量化度量。
由πh2(r-h/3)＝πr2 柱L，r＝76.09-77.93μm，已知2r柱＝20μm，可知L＝h2(r-h/3)/r2 柱；
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则L＝5.10-5.47μm，即目镜刻度的0.5格，也是0.25个成纤维细胞的长度,其中目镜刻度1格＝10μm；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则L＝75.48-81.14μm，即目镜刻度的8格的长度，是3.77-4.05个成纤维细胞的长度；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则L＝341.13-366.51μm，即目镜刻度的35格的长度，17.11-18.33个成纤维细胞的长度；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则L＝917.57-985.76μm，即目镜刻度的95格的长度，45.88-49.29个成纤维细胞的长度。
由上可知，以钟表指针指向12点的位置为第一极体的位置，当卵母细胞染色体在夹角a＝15°的位置时,即表指针指向12:30的位置时，理论去核体积量L为0.25个成纤维细胞的长度；当染色体在夹角a＝30°的位置时,即表指针指向13:00的位置时，理论去核体积量L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；当染色体在在夹角a＝45°的位置时,即表指针指向13:30的位置时，理论去核体积量L为17.11-18.33个成纤维细胞的长度；当染色体在在夹角a＝60°的位置时,即表指针指向14:00的位置时，理论去核体积量L为45.88-49.29个成纤维细胞的长度；
4.体细胞核移植去核的实际度量：
因为卵母细胞的第一极体为减数分裂染色体高度浓缩的球体，染色体也是近似球体，当在上述第四的(3)步当中进行理论去核体积量的计算时，把第一极体和染色体简化为两个莹光点，计算出来的理论去核体积量L，与实际去核体积量相比，相差两个的半球体的体积量，这两个的半球体的体积量，通过测量，其大小与1个成纤维细胞的体积量相当，因此实际去核体积量＝所述理论去核体积量L+1个成纤维细胞的体积量。
5.去核针的制作与度量：
参照附图1,去核针的尖端为30°-45°的斜角切口，经测量，尖端的容量体积，相当于1个成纤维细胞的体积量。而余下的去核量的度量，以上述去核的理论度量值的计算结果为准。
因所述去核针是嵌入在显微操作仪操作臂套管上，如图1，因此需要将玻璃去核针前端用煅烧仪打弯制作成“√”形状，也利于保持针前端与水平面处于平行状态,而打弯处与顶端的距离具有长度限定，即通过上述理论计算得出该长度L为341.13-366.51μm，可以限定98.03％-98.84％(由理论数据中成熟卵母细胞个数占比50/51-257/260计算得出，16-26h成熟的过程为动态过程)的成熟卵母细胞在表指针12:00-13:30(夹角a为0°-45°之间)范围内，因此去核针的打弯长度为341.13-366.51μm，即目镜刻度35格的位置。又因玻璃针打弯不能形成尖锐的折角，而是具有一定的弧度，范围需要扩大，因此需要在目镜刻度36-40格处进行打弯较合适，即图1中去核段的长度S为360-400μm的位置。
多数成熟卵母细胞的染色体在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间范围内变化，因此只需要完成夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间范围内的去核,便可实现大部分成熟卵母细胞的去核，以前面的理论得出的成熟卵母细胞个数占比49/51-252/260计算可得，去核比例为96.07％-96.92％；
当操作人员未能熟练掌握显微操作仪进行去核，或去核内容物为松散的、不连续的细胞质时，可以采用去核针吸入的长度L为17.11-18.33个成纤维细胞的长度去核，也可以以去核针打弯处长度S进行最大值去核，也就是夹角a为0°-45°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间范围内去核，形成最大去核数量比例的成熟卵母细胞染色体的去核，由理论数据中成熟卵母细胞个数占比257/260计算得出，即98.84％。
然后进行一次紫外观察，观察染色体与第一极体是否去除或者卵母细胞是否还含有染色体，观察到未去核干净的卵母细胞直接丢弃。
五、成熟卵母细胞去核效果。
1、不同分类法各时间段盲吸法去核效果：
依据上述本发明所构建的模型结果根据不同文献将克隆步骤重新分类如下：
表4不同分类法成熟卵母细胞染色体与第一极体相对位置分布
上述分段法克隆为一步法，去核与注射同时完成，主要以2-2.5h完成的去核重构胚为一批，分批进行克隆，融合与激活，为研究者实验室近三年采用的方法。因此各时间段95％以上的成熟卵母细胞去核量为3.7-4.0个成纤维细胞直径就完成去核。
上述早期法和晚期法均为二步法克隆，即集中去核，然后集中注核，大多数实验室采用该方法。早期法99.13％的卵母细胞完成3.7-4个成纤维细胞就可实现去核。晚期法96.33％的卵母细胞完成3.7-4个成纤维细胞就可实现去核。
2.去核后的分类处理与使用：
依据本发明数学模型关系，大多数成熟卵母细胞可以实现盲吸法的度量去核。即首先将成熟的卵母细胞进行Hoechesst33342染色，然后以去核针度量去核染色体和第一极体以及周围细胞质的量进行盲吸法去核，然后只进行一次紫外观察，观察染色体与第一极体是否去除或者卵母细胞是否还含有染色体，观察到未去核干净的卵母细胞直接丢弃，通过注入的供体细胞即可区分重构胚，即可实现100％去核胚的重构。
与现有技术相比，本发明的优点：可以在核移植盲吸法去核操作中,使操作员能够进行量化去核体积,可对去核量进行精确度量,而且减少对卵母细胞染色紫外示核的次数，降低对卵母细胞损伤，提高重构胚后期发育质量，是一种经济实用、推演合理的用于核移植盲吸法去核体积的数学模型构建方法。
附图说明
图1为本发明实施例中去核针的结构示意图。图1中所示L为去核针的吸入长度,也是理论去核体积量，S为去核段的长度。
图2为本发明实施例中成熟卵母细胞、第一极体、染色体位置模型关系的结构示意图。
图3为本发明实施例中成熟卵母细胞染色体与第一极体相对位置图谱。
图4为本发明实施例中体细胞核移植去核过程示意图。其中第五幅图片为成纤维细胞与卵母细胞的第一极体和染色体的体量大小对比示意图。图片中第一行5个点代表5个染色的成纤维细胞,下面一行中的1个点为按照去核模型度量的去核长度1+3.77～1+4.05个成纤维细胞，这个点代表卵母细胞的第一极体和染色体的完整度量去除。
图中所示：1为尖端，2为去核物质，3为去核段，4为延长段，5为操作臂套管，6为球缺，7为球体半径，8为第一极体，9为球缺高度，10为染色体，11为夹角a，12为球体直径。
具体实施方式
本实施例中用到的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。所使用的材料、试剂等如无特说说明，均可从商业途径得到。
部分试剂如下：试剂除特别说明外，均为日本和光药业株式会社药品。M199(GIBCO)，DMEM(GIBCO)，FCS(Hyclone)、胰酶(Gbico)、四孔板(NUNC)、60mm培养皿(NUNC)，显微操作针，石蜡油(sigma M8410)，体式显微镜(Nikon SMZ800)、拉针仪(NARISHIGE PN-30)、磨针仪(NARISHIGE EG-400)、煅烧仪(NARISHIGE MF-900)、显微操作仪(EppendorfTransferman NK2)，CO2培养箱(New Branswick Galaxy 170S)。
参照图1-图4，为本发明实施例的结构示意图，本实施例中所用到的一种用于核移植盲吸法去核体积的数学模型构建方法，主要包括以下步骤:
(一)、将绵羊排出第一极体的成熟卵母细胞移入10μg/mL Hoechst33342染色液中染色10-15min，放入显微镜下观察染色体与第一极体的相对位置:将第一极体与染色在成熟卵母细胞里的位置看成一个钟表的模型,则以第一极体的位置作为钟表12点的位置，成熟卵母细胞染色体在12:00-2:00点之间位置出现变化，以成熟卵母细胞中心为顶点,以第一极体所在半径为一边，以染色体所在半径为另一边，所形成的夹角设为a，当染色体位于指向12：30的表指针位置上时，则夹角a为15°,当染色体位于指向13：00的表指针位置上时，则夹角a为30°,以此类推；对体外成熟时间：16-26h的成熟卵母细胞染色体与第一极体相对位置进行染色观察，成熟卵母细胞在各个成熟阶段，染色体与第一极体的相对位置变化呈现如下规律：
(1)、成熟时间在18h之内，成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，全部在夹角a为0°-15°之间，以表指针的位置表示，在12:00-12:30之间；
(2)、成熟时间在20h之内，有98.30％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；
(3)、成熟时间22h之内，94％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；98％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，出现在夹角a为0°-45°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间，以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间；
(4)、成熟时间在24h之内，95.03％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；97.67％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-45°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间，以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间；
(5)、成熟时间在26h之内，96.07％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；98.03％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，出现在夹角a为0°-45°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间，以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间；
综上，卵母细胞染色体与第一极体之间的位置，在夹角a为0°～60°之间变化，且96.925％的成熟卵母细胞染色体与第一极体之间的位置，在夹角a为0°-30°之间变化，98.84％的成熟卵母细胞染色体与第一极体之间的位置，在夹角a为0°-45°之间变化；
(二)、在不同时间段,成熟卵母细胞染色体与第一极体的距离关系：
(1)、卵母细胞直径R测量:
因成熟的卵母细胞形态质量较好，可以近似的认定为球体，现将卵母细胞假设为一个球体；将含有第一极体的成熟卵母细胞通过显微镜目镜测量卵母细胞的直径和透明带厚度，成熟卵母细胞的直径R在152.19-155.86μm之间；
(2)、卵母细胞染色体在球体模型中与第一极体所在球缺高度h：
因卵母细胞核移植去核，去除的是第一极体和染色体及周围少量的细胞质，因此平剜去核的相对体积可以看作为一个球体的球缺，则将第一极体与染色体所在球体内部体积设定为球缺；
设定上述球体的半径为r，直径为R，球缺高度为h，染色体与第一极体在球体中所形成的夹角为夹角a，利用正余玄关系求染色体与第一极体所在球缺高度h，则计算结果如下：因为夹角a在0-60°之间变化，R＝152.19-155.86μm，则半径r＝76.09-77.93μm，h＝r(1-Cosa)；
当a＝15°时，
则h＝2.59-2.65μm；
当a＝30°时，
则h＝10.19-10.44μm；
当a＝45°时，
则h＝22.29-22.83μm；
当a＝60°时，
则h＝38.04-38.96μm；
因此可得，成熟卵母细胞染色体与第一极体在卵母细胞中所在球缺高度h范围为2.59-38.96μm；
(三)、不同时间段成熟卵母细胞去核体积比计算：
(1)、成熟卵母细胞细胞质体积V：
因成熟的卵母细胞形态质量较好，可以近似的认定为球体，根据球体体积公式可知，
r＝76.09-77.93μm，则卵母细胞的体积如下：
V＝18844383.11-1981446.79μm3；
(2)、成熟卵母细胞核移植去核球缺体积V1：
卵母细胞核移植去核时,因去除的是第一极体和染色体及周围少量的细胞质，平剜去核的相对体积可以看作为一个球体的球缺,因此球缺V1＝πh2(r-h/3)，r＝76.09-77.93由上述去核球缺高度h计算球缺体积V1结果如下：
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则V1＝510.52-547.26μm3；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则V1＝7548.19-8114.57μm3；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则V1＝34113.32-36651.41μm3；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则V1＝91756.91-98576.29μm3；
(3)、成熟卵母细胞核移植去核量的体积比例:
卵母细胞去核程度直接影响着后续胚胎的发育潜力，去核体积越多，越不利于重构胚的发育，去核越少则可能达不到干净去核的目的，因此可以通过球缺与球体的体积比计算，可知去核量的比例如下：
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则V1/V＝0.000847-0.000859≈8/10000；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则V1/V＝0.01472-0.01474≈1/68；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则V1/V＝0.05807-0.05808≈1/17；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则V1/V＝0.1562-0.1778≈1/6；
(四)、不同时间段卵母细胞去核量在去核针中的理论度量:
(1)、球缺与去核针的数学模型关系:
因成熟卵母细胞去核需要去除的体积假设为上述的球缺，而去核工具为摩尖的去核针，形状如同圆柱体，因此卵母细胞去核的体积可以换算为去核针圆柱体的长度，因此存在以下数学函数关系：πh2(r-h/3)＝πr柱 2L；其中r柱为圆柱体截面半径,L为去核针吸入长度；
(2)、不同品种绵羊的供体细胞直径测量:
将不同品种绵羊的成纤维细胞直径进行测量比较，成纤维细胞直径数值在20μm周围变化；
(3)、体细胞核移植去核的理论度量：
从上述成纤维细胞的直径测量结果看，制作的去核针直径为20μm就能够达到要求，因此设定去核针直径2r柱为20μm，则卵母细胞去核量，在去核针圆柱体中的体积高度，可换算为去核针的吸入长度L，也叫理论去核体积量，或换算为成纤维细胞个数的多少，来实现去核量的量化度量；
由πh2(r-h/3)＝πr2 柱L，r＝76.09-77.93μm，已知2r柱＝20μm，可知L＝h2(r-h/3)/r2 柱；
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则L＝5.10-5.47μm，或L＝0.25个成纤维细胞的长度；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则L＝75.48-81.14μm，或L＝3.77-4.05个成纤维细胞的长度；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则L＝341.13-366.51μm，或L＝17.11-18.33个成纤维细胞的长度；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则L＝917.57-985.76μm，或L＝45.88-49.29个成纤维细胞的长度。
由上可知，以钟表指针指向12点的位置为第一极体的位置，当卵母细胞染色体在夹角a＝15°的位置时,即表指针指向12:30的位置时，理论去核体积量L为0.25个成纤维细胞的长度；当染色体在夹角a＝30°的位置时,即表指针指向13:00的位置时，理论去核体积量L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；当染色体在在夹角a＝45°的位置时,即表指针指向13:30的位置时，理论去核体积量L为17.11-18.33个成纤维细胞的长度；当染色体在在夹角a＝60°的位置时,即表指针指向14:00的位置时，理论去核体积量L为45.88-49.29个成纤维细胞的长度；
(4)、体细胞核移植去核的实际度量值：
因为卵母细胞的第一极体为减数分裂染色体高度浓缩的球体，染色体也是近似球体，当在上述第(四)的(3)步当中进行理论去核体积量的计算时，把第一极体和染色体简化为两个莹光点，计算出来的理论去核体积量L，与实际去核体积量相比，相差两个的半球体体积量，这两个的半球体体积量，通过测量，其大小与1个成纤维细胞的体积量相当，因此实际去核体积量＝所述理论去核体积量L+1个成纤维细胞的体积量。
(5)、去核针的制作与度量：
去核针为经过打弯处理的去核针，其结构包含尖端1、去核段3、延长段4，所述尖端设有为30°-45°的斜角切口，所述去核段的长度S为360-400μm，所述去核段3与延长段4之间打弯并弧形过渡；以绵羊的成纤维细胞的直径为参照，去核针内径为一个成纤维细胞的直径，即20μm，所述去核段3的长度S为去核临界点；
经测量，所述尖端1的容量体积，相当于1个成纤维细胞的体积量；而余下的去核量的度量以上述理论去核体积量L的计算结果为准；
多数成熟卵母细胞的染色体在夹角a是0°-30°范围内变化，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间变化，因此只需要完成夹角a0°-30°范围内的去核，便可实现大部分成熟卵母细胞的去核，理论计算去核比例为96.07％-96.92％；
当操作人员未能熟练掌握显微操作仪进行去核，或去核内容物为松散的、不连续的细胞质时，采用去核针打弯处长度进行最大值去核，完成夹角a是0°-45°范围内的去核，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间的范围内去核，形成最大去核数量比例的成熟卵母细胞染色体的去核，理论计算去核比例为98.84％；
后序通过紫外观察，观察染色体与第一极体是否去除,或者卵母细胞是否还含有染色体，观察到未去核干净的卵母细胞丢弃即可；
五、成熟卵母细胞核移植去核的实际度量值的简化：
由上述数学模型构建方法的推演过程，进一步将成熟卵母细胞核移植去核实际度量值进行简化如下：
(1)、首先将成熟的卵母细胞进行染色，然后用所述去核针度量去核染色体和第一极体以及周围细胞质的量，进行盲吸法去核，所述去核操作如下：根据成熟卵母细胞的成熟延续时间段，来确定去核量，所述去核量是以去核针吸入的染色体和第一极体以及周围细胞质的长度L来计量：
成熟卵母细胞的成熟延续时间16h-18h时：去核针吸入的长度L为0.25个成纤维细胞的长度；
成熟卵母细胞的成熟延续时间18h-20h时：去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；
成熟卵母细胞的成熟延续时间超过20h时：去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；当出现去核内容物为松散的、不连续的细胞质时，去核针吸入的长度L为17.11-18.33个成纤维细胞的长度，或者按去核临界点S的长度确定去核针吸入的长度L，即S＝L；
(2)、只进行一次紫外观察，观察染色体与第一极体是否去除或者卵母细胞是否还含有染色体，观察到未去核干净的卵母细胞直接丢弃。
利用上述构建的核移植盲吸法去核体积的数学模型,具体实施绵羊卵母细胞体外成熟及盲吸法去核操作如下:
第一、卵母细胞采集与成熟：收集绵羊卵巢，清洗后刺剖法采集卵母细胞，在显微镜下挑出排有第一极体的成熟卵母细胞以备用，同时记录成熟延续时间；
实施例中卵母细胞体外成熟与处理的具体作法为：
收集绵羊卵巢，清洗一次后剪去输卵管连接部及多余的结缔组织，用生理盐水再清洗3–4次，刺剖法采集卵母细胞：简述如下，卵巢沥干放入加好采卵液(M199+0.1％BSA+0.1mg/mL肝素+0.1mg/mL庆大霉素)的100mm培养皿中，左手持尖头眼科镊子将卵巢固定在采卵液中，右手持手术刀片将突出卵巢皮质、明亮的卵泡刺破并多剖数刀使其进入采卵液中，采完的卵巢在采卵液中轻轻晃动防止黏附。沉淀数分钟后弃去上清液，用手拉巴氏管在体式显微镜下选取形态正常、胞质均匀的卵丘卵母细胞复合体(Cumulus-oocytecomplexs，COCs)进行成熟。将采集到的COCs用采卵液清洗2–3遍，然后用成熟液清洗1–2遍，放入预平衡2h的成熟液微滴中(M199+15％FBS+0.1Iμ/mL FSH+0.2Iμ/mL LH+1.0μg/mL雌二醇)，培养密度10枚/50μL，培养条件为38.5℃、5％CO2、饱和湿度。
本实施例中所用到的早期法、晚期法和分段法，分别将卵母细胞在体外成熟，早期法成熟时间为16h，晚期法成熟时间为18h，分段法成熟时间分别为16h、18h、20h、22h、24h，在操作中分别将扩散的颗粒细胞用移液器吹打除去，0.1％透明质酸酶消化1min后继续吹打以除尽颗粒细胞，用成熟液清洗2–3次，移入预先平衡于60mm平皿的成熟培养滴中，在体式显微镜下挑出排有第一极体的成熟卵母细胞以备用。
第二步、准备需要的试剂、操作仪器等去核工具，其中去核针为经过打弯处理的去核针，其结构包含尖端1、去核段3、延长段4，所述尖端1设有为30°-45°的斜角切口，所述去核段3的长度S为360-400μm，所述去核段3与延长段4之间打弯并弧形过渡；以草食动物的成纤维细胞的直径为参照，去核针内径为一个成纤维细胞的直径，即20μm，所述去核段3的长度S为去核临界点；
第三步、首先将成熟的卵母细胞进行染色，然后用去核针度量去核染色体和第一极体以及周围细胞质的量，进行盲吸法去核，所述去核操作如下：根据成熟卵母细胞的成熟延续时间段，来确定去核量，所述去核量是以去核针吸入的染色体和第一极体以及周围细胞质的长度L来计量：
成熟卵母细胞的成熟延续时间16h-18h时：去核针吸入的长度L为0.25个成纤维细胞的长度；
成熟卵母细胞的成熟延续时间18h-20h时：去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；
成熟卵母细胞的成熟延续时间超过20h时：去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；当出现去核内容物为松散的、不连续的细胞质时，去核针吸入的长度L为17.11-18.33个成纤维细胞的长度，或者按去核临界点S的长度确定去核针吸入的长度L，即S＝L；
(4)、只进行一次紫外观察，观察染色体与第一极体是否去除或者卵母细胞是否还含有染色体，观察到未去核干净的卵母细胞直接丢弃。
实验中体细胞核移植具体操作如下：
用60mm培养皿制作操作液(M199+25mmol/L Hepes+20％FBS)并覆盖石蜡油，移入显微操作台将注射针与固定针移入操作视野内。将受体卵母细胞用含7.5μg/mL CB+1.5μg/ml Hochest33342的成熟液培养10min，用巴氏管将供体细胞和卵母细胞移入操作液中实施卵母细胞重构。
早期法与晚期法为二步法克隆，即集中批次去核，然后集中批次注核。简述如下，经过Hochest3342染色的卵母细胞，在成熟液中清洗3-4次，然后进行集中去核和注核，注核结束后通过液滴逐个标记去核情况，去核干净的进行集中重构，具有荧光显示残核的卵母细胞丢弃。早期法16h通过去除颗粒细胞后，根据本发明去核方法在重构时间16-20h进行去核时，去核量，即去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；晚期法18h通过去核颗粒细胞后，根据本发明去核方法在重构时间18-22h进行去核时，去核量，即去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度，当去核内容物表现较为松散时，去核量，即去核针吸入的长度L可以增加到17.11-18.33个成纤维细胞，或者按去核临界点S的长度确定去核针吸入的长度L，即S＝L，卵母细胞去核量不超过去核针打弯处。分段法为一步法克隆，即去核与注核同时完成。固定针吸住卵母细胞，第一极体指向12点方向，去核针刺入剜除极体及周围少量细胞质，根据本发明去核方法进行盲吸法度量去核，然后通过紫外光观察去核情况，将残留有细胞核的卵母细胞丢弃，核去除干净的卵母细胞用于重构。在18h以内去核量即去核针吸入的长度L为0.25个成纤维细胞；在20h以内时去核量即去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞；当重构时间超过体外成熟20h以上时，去核内容物表现较为紧密时，去核量即去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成显微细胞，去核内容物表现较为松散时，去核量则可以增加到17.11-18.33个成纤维细胞，或者按去核临界点S的长度确定去核针吸入的长度L，即S＝L，卵母细胞去核量不超过去核针打弯处。
本实施例中体细胞重构度量去核实施结果见下表：
早期法去核结果
晚期法去核结果
分段法去核结果
Claims (1)
1.一种用于核移植盲吸法去核体积的数学模型构建方法，其特征在于主要包括以下步骤:
(一)、将绵羊排出第一极体的成熟卵母细胞移入10μg/mL Hoechst33342染色液中染色10-15min，放入显微镜下观察染色体与第一极体的相对位置:将第一极体与染色在成熟卵母细胞里的位置看成一个钟表的模型,则以第一极体的位置作为钟表12点的位置，成熟卵母细胞染色体在12:00-2:00点之间位置出现变化，以成熟卵母细胞中心为顶点,以第一极体所在半径为一边，以染色体所在半径为另一边，所形成的夹角设为a，当染色体位于指向12：30的表指针位置上时，则夹角a为15°,当染色体位于指向13：00的表指针位置上时，则夹角a为30°,以此类推；对体外成熟时间：16-26h的成熟卵母细胞染色体与第一极体相对位置进行染色观察，成熟卵母细胞在各个成熟阶段，染色体与第一极体的相对位置变化呈现如下规律：
(1)、成熟时间在18h之内，成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，全部在夹角a为0°-15°之间，以表指针的位置表示，在12:00-12:30之间；
(2)、成熟时间在20h之内，有98.30％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；
(3)、成熟时间22h之内，94％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；98％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，出现在夹角a为0°-45°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间，以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间；
(4)、成熟时间在24h之内，95.03％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；97.67％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-45°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间，以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间；
(5)、成熟时间在26h之内，96.07％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-30°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间；98.03％的成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，出现在夹角a为0°-45°之间，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间；全部成熟卵母细胞的第一极体与染色体出现的位置，在夹角a为0°-60°之间，以表指针的位置表示，在12:00-14:00之间；
综上所述，卵母细胞染色体与第一极体之间的位置，在夹角a为0°-60°之间变化，且96.925％的成熟卵母细胞染色体与第一极体之间的位置，在夹角a为0°-30°之间变化，98.84％的成熟卵母细胞染色体与第一极体之间的位置，在夹角a为0°-45°之间变化；
(二)、在不同时间段,成熟卵母细胞染色体与第一极体的距离关系：
(1)、卵母细胞直径R测量:
因成熟的卵母细胞形态质量较好，可以近似的认定为球体，现将卵母细胞假设为一个球体；将含有第一极体的成熟卵母细胞通过显微镜目镜测量卵母细胞的直径和透明带厚度，成熟卵母细胞的直径R在152.19-155.86μm之间；
(2)、卵母细胞染色体在球体模型中与第一极体所在球缺高度h：
因卵母细胞核移植去核，去除的是第一极体和染色体及周围少量的细胞质，因此平剜去核的相对体积可以看作为一个球体的球缺，则将第一极体与染色体所在球体内部体积设定为球缺；
设定上述球体的半径为r，直径为R，球缺高度为h，染色体与第一极体在球体中所形成的夹角为夹角a，利用正余玄关系求染色体与第一极体所在球缺高度h，则计算结果如下：
因为夹角a在0-60°之间变化，R＝152.19-155.86μm，则半径r＝76.09-77.93μm，
h＝r(1-Cosa)；
当a＝15°时，
则h＝2.59-2.65μm；
当a＝30°时，
则h＝10.19-10.44μm；
当a＝45°时，
则h＝22.29-22.83μm；
当a＝60°时，
则h＝38.04-38.96μm；
因此可得，成熟卵母细胞染色体与第一极体在卵母细胞中所在球缺高度h范围为2.59-38.96μm；
(三)、不同时间段成熟卵母细胞去核体积比计算：
(1)、成熟卵母细胞细胞质体积V：
因成熟的卵母细胞形态质量较好，可以近似的认定为球体，根据球体体积公式可知，
r＝76.09-77.93μm，则卵母细胞的体积如下：
V＝18844383.11-1981446.79μm3；
(2)、成熟卵母细胞核移植去核球缺体积V1：
卵母细胞核移植去核时,因去除的是第一极体和染色体及周围少量的细胞质，平剜去核的相对体积可以看作为一个球体的球缺,因此球缺V1＝πh2(r-h/3)，r＝76.09-77.93由上述去核球缺高度h计算球缺体积V1结果如下：
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则V1＝510.52-547.26μm3；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则V1＝7548.19-8114.57μm3；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则V1＝34113.32-36651.41μm3；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则V1＝91756.91-98576.29μm3；
(3)、成熟卵母细胞核移植去核量的体积比例:
卵母细胞去核程度直接影响着后续胚胎的发育潜力，去核体积越多，越不利于重构胚的发育，去核越少则可能达不到干净去核的目的，因此可以通过球缺与球体的体积比计算，可知去核量的比例如下：
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则V1/V＝0.000847-0.000859≈8/10000；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则V1/V＝0.01472-0.01474≈1/68；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则V1/V＝0.05807-0.05808≈1/17；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则V1/V＝0.1562-0.1778≈1/6；
(四)、不同时间段卵母细胞去核量在去核针中的理论度量:
(1)、球缺与去核针的数学模型关系:
因成熟卵母细胞去核需要去除的体积假设为上述的球缺，而去核工具为摩尖的去核针，形状如同圆柱体，因此卵母细胞去核的体积可以换算为去核针圆柱体的长度，因此存在以下数学函数关系：πh2(r-h/3)＝πr柱 2L；其中r柱为圆柱体截面半径,L为去核针吸入长度；
(2)、不同品种绵羊的供体细胞直径测量:
将不同品种绵羊的成纤维细胞直径进行测量比较，成纤维细胞直径数值在20μm周围变化；
(3)、体细胞核移植去核的理论度量：
从上述成纤维细胞的直径测量结果看，制作的去核针直径为20μm就能够达到要求，因此设定去核针直径2r柱为20μm，则卵母细胞去核量，在去核针圆柱体中的体积高度，可换算为去核针的吸入长度L，也叫理论去核体积量，或换算为成纤维细胞个数的多少，来实现去核量的量化度量；
由πh2(r-h/3)＝πr2 柱L，r＝76.09-77.93μm，已知2r柱＝20μm，可知L＝h2(r-h/3)/r2 柱；
当a＝15°时，h＝2.59-2.65μm，则L＝5.10-5.47μm，或L＝0.25个成纤维细胞的长度；
当a＝30°时，h＝10.19-10.44μm，则L＝75.48-81.14μm，或L＝3.77-4.05个成纤维细胞的长度；
当a＝45°时，h＝22.29-22.83μm，则L＝341.13-366.51μm，或L＝17.11-18.33个成纤维细胞的长度；
当a＝60°时，h＝38.04-38.96μm，则L＝917.57-985.76μm，或L＝45.88-49.29个成纤维细胞的长度。
由上可知，以钟表指针指向12点的位置为第一极体的位置，当卵母细胞染色体在夹角a＝15°的位置时,即表指针指向12:30的位置时，理论去核体积量L为0.25个成纤维细胞的长度；当染色体在夹角a＝30°的位置时,即表指针指向13:00的位置时，理论去核体积量L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；当染色体在在夹角a＝45°的位置时,即表指针指向13:30的位置时，理论去核体积量L为17.11-18.33个成纤维细胞的长度；当染色体在在夹角a＝60°的位置时,即表指针指向14:00的位置时，理论去核体积量L为45.88-49.29个成纤维细胞的长度；
(4)、体细胞核移植去核的实际度量值：
因为卵母细胞的第一极体为减数分裂染色体高度浓缩的球体，染色体也是近似球体，当在上述第(四)的(3)步当中进行理论去核体积量的计算时，把第一极体和染色体简化为两个莹光点，计算出来的理论去核体积量L，与实际去核体积量相比，相差两个的半球体体积量，这两个的半球体体积量，通过测量，其大小与1个成纤维细胞的体积量相当，因此实际去核体积量＝所述理论去核体积量L+1个成纤维细胞的体积量。
(5)、去核针的制作与度量：
去核针为经过打弯处理的去核针，其结构包含尖端、去核段、延长段，所述尖端设有为30°-45°的斜角切口，所述去核段的长度S为360-400μm，所述去核段与延长段之间打弯并弧形过渡；以绵羊的成纤维细胞的直径为参照，去核针内径为一个成纤维细胞的直径，即20μm，所述去核段的长度S为去核临界点；
经测量，所述尖端的容量体积，相当于1个成纤维细胞的体积量；而余下的去核量的度量以上述理论去核体积量L的计算结果为准；
多数成熟卵母细胞的染色体在夹角a是0°-30°范围内变化，以表指针的位置表示，在12:00-13:00之间变化，因此只需要完成夹角a是0°-30°范围内的去核，便可实现大部分成熟卵母细胞的去核，理论计算去核比例为96.07％-96.92％；
当操作人员未能熟练掌握显微操作仪进行去核，或去核内容物为松散的、不连续的细胞质时，采用去核针打弯处长度进行最大值去核，完成夹角a是0°-45°范围内的去核，以表指针的位置表示，在12:00-13:30之间的范围内去核，形成最大去核数量比例的成熟卵母细胞染色体的去核，理论计算去核比例为98.84％；
后继通过紫外观察，观察染色体与第一极体是否去除,或者卵母细胞是否还含有染色体，观察到未去核干净的卵母细胞丢弃即可；
(五)、成熟卵母细胞核移植去核的实际度量值的简化：
由上述数学模型构建方法的推演过程，进一步将成熟卵母细胞核移植去核实际度量值进行简化如下：
(1)、首先将成熟的卵母细胞进行染色，然后用所述去核针度量去核染色体和第一极体以及周围细胞质的量，进行盲吸法去核，所述去核操作如下：根据成熟卵母细胞的成熟延续时间段，来确定去核量，所述去核量是以去核针吸入的染色体和第一极体以及周围细胞质的长度L来计量：
成熟卵母细胞的成熟延续时间16h-18h时：去核针吸入的长度L为0.25个成纤维细胞的长度；
成熟卵母细胞的成熟延续时间18h-20h时：去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；
成熟卵母细胞的成熟延续时间超过20h时：去核针吸入的长度L为3.77-4.05个成纤维细胞的长度；当出现去核内容物为松散的、不连续的细胞质时，去核针吸入的长度L为17.11-18.33个成纤维细胞的长度，或者按去核临界点S的长度确定去核针吸入的长度L，即S＝L；
(2)、只进行一次紫外观察，观察染色体与第一极体是否去除或者卵母细胞是否还含有染色体，观察到未去核干净的卵母细胞直接丢弃。
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