CN111757882A

CN111757882A - 用于治疗、减轻或预防与Tau聚集体相关的病症如阿尔茨海默病的1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚衍生物

Info

Publication number: CN111757882A
Application number: CN201980007273.XA
Authority: CN
Inventors: S.南帕利; E.加贝利里; J.莫莱特
Original assignee: AC Immune SA
Current assignee: AC Immune SA
Priority date: 2018-01-05
Filing date: 2019-01-04
Publication date: 2020-10-09
Anticipated expiration: 2039-01-04
Also published as: BR112020012833A2; AU2019205087A1; MX2020007031A; KR102477105B1; CL2020001796A1; NZ765495A; EP3735411B1; AU2019205087B2; AU2021203340A1; CO2020008287A2; KR20200096570A; IL275781B2; AU2021203340B2; MA51520A; IL275781A; JOP20200167A1; JP2022172130A; PE20211090A1; CN111757882B; PH12020500573A1

Abstract

本发明涉及可用于治疗、减轻或预防与Tau(微管蛋白相关单元)蛋白聚集体相关的一组病症和异常的新型化合物，所述病症和异常包括但不限于神经原纤维缠结(NFT)，例如阿尔茨海默病(AD)。

Description

用于治疗、减轻或预防与Tau聚集体相关的病症如阿尔茨海默病的1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚衍生物

发明领域

发明背景

许多衰老性疾病基于或涉及淀粉样蛋白或类淀粉样蛋白(amyloid-like protein)的细胞外或细胞内沉积物，其有助于疾病的发病机理以及疾病进展。形成细胞外聚集体的最具特征的淀粉样蛋白是β淀粉样蛋白(Aβ)。形成细胞外聚集体的淀粉样蛋白的其他实例是朊病毒、ATTR(运甲状腺素蛋白)或ADan(ADanPP)。主要形成细胞内聚集体的类淀粉样蛋白包括但不限于Tau、α-突触核蛋白，TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)和亨廷顿蛋白(htt)。涉及Tau聚集体的疾病通常被列为Tau蛋白病，例如AD。

淀粉样蛋白或类淀粉样蛋白的沉积物由蛋白质错误折叠随后聚集得到β-折叠(β-sheet)组装体而产生，在该组装体中多个肽或蛋白质通过分子间氢键结合在一起。尽管淀粉样蛋白或类淀粉样蛋白具有不同的一级氨基酸序列，但它们的沉积物通常含有许多共有的分子成分，特别是存在β-折叠四级结构。淀粉样蛋白沉积物与疾病之间的关系在很大程度上尚不清楚。已发现各种各样的蛋白质聚集体(包括与疾病病理相关的和与疾病病理无关的聚集体)都是有毒的，这表明淀粉样蛋白的共同分子特征与疾病发作有关或是造成疾病发作的原因(Bucciantini等人, Nature, 2002, 416, 507-11)。β-折叠聚集的肽或蛋白质的各种多聚体也与不同肽或蛋白质的毒性有关，范围从二聚体到可溶性低分子量低聚物、原细纤维或不溶性原纤维沉积物。

阿尔茨海默病(AD)是一种神经病症，主要认为是由淀粉样斑块引起的，淀粉样斑块是大脑中(β淀粉样蛋白)Aβ聚集体异常沉积的细胞外积聚。AD的其他主要神经病理学特征是细胞内神经原纤维缠结(NFT)，其起源于过度磷酸化Tau蛋白、错误折叠的Tau或病理性Tau及其构象异构体的聚集。AD与许多神经退行性Tau蛋白病，特别是特定类型的额颞叶痴呆(FTD)有相同的病因。Tau蛋白是一种易溶的“天然未折叠”蛋白，与微管(MT)强烈结合以促进其组装和稳定性。MT对于神经元的细胞骨架完整性-从而对于神经元回路的正确形成和功能，因此对于学习和记忆是至关重要的。Tau与MT的结合受到动态磷酸化和去磷酸化的控制，这主要在体外和非神经元细胞中得到证实。在AD大脑中，Tau病理学(Tau蛋白病)的发展晚于淀粉样蛋白病理学，但仍存在争论的是Aβ蛋白是否是AD的病因，这构成了所谓淀粉样蛋白级联假说的实质(Hardy等人, Science 1992, 256, 184-185; Musiek等人,Nature Neurosciences 2015, 18(6), 800-806)。将淀粉样蛋白与Tau病理学联系起来的确切机制在很大程度上尚不清楚，但已提出涉及激活作用于GSK3和cdk5或由GSK3和cdk5作为主要“Tau激酶”的神经元信号传导通路(Muyllaert等人, Rev. Neurol. (Paris),2006, 162, 903-7; Muyllaert等人, Genes Brain and Behav. 2008, Suppl 1, 57-66)。即使Tau蛋白病的发生晚于淀粉样蛋白，它也不仅是单纯的副作用，而是AD中主要的病理执行者。在实验性小鼠模型中，由于缺乏Tau蛋白，淀粉样蛋白病理学引起的认知缺陷几乎得到了完全减轻(Roberson等人, Science, 2007, 316(5825), 750-4)，并且认知功能障碍和痴呆的严重程度与Tau蛋白病而不是淀粉样蛋白病理学相关。

涉及Tau聚集体的疾病通常被列为Tau蛋白病，并且它们包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、家族性AD、PART(原发性年龄相关性Tau蛋白病)、克雅病、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann-Sträussler-Scheinker病(GSS)、包涵体肌炎、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤(TBI)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、关岛帕金森症-痴呆综合征、非关岛运动神经元病伴神经原纤维缠结、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性(CBD)、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、17号染色体相关的额颞叶痴呆伴帕金森症(FTDP-17)、Hallervorden-Spatz病、多系统萎缩(MSA)、C型Niemann-Pick病、苍白球-脑桥-黑质变性(pallido-ponto-nigral degeneration)、皮克氏病(PiD)、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化性全脑炎、缠结优势型痴呆、脑炎后帕金森症、强直性肌营养不良、亚急性硬化性全脑病(subacute sclerosis panencephalopathy)、LRRK2突变、慢性创伤性脑病(CTE)、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、其他额颞叶变性、瓜德罗普帕金森症(Guadeloupean Parkinsonism)、脑组织铁沉积神经变性病、SLC9A6-相关智力迟钝、白质Tau蛋白病伴球状胶质细胞包涵体、癫痫、路易体痴呆(LBD)、轻度认知障碍(MCI)、多发性硬化、帕金森病、HIV相关痴呆、成年型糖尿病、老年性心脏淀粉样变性、青光眼、缺血性发作、AD和亨廷顿病中的精神病。(Williams等人, Intern. Med. J., 2006, 36, 652-60;Kovacs等人, J Neuropathol Exp Neurol. 2008; 67(10): 963-975; Higuchi等人,Neuropsychopharmacology - 5th Generation of Progress, 2002, 第9节, 第94章:1339-1354; Hilton等人, Acta Neuropathol. 1995;90(1):101-6; Iqbal等人,Biochimica et Biophysica Acta 1739 (2005) 198-210; McQuaid等人, NeuropatholAppl Neurobiol. 1994 Apr;20(2):103-10; Vossel等人, Lancet Neurol 2017; 16:311-22; Stephan等人, Molecular Psychiatry (2012) 17, 1056-1076; Anderson等人,Brain (2008), 131, 1736-1748; Savica等人, JAMA Neurol. 2013;70(7):859-866;Brown等人 Molecular Neurodegeneration 2014, 9:40; El Khoury等人, Front. Cell.Neurosci., 2014, Volume 8, Article22: 1-18; Tanskanen等人, Ann. Med. 2008;40(3):232-9; Gupta等人, CAN J OPHTHALMOL—VOL. 43, NO. 1, 2008: 53-60; Dickson等人, Int J Clin Exp Pathol 2010;3(1):1-23; Fernández-Nogales等人, NatureMedicine, 20, 881-885 (2014); Bi等人, Nature Communications volume 8, Articlenumber: 473 (2017); Murray等人, Biol Psychiatry. 2014年4月1日; 75(7): 542-552)。

在2017年用于治疗阿尔茨海默病的临床试验中的所有药剂中，靶向Tau的药剂非常稀少，且仅代表II期临床试验的8% (Cummings等人, Alzheimer's & Dementia:Translational Research & Clinical Interventions 3 (2017) 367-384)。目前靶向Tau蛋白的治疗方法主要包括基于抗体的方法，主要限制是仅靶向细胞外Tau。在使用小分子的方法中，尽管在毒性和特异性方面非常具有挑战性，但已经开发了几种Tau激酶抑制剂。然而，目前仅有一种激酶抑制剂尼罗替尼在临床试验中进行测试。最后，在Tau聚集抑制剂中，仅一种LMTX目前处于临床试验中(Cummings等人, 2017)。尽管近年来，基于Tau的治疗已成为日益关注的焦点，但仍非常需要靶向已知或推测会导致Tau蛋白病的病理性Tau构象异构体的另外的治疗剂。

WO2011/128455涉及适合用于治疗与淀粉样蛋白或类淀粉样蛋白相关的病症的具体化合物。

WO2010/080253涉及二吡啶基吡咯衍生物化合物，其可用于治疗适合蛋白激酶信号转导抑制、调节和/或调控的疾病。

发明概述

本发明的一个目的是提供可用于治疗、减轻或预防一组与Tau蛋白聚集体相关的病症和异常的化合物，所述病症和异常包括但不限于NFT，例如阿尔茨海默病(AD)。此外，本领域需要可用作治疗剂的化合物，所述治疗剂用于(a)通过识别聚集的Tau和解聚Tau，例如通过改变Tau聚集体分子构象来减少Tau聚集体/NFT，和/或(b)防止Tau聚集体的形成，和/或(c)细胞内干扰Tau聚集体，和/或(d)体内减少Tau错误折叠和过度磷酸化，和/或(f)减少神经炎性标志物。本发明人惊人地发现，这些目的可以通过下文所述的式(I)的化合物来实现。

式(I)的化合物(a)通过识别聚集的Tau和解聚Tau，例如通过改变Tau聚集体分子构象，显示出减少Tau聚集体的高能力，和/或(b)防止Tau聚集体的形成，和/或(c)细胞内干扰Tau聚集体，和/或(d)体内减少Tau错误折叠和过度磷酸化，和/或(f)减少神经炎性标志物。虽然不希望受理论的束缚，但假设式(I)化合物抑制Tau聚集或解聚预形成的Tau聚集体，包括当存在于细胞内时。由于它们独特的设计特征，这些化合物显示诸如适当的亲脂性和分子量、脑摄取和药代动力学、细胞渗透性、溶解性和代谢稳定性的性质，以便成为用于治疗、减轻或预防Tau蛋白病的成功药物。

通过组织病理学分析以及通过体内Tau PET成像，Tau NFT病变的积累已显示与AD中的认知缺陷良好相关。本发明的化合物可以预防Tau聚集体的形成，或解聚预先存在的Tau聚集体，并且因此可以预期预防或减少AD中相关的认知缺陷。

超微结构分析表明Tau包涵体由成对的螺旋丝(PHF)或直丝(SF)构成。高分辨率结构分析已经显示，这些丝由核心区域构成，所述核心区域包含采用交叉β/β螺旋结构的Tau的氨基酸306-378。本发明的化合物可以识别聚集的Tau和解聚Tau，例如，通过改变Tau聚集体分子构象，并且因此可以预期促进Tau清除。

此外，已经显示Tau能够在细胞间增殖，并且某些形式的Tau (充当种子)能够诱导健康细胞内天然Tau蛋白的结构变化，以经历错误折叠和聚集。认为聚集的Tau负责接种，并因此负责Tau病理扩散。本发明的化合物可以在细胞内干扰聚集的Tau，并且因此可以预期减少Tau病理扩散，并最终预防或减少AD中的相关认知缺陷。

Tau聚集级联以Tau错误折叠和过度磷酸化开始。这些事件被认为先于细胞内Tau神经元包涵体的形成，并因此先于Tau病理的建立和传播。本发明的化合物可以减少体内Tau错误折叠和过度磷酸化，并且因此可以预期在治疗、减轻或预防与Tau病理相关的疾病中是有益的。

最后，现在充分建立了Tau病理与神经炎症之间的联系。神经炎症是AD早期已经存在的关键事件，并且被认为是引发PHF中Tau聚集的原因之一。此外，一旦在脑中充分建立了Tau病理，几种Tau蛋白病小鼠模型显示显著的神经炎症，表明Tau病理也可诱导神经炎性过程。这两个发现表明Tau病理和神经炎症在正反馈环中联系。本发明的化合物在Tau病理的情况下减少神经炎性标志物。

本发明公开了新的式(I)的化合物，其具有(a)减少Tau聚集体，识别聚集的Tau和解聚Tau，例如，通过改变Tau聚集体的分子构象，和/或(b)防止Tau聚集体的形成，和/或(c)细胞内干扰Tau聚集体，和/或(d)减少体内Tau错误折叠和过度磷酸化，和/或(f)减少神经炎性标志物的能力。本发明提供了使用式(I)的化合物或其药物组合物治疗与Tau蛋白聚集体相关的病症和异常的方法，所述病症和异常包括但不限于NFT。本发明还提供了一种药物组合物，其包含式(I)的化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明总结于以下项目：

1. 式(I)的化合物:

及其所有立体异构体、外消旋混合物、互变异构体、药学上可接受的盐、前药、水合物、溶剂化物和多晶型物；

其中

A选自

可以在任何可利用的位置与Q连接，其中

被一个或多个取代基R^j取代，并且其中

可以任选被一个或多个取代基R取代；

B选自O和NR^a；

E和V独立地选自N、NR⁵、O和S；

G选自苯环、嘧啶环和吡啶环；

J选自O和N-R¹；

Q选自N和C-R¹；

Y选自CZ和N，条件是当Y是N且Y¹、Y²和Y³是CZ时，B是N-烷基或O；

Y¹选自CZ和N；

Y²选自CZ和N；

Y³选自CZ和N；

Z独立地选自H、卤素、O-烷基、烷基和CN；

R独立地选自

和-NR³R⁴；

R^a选自H和烷基；

R^b、R^c、R^d、R^e、R^f和R^g独立地选自H和烷基，或者R^b、R^c、R^d、R^e、R^f和R^g中的任何两个可以连接以形成3至8-元环；

R^j独立地选自-卤素、-O-烷基、-CF₃、-CN、-NR³R⁴、

和

，其中含C_1-2碳原子的桥可以存在于a碳原子和c或d碳原子之间，或者其中含C_1-2碳原子的桥可以存在于b碳原子和c或d碳原子之间；

R¹选自H和烷基；

R²独立地选自烷基、F和=O，其中所述烷基可以任选被卤素、-OH或-O-烷基取代，并且其中如果两个R²处于孪位(geminal)，则它们可以连接以形成3至6-元环；

R³和R⁴独立地选自H和烷基，其中所述烷基可以任选被卤素、-OH或-O-烷基取代；

R⁵选自H和烷基；

n是0、1、2、3或4。

r和s独立地是0、1、2或3；和

t和u独立地是1、2或3。

2. 根据项1的化合物，其是式(Ia)的化合物：

其中A、B、R^b、R^c、R^d、R^e、R^f、R^g、Y和Z如项1中所定义。

3. 根据项1的化合物，其是式(Ib)的化合物：

其中A、B、R^b、R^c、R^d、R^e、R^f、R^g和Z如项1中所定义。

4. 根据项1至3中任一项的化合物，其中A是

和

，其中

和

可以在任何可利用的位置与Q或与N连接，其中

被一个或多个取代基R^j取代，和其中

可任选被一个或多个取代基R取代。

5. 根据项1至3中任一项的化合物，其中A是

，其中

可以在任何可利用的位置与Q或与N连接，和其中

可以任选被一个或多个取代基R取代。

6. 根据项1至5中任一项的化合物，其是式(Ic)的化合物：

其中E、R、V和Z如项1中所定义。

7. 根据项1至4中任一项的化合物，其是式(Id)的化合物：

其中R^a、R^j和Z如项1中所定义并且p是1或2。

8. 根据项1的化合物，其中所述化合物选自

。

9. 药物组合物，其包含项1至8中任一项所定义的化合物，和任选的药学上可接受的载体或赋形剂。

10. 项1至8中任一项所定义的化合物，其用作药物。

11. 式(I)的化合物：

其用于治疗、减轻或预防与Tau蛋白聚集体相关的病症或异常，

其中

A选自

可以在任何可利用的位置与Q连接、其中

被一个或多个取代基R^j取代和其中

可以任选被一个或多个取代基R取代；

B选自O和NR^a；

E和V独立地选自N、NR⁵、O和S；

G选自苯环、嘧啶环和吡啶环；

J选自O和N-R¹；

Q选自N和C-R¹；

Y选自CZ和N；

Y¹选自CZ和N；

Y²选自CZ和N；

Y³选自CZ和N；

Z独立地选自H、卤素、O-烷基、烷基和CN；

R独立地选自

和-NR³N⁴；

R^a选自H和烷基；

R^j独立地选自-卤素、-O-烷基、-CF₃、-CN、-NR³R⁴、

和

R¹选自H和烷基；

R²独立地选自烷基、F和=O，其中所述烷基可任选被卤素、-OH或-O-烷基取代，和其中如果两个R²处于孪位，则它们可以连接以形成3至6-元环；

R⁵选自H和烷基；

n是0、1、2、3或4；

r和s独立地是0、1、2或3；和

t和u独立地是1、2或3。

12. 用于根据项11所述用途的化合物，其中所述式(I)的化合物如项1至8中任一项所定义。

13. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物，其用于降低Tau聚集。

14. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物，其用于防止Tau聚集体形成和/或用于抑制Tau聚集。

15. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物，其用于细胞内干扰Tau聚集体。

16. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物，其用于在体内减少Tau错误折叠和过度磷酸化。

17. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物，其用于减少神经炎性标志物。

18. 治疗、预防或减轻与Tau蛋白聚集体相关的病症或异常的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如项1至8或11中任一项所定义的化合物。

19. 降低Tau聚集的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如项1至8或11中任一项所定义的化合物。

20. 防止Tau聚集体形成和/或抑制Tau聚集的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如项1至8或11中任一项所定义的化合物。

21. 细胞内干扰Tau聚集体的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如项1至8或11中任一项所定义的化合物。

22. 在体内减少Tau错误折叠和过度磷酸化的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如项1至8或11中任一项所定义的化合物。

23. 减少神经炎性标志物的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如项1至8或11中任一项所定义的化合物。

24. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物在制备用于治疗、预防或减轻与Tau蛋白聚集体相关的病症或异常的药物中的用途。

25. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物在制备用于降低Tau聚集的药物中的用途。

26. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物在制备用于防止Tau聚集体形成和/或用于抑制Tau聚集的药物中的用途。

27. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物在制备用于细胞内干扰Tau聚集体的药物中的用途。

28. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物在制备用于在体内减少Tau错误折叠和过度磷酸化的药物中的用途。

29. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物在制备用于减少神经炎性标志物的药物中的用途。

29. 混合物，其包含如项1至8中任一项所定义的化合物和至少一种选自与如项1至8中任一项所定义的化合物不同的治疗剂的其他生物活性化合物，

其中所述混合物还包含至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和赋形剂。

30. 根据项29的混合物，其中所述其他生物活性化合物是用于治疗淀粉样变性的化合物。

31. 根据项29或30的混合物，其中所述化合物和/或其他生物活性化合物以治疗有效量存在。

32. 根据项29至31中任一项的混合物，其中所述其他生物活性化合物选自抗氧化应激的化合物、抗凋亡化合物、金属螯合剂、DNA修复抑制剂如哌仑西平和代谢物、3-氨基-1-丙磺酸(3APS)、1,3-丙二磺酸盐(1,3PDS)、α-分泌酶激活剂、β-和γ-分泌酶抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、O-GlcNAcase (OGA)抑制剂、神经递质、β-折叠破坏剂、β淀粉样蛋白清除/耗竭细胞组分的引诱剂、N-末端截短的淀粉样蛋白β的抑制剂包括焦谷氨酸化的淀粉样蛋白β3-42、抗炎分子、或胆碱酯酶抑制剂(ChEI)如他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐和/或加兰他敏、M1激动剂、其它药物包括任何淀粉样蛋白或Tau修饰药物和营养补充剂、抗体，包括任何其功能等效抗体或功能部分或疫苗。

33. 根据项32的混合物，其中所述其他生物活性化合物是胆碱酯酶抑制剂(ChEI)。

34. 根据项32的混合物，其中所述其他生物活性化合物选自他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐、加兰他敏、烟酸和美金刚。

35. 根据项32的混合物，其中所述其他生物活性化合物是抗体，特别是单克隆抗体，包括任何其功能等效抗体或功能部分。

36. 根据项29至35中任一项的混合物，其中所述化合物和/或其他生物活性化合物以治疗有效量存在。

37. 用于根据项11所述用途的化合物，根据项18的方法，或者根据项24的用途，其中所述病症选自阿尔茨海默病(AD)、家族性AD、原发性年龄相关性Tau蛋白病(PART)、克雅病、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann-Sträussler-Scheinker病(GSS)、包涵体肌炎、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤(TBI)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、关岛帕金森症-痴呆综合征、非关岛运动神经元病伴神经原纤维缠结、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性(CBD)、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、17号染色体相关的额颞叶痴呆伴帕金森症(FTDP-17)、Hallervorden-Spatz病、多系统萎缩(MSA)、C型Niemann-Pick病、苍白球-脑桥-黑质变性(pallido-ponto-nigral degeneration)、皮克氏病(PiD)、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化性全脑炎、缠结优势型痴呆、脑炎后帕金森症、强直性肌营养不良、亚急性硬化性全脑病(subacute sclerosis panencephalopathy)、LRRK2突变、慢性创伤性脑病(CTE)、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、其他额颞叶变性、瓜德罗普帕金森症(Guadeloupean Parkinsonism)、脑组织铁沉积神经变性病、SLC9A6-相关智力迟钝、白质Tau蛋白病伴球状胶质细胞包涵体、癫痫、路易体痴呆(LBD)、轻度认知障碍(MCI)、多发性硬化、帕金森病、HIV相关痴呆、成年型糖尿病、老年性心脏淀粉样变性、青光眼、缺血性发作、AD和亨廷顿病中的精神病，优选阿尔茨海默病(AD)、皮质基底节变性(CBD)、皮克氏病(PiD)和进行性核上性麻痹(PSP)。

38. 如项1至8或11中任一项所定义的化合物作为分析参考物或体外筛选工具的用途。

定义

在本申请的含义内，应用以下定义：

“烷基”是指由碳和氢原子组成的饱和直链或支链有机部分。合适的烷基基团的实例具有1-6个碳原子，优选1-4个碳原子，并且包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、叔丁基和异丁基。烷基可任选被卤素(优选F)、-OH或-O烷基(优选-OMe)取代。

“Hal”或“卤素”是指F、Cl、Br和I。

“3-8元环”是指三-、四-、五-、六-、七-或八-元环，其中在环中零个、一个或多个碳原子被1或2个(对于三元环)、1、2或3个(对于四元环)、1、2、3或4个(对于五元环)或1、2、3、4或5个(对于六元环)、1、2、3、4、5或6个(对于七元环)或1、2、3、4、5、6或7个(对于八元环)相同或不同的杂原子代替，其中杂原子选自O、N和S。

具有一个或多个光学活性碳的本发明化合物可以以外消旋体和外消旋混合物(包括所有比例的混合物)、立体异构体(包括非对映异构体混合物和单独的非对映异构体、对映异构体混合物和单一的对映异构体、构象异构体的混合物和单一构象异构体)、互变异构体、阻转异构体和旋转异构体的形式存在。所有的异构体形式都包括在本发明中。本发明中描述的含有烯属双键的化合物包括E和Z几何异构体。本发明还包括所有药学上可接受的盐、前药、多晶型物、水合物和溶剂化物。

术语“多晶型物”是指本发明化合物的各种结晶结构。这可以包括但不限于晶体形态(和无定形材料)和所有晶格形式。本发明的盐可以是结晶的，并且可以以多于一种多晶型物存在。

本发明还包括盐的溶剂化物、水合物以及无水形式。溶剂化物中包含的溶剂没有特别限制，并且可以是任何药学上可接受的溶剂。实例包括水和C_1-4醇(例如甲醇或乙醇)。

“药学上可接受的盐”定义为所公开的化合物的衍生物，其中通过制备其酸或碱盐来修饰母体化合物。药学上可接受的盐的实例包括但不限于碱性残基如胺的无机或有机酸盐；酸性残基如羧酸的碱或有机盐；等。药学上可接受的盐包括例如由无毒的无机酸或有机酸形成的母体化合物的常规无毒盐或季铵盐。例如，这种常规无毒盐包括衍生自无机酸的那些盐，所述无机酸例如但不限于盐酸、氢溴酸、硫酸、氨基磺酸、磷酸、硝酸等；和由有机酸制备的盐，所述有机酸例如但不限于乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、扑酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧基苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙二磺酸、草酸、羟乙磺酸等。本发明的药学上可接受的盐可以通过常规化学方法从含有碱性或酸性部分的母体化合物合成。通常，这种盐可以通过使这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的合适的碱或酸在水中或在有机溶剂中或在两者的混合物中反应来制备。有机溶剂包括但不限于非水介质，如醚、乙酸乙酯、乙醇、异丙醇或乙腈。合适的盐的列表可见于Remington's PharmaceuticalSciences, 18^th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1990, p. 1445，其公开内容特此通过引用并入。

本发明的化合物还可以以前药的形式提供，即在体内代谢为活性代谢物的化合物。如在下文本发明说明书和权利要求书中所用，术语“前药”是指任何由于体内生物转化而释放活性母体药物的共价键合的化合物。描述前药的Goodman和Gilman的参考文献(ThePharmacological Basis of Therapeutics, 8 ed, McGraw-Hill, Int. Ed. 1992, "Biotransformation of Drugs", p 13-15)一般性地特此通过引用并入本文。

“药学上可接受的”定义为在合理的医学判断范围内适用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的那些化合物、材料、组合物和/或剂型。

本发明中的患者或对象典型地是动物，特别是哺乳动物，更特别是人。

本文所用的“Tau”是指主要在神经元中发现的高度可溶的微管结合蛋白，并且包括主要的6种同种型、裂解或截短形式和其它修饰形式，例如由磷酸化、糖基化、糖化、脯氨酰异构化、硝化、乙酰化、多胺化、泛素化、类泛素化和氧化产生的修饰形式。

“聚集的Tau”指Tau肽或蛋白的聚集单体，其折叠成寡聚或多聚结构。

本文所用的“神经原纤维缠结”(NFT)是指含有成对螺旋丝(PHF)和直丝的过度磷酸化Tau蛋白的不溶性聚集体。它们的存在是AD和其它称为Tau蛋白病的疾病的标志。

本文所用的术语“抗体(antibody或antibodies)”是本领域公认的术语，并且应理解为是指与已知抗原结合的分子或分子的活性片段，或者特别是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的抗原结合部分。特别地，本发明的混合物包括本发明的化合物和抗Tau或抗Aβ抗体。

本文所用的术语“其功能等效抗体或功能部分”应理解为是指与已知抗原结合的等效分子或分子的活性片段，或者特别是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的抗原结合部分，并具有与衍生其的抗体基本相同的(生物)活性。

在本发明的混合物中报道的“疫苗(vaccine或vaccines)”特别是Tau或Aβ疫苗。

除非另有说明，否则在“定义”部分中给出的定义和优选定义适用于以下描述的所有实施方案。

附图简述

图1：用实施例12和实施例45处理的rTg4510小鼠中定量的CSF中的Tau。

图2：用实施例12和实施例45处理的rTg4510小鼠中的Tau错误折叠定量。

图3：用实施例12和实施例45处理的rTg4510小鼠中的Iba1 (A)和CD68 (B)定量。

图4：用实施例45减少人AD和PSP脑切片中NFT中的Tau错误折叠。

图5：用³H-实施例45 (A)和³H-实施例45和冷的实施例45 (B)对人AD脑切片进行的高分辨率放射自显影。

发明详述

下面将描述本发明的化合物。应当理解，还设想了以下定义的所有可能的组合。

在一个实施方案中，本发明涉及式(I)的化合物：

及其所有立体异构体、外消旋混合物、互变异构体、药学上可接受的盐、前药、水合物、溶剂化物和多晶型物。

式(I)的化合物的一个优选实施方案是

。

式(I)的化合物的进一步优选实施方案是

。

式(I)的化合物的进一步优选实施方案是

。

在进一步的优选实施方案中，式(I)的化合物是

。

甚至更优选地，式(I)的化合物是

或

甚至更优选为

。

A的以下定义适用于式(I)的化合物及其优选的实施方案。

A选自

，其中G选自苯环、嘧啶环和吡啶环。因此，

覆盖以下优选实施方案：

。

并且因此，

覆盖以下实施方案：

。在一个优选的实施方案中，

选自

。

可以设想以下环：

。优选的实施方案包括

。在这些结构式中，环G未完全示出，而仅由部分键

表示。

在一个优选实施方案中，A选自

。

在另一个优选实施方案中，A是

。在一个优选实施方案中，A是

。

在一个更优选的实施方案中，A选自

。在一个更优选的实施方案中， A选自

。

在进一步优选的实施方案中，A选自

。

在一个甚至更优选的实施方案中，A是

。

在上述A及其优选实施方案的定义中，

可以在任何可利用的位置与Q连接。

在上述A及其优选实施方案的定义中，

被一个或多个取代基R^j取代。

在上述A及其优选实施方案的定义中，

可以任选被一个或多个取代基R取代。

适当时，以下定义适用于式(I)及其优选实施方案。

B选自O和NR^a。更优选地，B是NR^a，最优选NH。

E和V独立地选自N、NR⁵、O和S。由于含有E和V的环是不饱和的，E和V中的至少一个是N。

J选自O和N-R¹，更优选O。

Q选自N和C-R¹。优选地，Q选自N和CH，更优选地，Q是N。

Y选自CZ和N。更优选地，Y选自CH和N。甚至更优选地，Y是CH。在一个实施方案中，如果Y是N且Y¹、Y²和Y³是CZ，则B是N-烷基或O，优选B是N-烷基。

Y¹选自CZ和N。优选地，Y¹是CZ。

Y²选自CZ和N。优选地，Y²是CZ。

Y³选自CZ和N。优选地，Y³是CZ。

Z独立地选自H、卤素(优选F)、O-烷基、烷基和CN，优选H、卤素(优选F)和O-烷基。在一个优选实施方案中，一个Z独立地是卤素(优选F)或O-烷基和另一个Z是H。在一个更优选的实施方案中，一个Z是卤素(优选F)和另一个Z是H。

R独立地选自

和-NR³R⁴，优选地R选自

和-NR³R⁴，更优选地R是

，例如

。在这些实施方案中，

优选是

。

R^a选自H和烷基，更优选H和Me，甚至更优选H。

R^b、R^c、R^d、R^e、R^f、R^g独立地选自H和烷基，或者R^b、R^c、R^d、R^e、R^f、R^g中的任何两个(例如，与相同或相邻环原子连接的那些)可以连接以形成3至8元环。更优选地，R^b、R^c、R^d、R^e、R^f、R^g独立地是H或烷基，甚至更优选H。

R^j独立地选自-卤素、-O-烷基、-CF₃、-CN、-NR³R⁴、

和

，其中含C_1-2碳原子的桥可以存在于a碳原子和c或d碳原子之间，或者其中含C_1-2碳原子的桥可以存在于b碳原子和c或d碳原子之间。更优选地，R^j选自-卤素、-O-烷基、-NR³R⁴和

，甚至更优选地，R^j是

。

R¹选自H和烷基，优选烷基，更优选CH₃。

R²独立地选自烷基、F和=O，其中所述烷基可以任选被卤素、-OH或-O-烷基取代，和其中如果两个R²处于孪位，则它们可以连接以形成3至6-元环。在一个实施方案中，R²是任选取代的烷基，在另一个实施方案中，R²是F，在进一步的实施方案中，R²是=O。

R³和R⁴独立地选自H和烷基，其中所述烷基可以任选被卤素、-OH或-O-烷基取代。在一个实施方案中，R³或R⁴是任选取代的烷基和另一个是H。在另一个实施方案中，R³是烷基和R⁴是任选取代的烷基。在进一步的实施方案中，R³和R⁴是H。

R⁵选自H和烷基，在一个实施方案中，R⁵是H，在另一个实施方案中，R⁵是烷基。

n是0、1、2、3或4，优选地，n是0或1，更优选地，n是0。

p是1或2，更优选1。

r和s独立地是0、1、2或3。

t和u独立地是1、2或3。

优选的式(I)的化合物是

。

实施例中还说明了优选的化合物。

在本发明中还设想了本文公开的实施方案、优选实施方案和更优选实施方案的任何组合。

药物组合物

虽然本发明的化合物可以单独给药，但是优选根据标准药学实践将它们配制成药物组合物。因此，本发明还提供了药物组合物，其包含任选地与药学上可接受的载体、稀释剂、助剂或赋形剂混合的治疗有效量的式(I)的化合物。

药学上可接受的赋形剂在药学领域是众所周知的，并且例如描述于Remington'sPharmaceutical Sciences, 15^th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1975)中。可以根据预期的给药途径和标准药物实践选择药物赋形剂。赋形剂在对其接受者无害的意义上必须是可接受的。

可用于本发明药物组合物制剂中的药学上有用的赋形剂可包括，例如，载体、媒介物、稀释剂、溶剂，例如一元醇如乙醇、异丙醇和多元醇如二醇，和食用油如大豆油、椰子油、橄榄油、红花油、棉籽油、油酯如油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、粘合剂、助剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂、崩解剂、助流剂、润滑剂、缓冲剂、乳化剂、湿润剂、悬浮剂、甜味剂、着色剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、抗氧化剂、加工剂、药物递送改性剂和增强剂，例如磷酸钙、硬脂酸镁、滑石、单糖、二糖、淀粉、明胶、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、右旋糖、羟丙基-β-环糊精、聚乙烯吡咯烷酮、低熔点蜡、和离子交换树脂。

本发明化合物的给药(递送)途径包括但不限于以下一种或多种：口服(例如作为片剂、胶囊剂或作为可吸收溶液)、局部、粘膜(例如作为用于吸入的鼻喷雾剂或气雾剂)、鼻、肠胃外(例如通过可注射形式)、胃肠、脊柱内、腹膜内、肌内、静脉内、子宫内、眼内、皮内、颅内、气管内、阴道内、脑室内、大脑内、皮下、眼科(包括玻璃体内或前房内)、透皮、直肠、颊、硬膜外和舌下。

例如，化合物可以片剂、胶囊剂、ovules、酏剂、溶液剂或混悬剂的形式口服给药，其可以含有调味剂或着色剂，用于立即、延迟、改性、持续、脉冲或控制释放施用。

该片剂可含有赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸，崩解剂例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，以及制粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。另外，可以包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。相似类型的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填充剂。在这方面优选的赋形剂包括乳糖(lactose)、淀粉、纤维素、乳糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于水性混悬剂和/或酏剂，该试剂可以与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料，与乳化剂和/或悬浮剂以及与稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油及其组合结合。

如果本发明的化合物经肠胃外给药，则这种给药的实例包括以下一种或多种：静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内或皮下给药化合物；和/或通过使用输注技术。对于肠胃外给药，化合物最好以无菌水溶液形式使用，该水溶液可以含有其他物质，例如，足够的盐或葡萄糖以使溶液与血液等渗。如果需要，水溶液应该适当地缓冲(优选至3至9的pH)。无菌条件下合适的肠胃外制剂的制备可以通过本领域技术人员众所周知的标准制药技术容易地完成。

如所指出的，本发明的化合物可以鼻内或通过吸入给药，并以干粉吸入器的形式或以气溶胶喷雾呈递的形式从加压容器、泵、喷雾器或雾化器中使用合适的推进剂方便地递送，所述推进剂例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、氟代烷烃如1,1,1,2-四氟乙烷(HFA134AT)或1,1,1,2,3,3,3-七氟丙烷(HFA 227EA)、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，剂量单位可通过提供阀门以递送计量的量来确定。加压容器、泵、喷雾器或雾化器可含有活性化合物的溶液或悬浮液，例如使用乙醇和推进剂的混合物作为溶剂，其可另外含有润滑剂，例如，脱水山梨醇三油酸酯。可将用于吸入器或吹入器的胶囊和药筒(例如，由明胶制成)配制成含有化合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉的粉末混合物。

或者，本发明的化合物可以以栓剂或阴道栓剂的形式给药，或者其可以以凝胶、水凝胶、洗剂、溶液剂、乳霜、软膏或扑粉剂的形式局部施用。本发明的化合物还可以例如通过使用皮肤贴剂经皮或透皮给药。

它们也可以通过肺或直肠途径给药。它们也可以通过眼途径给药。对于眼科用途，可以将化合物在等渗无菌盐水中配制成微粉化悬浮液(调节pH)，或者优选在等渗无菌盐水中配制成溶液(调节pH)，任选与防腐剂如苯扎氯铵组合。或者，它们可以配制在软膏如凡士林中。

为了局部施用于皮肤，本发明的化合物可以配制成合适的软膏，该软膏含有悬浮或溶解在例如含有以下一种或多种的混合物中的活性化合物：矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、乳化蜡和水。或者，它们可以配制成合适的洗剂或乳霜，悬浮或溶解在例如以下一种或多种的混合物中：矿物油、脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚乙二醇、液体石蜡、聚山梨酯60、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。

通常，医师将确定最适合个体对象的实际剂量。任何特定个体的具体剂量水平和给药频率都可以改变，并且将取决于多种因素，包括所用具体化合物的活性，该化合物的代谢稳定性和作用时间，年龄，体重，一般健康，性别，饮食，给药方式和时间，排泄率，药物组合，特定病况的严重程度以及接受治疗的个体。

用于向人(约70 kg体重)给药的根据本发明化合物的建议剂量为0.1 mg至3 g，0.1 mg至2 g，0.1 mg至1 g，优选1 mg至500 mg活性成分/单位剂量。单位剂量可以每天例如给药1-4次。剂量将取决于给药途径。应当理解，可能有必要根据患者的年龄和体重以及所治疗病况的严重程度对剂量进行常规改变。确切的剂量和给药途径最终将由主治医师或兽医决定。

本发明的化合物也可以与其他治疗剂组合使用。当本发明的化合物与对相同疾病有效的第二治疗剂组合使用时，每种化合物的剂量可以不同于单独使用该化合物时的剂量。

以上提及的组合可以方便地以药物制剂的形式供使用。可以通过任何方便的途径在分开的或组合的药物制剂中依次或同时给药这种组合的各个组分。当顺序给药时，可以首先给药本发明的化合物或第二治疗剂。当同时给药时，可以以相同或不同的药物组合物给药该组合。当在相同制剂中组合时，将理解的是，两种化合物必须是稳定的，并且彼此以及与制剂的其他组分相容。当分开配制时，它们可以以任何方便的制剂形式提供，以本领域中这种化合物已知的方式方便地提供。

可以以本领域技术人员本身已知的如例如在Remington's PharmaceuticalSciences, 15^th Ed., Mack Publishing Co., New Jersey (1975)中描述的方式制备本发明的药物组合物。

可以用本发明的化合物治疗、减轻或预防的疾病或病况是与Tau蛋白聚集体相关的病症或异常，例如神经退行性病症。可以治疗、减轻或预防的疾病和病况的实例是由神经原纤维病变的形成引起或与之相关。这是Tau蛋白病中主要的脑部病理。所述疾病和病况包括神经退行性疾病或病况的异质组，包括显示Tau和淀粉样蛋白病理并存的疾病或病况。

可以治疗、减轻或预防的疾病和病况的实例包括但不限于阿尔茨海默病(AD)、家族性AD、PART(原发性年龄相关性Tau蛋白病)、克雅病、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann-Sträussler-Scheinker病(GSS)、包涵体肌炎、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤(TBI)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、关岛帕金森症-痴呆综合征、非关岛运动神经元病伴神经原纤维缠结、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性(CBD)、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、17号染色体相关的额颞叶痴呆伴帕金森症(FTDP-17)、Hallervorden-Spatz病、多系统萎缩(MSA)、C型Niemann-Pick病、苍白球-脑桥-黑质变性(pallido-ponto-nigral degeneration)、皮克氏病(PiD)、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化性全脑炎、缠结优势型痴呆、脑炎后帕金森症、强直性肌营养不良、亚急性硬化性全脑病(subacute sclerosis panencephalopathy)、LRRK2突变、慢性创伤性脑病(CTE)、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、其他额颞叶变性、瓜德罗普帕金森症(Guadeloupean Parkinsonism)、脑组织铁沉积神经变性病、SLC9A6-相关智力迟钝、白质Tau蛋白病伴球状胶质细胞包涵体、癫痫、路易体痴呆(LBD)、轻度认知障碍(MCI)、多发性硬化、帕金森病、HIV相关痴呆、成年型糖尿病、老年性心脏淀粉样变性、青光眼、缺血性发作、AD和亨廷顿病中的精神病。优选地，可以治疗、减轻或预防的疾病和病况包括阿尔茨海默病(AD)以及其他神经退行性Tau蛋白病，例如克雅病、拳击员痴呆、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性(CBD)、17号染色体相关的额颞叶痴呆伴帕金森症(FTDP-17)、皮克氏病(PiD)、进行性核上性麻痹(PSP)、缠结优势型痴呆、关岛帕金森症-痴呆综合征、Hallervorden-Spatz病、慢性创伤性脑病(CTE)、创伤性脑损伤(TBI)以及其他额颞叶变性。更优选阿尔茨海默病(AD)、皮质基底节变性(CBD)、皮克氏病(PiD)和进行性核上性麻痹(PSP)。

本发明的化合物也可用于减少蛋白质聚集，特别是Tau聚集。化合物降低Tau聚集的能力可以例如使用ThT测定法确定(Hudson等人, FEBS J., 2009, 5960-72)。

本发明的化合物可用于治疗多种病症，其中神经炎症过程与Tau蛋白的错误折叠和/或病理聚集有关。

本发明的化合物可用作分析参考物或体外筛选工具，以用于表征具有Tau病理的组织并用于测试靶向这种组织上的Tau病理的化合物。

本发明的化合物可用作将化合物交联至靶标的光探针，用于体外筛选测定法中，以鉴定和表征化合物的作用方式，包括绘制结合位点。以下报道了本发明化合物的光探针的一些实例：

。

本发明的化合物也可以与至少一种其他生物活性化合物和/或药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂的混合物形式提供。化合物和/或其他生物活性化合物优选以治疗有效量存在。

其他生物活性化合物的性质将取决于混合物的预期用途。其他生物活性物质或化合物可以通过与根据本发明的化合物相同或相似的机制或通过不相关的作用机制或通过多个相关和/或不相关的作用机制发挥其生物学作用。

通常，其他生物活性化合物可以包括神经元传递增强剂、精神治疗药物、乙酰胆碱酯酶抑制剂、钙通道阻滞剂、生物胺、苯并二氮杂䓬镇定剂、乙酰胆碱合成、储存或释放增强剂、乙酰胆碱突触后受体激动剂、单胺氧化酶-A或-B抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸谷氨酸受体拮抗剂、非甾体类抗炎药、抗氧化剂和血清素受体拮抗剂。特别地，其他生物活性化合物可以选自用于治疗淀粉样变性的化合物、抗氧化应激的化合物、抗凋亡化合物、金属螯合剂、DNA修复抑制剂如哌仑西平和代谢物、3-氨基-1-丙磺酸(3APS)、1,3-丙二磺酸盐(1,3PDS)、α-分泌酶激活剂、β-和γ-分泌酶抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、O-GlcNAcase(OGA)抑制剂、神经递质、β-折叠破坏剂、β淀粉样蛋白清除/耗竭细胞组分的引诱剂、N-末端截短的淀粉样蛋白β的抑制剂包括焦谷氨酸化的淀粉样蛋白β3-42、抗炎分子、或胆碱酯酶抑制剂(ChEI)如他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐和/或加兰他敏、M1激动剂、其它药物包括任何淀粉样蛋白或Tau修饰药物和营养补充剂、抗体包括任何其功能等效抗体或功能部分或疫苗。

在进一步的实施方案中，根据本发明的混合物可以包含烟酸或美金刚以及根据本发明的化合物和任选地药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。

在本发明的又一个实施方案中，提供了混合物，其包含作为其他生物活性化合物的“非典型抗精神病药”，例如氯氮平、齐拉西酮、利培酮、阿立哌唑或奥氮平，用于治疗阳性和阴性精神病症状，包括幻觉、妄想、思维障碍(表现为明显的不连贯、脱轨、言不及义)，和怪异或杂乱无章的行为以及快感不足、垂头丧气的情感、冷漠和社交退缩，以及根据本发明的化合物和任选的药学上可接受的载体和/或稀释剂和/或赋形剂。

可以适合与根据本发明的化合物组合用于混合物中的其他化合物例如描述于WO2004/058258(尤其参见第16和17页)中，包括治疗药物靶标(第36至39页)、烷磺酸和烷醇硫酸(第39至51页)、胆碱酯酶抑制剂(第51至56页)、NMDA受体拮抗剂(第56至58页)、雌激素(第58至59页)、非甾体类抗炎药(第60和61页)、抗氧化剂(第61和62页)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)激动剂(第63至67页)、降胆固醇药(第68至75页)、淀粉样蛋白抑制剂(第75至77页)、淀粉样蛋白形成抑制剂(第77至78页)、金属螯合剂(第78和79页)、抗精神病药和抗抑郁药(第80至82页)、营养补充剂(第83至89页)和增加大脑中生物活性物质利用率的化合物(参见第89至93页)和前药(第93和94)，该文献通过引用并入本文。

本发明还包括本发明化合物的所有合适的同位素变体。本发明化合物的同位素变体定义为其中至少一个原子被具有相同原子序数但原子质量不同于自然界通常发现的原子质量的原子替代的变体。可以掺入本发明化合物中的同位素的实例包括氢、碳、氮、氧、硫、氟和氯的同位素，例如分别为²H、³H、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁷O、¹⁸O、³⁵S、¹⁸F和³⁶Cl。本发明的某些同位素变体，例如其中掺入了放射性同位素如³H或¹⁴C的那些，可用于药物和/或底物组织分布研究。含氘(即³H)的同位素和碳14(即¹⁴C)同位素由于其易于制备和可检测性而特别优选。¹⁸F-标记的化合物特别适合于成像应用，例如PET。此外，用同位素如氘(即²H)替代可以提供由于更高的代谢稳定性而产生的某些治疗优势，例如，增加的体内半衰期或降低的剂量要求，并且因此在某些情况下可能是优选的。本发明化合物的同位素变体通常可以通过常规程序，例如通过说明性方法或通过以下实施例和制备中描述的制备，使用合适试剂的适当同位素变体来制备。

本发明的化合物可以通过以下方案中所示的一般方法之一来合成。给出这些方法仅用于说明目的，并且不应解释为限制性的。

用于制备本发明的结构单元(building block)的一般合成方案：

在合适的溶剂中，在酸性条件(Fischer-吲哚合成)下加热市售的苯肼衍生物(Z = H、F、Cl、Me或OMe；R^a = H、CH₃)与市售的4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯，纯化后得到三环2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚结构单元。如果使用2-或3-取代的苯肼衍生物，则通过超临界流体色谱法(SFC)分离区域异构体。进一步用Boc₂O处理在吲哚环上带有NH部分的三环结构单元，以选择性保护脂族仲胺部分，并在纯化后获得。

为了避免通过使用2-或3-取代的苯肼衍生物形成区域异构体，使用了具有与肼部分相邻的额外的卤素原子(Br、Cl)的相应的苯肼衍生物。因此，在合适的溶剂中，在酸性条件下，用市售的4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯进行Fischer吲哚合成，纯化后仅得到具有额外卤素原子的单一产物。脂族仲胺经Boc保护，并在纯化后得到产物。然后在合适的溶剂中使用适当的碱，通过钯催化剂氢化除去额外的卤素原子，以在纯化后得到期望的三环2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚结构单元。

然后在适当的溶剂中，使用合适的碱，用碘甲烷或甲苯磺酰氯处理吲哚部分的NH-部分，以在纯化后得到N-甲基或N-甲苯磺酰基衍生物。在适当的溶剂中，通过酸处理除去Boc保护基，以在纯化后得到期望的三环2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚结构单元。如果没有碱处理，则获得相应的盐。

在适当的溶剂中用甲基肼处理市售的在3、4或5位具有F原子和在2位具有额外的卤素原子(Br、Cl)的氟吡啶衍生物，以在纯化后得到相应的N-甲基肼衍生物。在合适的溶剂中，在酸性条件下，用市售的4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯进行Fischer吲哚合成，在纯化后得到期望的三环9-甲基-6,7,8,9-四氢-5H-吡咯并[2,3-b:4,5-c']二吡啶衍生物。

在合适的溶剂中，在酸性条件下，加热市售的苯肼衍生物(Z = F)与市售的3-氧代-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(Fischer吲哚合成)，在纯化后得到三环5,6,7,8,9,10-六氢-7,10-桥亚胺基环庚三烯并[b]吲哚衍生物。在2-或3-取代的苯肼衍生物的情况下，必须通过超临界流体色谱法(SFC)分离区域异构体。然后将脂族仲胺部分进行Boc保护，并在纯化后获得产物。然后在适当的溶剂中，使用合适的碱，用甲苯磺酰氯处理吲哚部分的NH-部分，以在纯化后得到N-甲苯磺酰基衍生物。在适当的溶剂中，通过酸处理除去Boc保护基，以在纯化后得到期望的三环5,6,7,8,9,10-六氢-7,10-桥亚胺基环庚三烯并[b]吲哚结构单元。如果没有碱处理，则获得相应的盐。

在适当的溶剂中，用N-羟基邻苯二甲酰亚胺和氯化亚铜(I)和吡啶处理市售的苯基硼酸酯衍生物(Z = F)，以在纯化后得到相应的含有邻苯二甲酰亚胺保护基的羟胺衍生物。用水合肼裂解邻苯二甲酰亚胺保护基，并得到盐形式的相应的羟胺衍生物。在合适的溶剂中，在酸性条件下，加热羟胺衍生物与市售的1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷(Fischer吲哚合成)，在纯化后得到三环1,2,3,4-四氢苯并呋喃并[3,2-c]吡啶衍生物。

在适当的溶剂中，用伯胺或仲胺和另外的碱处理市售的含有两个卤素(Br、Cl)原子的苯并[d]噻唑(G = Ph)或苯并[d]噁唑(G = Ph)衍生物。通过亲核取代用伯胺或仲胺替代离去基团X，以在纯化后得到相应的氨基取代的苯并[d]噻唑或苯并[d]噁唑衍生物。在较低反应性胺的情况下，通过在微波条件下进行亲核取代反应获得期望的苯并[d]噻唑或苯并[d]噁唑衍生物。在适当的溶剂中，用吗啉和另外的碱处理含有两个卤素(Br、Cl)原子的相应的噻唑并[5,4-b]吡啶(G = Py)和噻唑并[4,5-b]吡啶(G = Py)衍生物，以在纯化后得到相应的吗啉代-噻唑并[5,4-b]吡啶(G = Py)和吗啉代-噻唑并[4,5-b]吡啶(G = Py)衍生物。在适当的溶剂中用吗啉和另外的碱处理相应的含有两个卤素(Br、Cl)原子的噻唑并[5,4-d]嘧啶(G =嘧啶)衍生物，以在纯化后得到相应的吗啉代-噻唑并[5,4-d]嘧啶(G =嘧啶)衍生物。

在微波条件下用吗啉处理市售的含有两个卤素(Br、Cl)原子的[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶衍生物，以在纯化后得到亲核置换产物。

在微波条件下用吗啉、3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷或8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷处理市售的含有两个溴原子的3,6-二溴哒嗪和2,5-二溴吡嗪衍生物，以在纯化后得到亲核置换产物。

在微波条件下用吗啉处理市售的含有两个卤素(Br、Cl)原子的2,7-二氯喹啉、2-溴-6-氯-1,7-萘啶、2-溴-6-氯-1,8-萘啶和2,6-二氯喹啉衍生物，以在纯化后得到亲核置换产物。

用于制备本发明化合物的一般合成方案：

通过钯化学，在合适的溶剂(四氢呋喃；THF)中，用合适的钯催化剂(氯-(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯)[2-(2-氨基乙基)苯基]钯(II)-甲基叔丁基醚加合物；Pd(RuPhos) G1)、配体(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基联苯；RuPhos)和碱(双(三甲基甲硅烷基)氨基锂；LiHMDS)使B = NCH₃或B = O的三环结构单元与氨基取代的苯并[d]噻唑或苯并[d]噁唑衍生物或取代的吡啶衍生物偶联，以在纯化后得到期望的式(I)的化合物。

通过钯化学，在合适的溶剂(1,4-二噁烷)中，用合适的钯催化剂(三(二亚苄基丙酮)二钯(0)；Pd₂(dba)₃)、配体(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基联苯；RuPhos)和碱(叔丁醇钠；NaOtBu)使在吲哚/氮杂吲哚部分含有N-甲苯磺酰基的三环结构单元与氨基取代的苯并[d]噻唑、苯并[d]噁唑、噻唑并[5,4-b]吡啶(G = Py)、噻唑并[4,5-b]吡啶(G = Py)衍生物、噻唑并[5,4-d]嘧啶(G =嘧啶)或氨基取代的[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶衍生物、或氨基取代的吡啶(L = Py)、吡嗪(L =吡嗪)、哒嗪(L =哒嗪)、嘧啶(L =嘧啶)衍生物、或氨基取代的异喹啉、萘啶、喹唑啉衍生物偶联，以在纯化后得到期望的式(I)的化合物。或者，通过钯化学，在合适的溶剂(1,4-二噁烷)中，用合适的钯催化剂(三(二亚苄基丙酮)二钯(0)；Pd₂(dba)₃)、配体(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基联苯；RuPhos)和较弱的碱(碳酸铯；Cs₂CO₃)使在吲哚/氮杂吲哚部分含有N-甲苯磺酰基的三环结构单元与氨基取代的苯并[d]噻唑、苯并[d]噁唑、噻唑并[5,4-b]吡啶(G = Py)、噻唑并[4,5-b]吡啶(G = Py)衍生物、噻唑并[5,4-d]嘧啶(G =嘧啶)或氨基取代的[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶衍生物、或氨基取代的吡啶(L = Py)、吡嗪(L =吡嗪)、哒嗪(L =哒嗪)、嘧啶(L =嘧啶)衍生物、或氨基取代的异喹啉、萘啶、喹唑啉衍生物偶联，以在纯化后得到N-甲苯磺酰基保护的化合物。然后在升高的温度(回流)下，在合适的溶剂(2-甲基THF，甲醇)中，使用合适的碱(碳酸铯；Cs₂CO₃)除去甲苯磺酰基保护基，以在纯化后得到期望的式(I)的化合物。

在合适的溶剂(DMF)中，用合适的碱(碳酸钾； K₂CO₃)，使在吲哚部分含有N-甲苯磺酰基的三环结构单元与二卤代的苯并[d]噻唑和二卤代的苯并[d]噁唑偶联以得到亲核置换产物。然后通过钯化学，在合适的溶剂(1,4-二噁烷)中，用合适的钯催化剂(三(二亚苄基丙酮)二钯(0)；Pd₂(dba)₃)、配体(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基联苯；RuPhos)和碱(叔丁醇钠；NaOtBu)使该产物偶联，以在纯化后得到期望的式(I)的化合物。

用于制备本发明的氚-标记的化合物的一般合成方案：

将催化剂加入氚反应容器中，随后加入本发明化合物的二氯甲烷溶液。将该容器连接至氚线，并在-200℃下加压至氚气。将该溶液在室温搅拌8小时，冷却至-200℃并除去过量的气体。将反应烧瓶用甲醇冲洗，并将合并的有机相在真空下蒸发。将粗物质通过HPLC纯化，将流动相在真空下蒸发，并将产物重新溶解在无水乙醇中。比活度通过质谱法确定。

可以使用本领域已知的任何合适的测定法来测量Tau K18和全长(f1)Tau的解聚。描述了用于测量解聚能力的标准体外测定法。

实施例

所有试剂和溶剂均获自商业来源，并且不经进一步纯化即可使用。在氘代溶剂中，在Bruker AV 300和400 MHz光谱仪上记录¹H NMR光谱。化学位移(δ)以百万分率报告，并且耦合常数(J值)以赫兹计。自旋多重性由以下符号表示：s(单峰)、d(二重峰)、t(三重峰)、q(四重奏)、m(多重峰)、bs(宽单峰)。在具有6130 Chemstation的Agilent 1290 InfinityII光谱仪和具有6130 Chemstation的Agilent 1200 Infinity II光谱仪上获得质谱。使用Agilent 7890B气相色谱仪和5977B质谱仪收集GC-MS数据。在PerkinElmer光谱仪上获得红外光谱。如具体实施例所示，使用硅胶(Fluka：硅胶60，0.063-0.2mm)和合适的溶剂进行色谱法。使用具有HP-Sil或KP-NH SNAP筒(Biotage)的Biotage Isolera和具体实施例中所示的溶剂梯度进行快速纯化。在硅胶板上用UV检测进行薄层色谱法(TLC)。

制备实施例1

步骤A

在冰浴温度下向4-氟苯基肼(1 g, 7.9 mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.2 g,8.3 mmol)在1,4-二噁烷(10 mL)中的溶液中加入浓H₂SO₄ (1 mL)。然后将反应混合物在110℃加热3小时。将反应混合物冷却至室温，滤出沉淀物。将固体溶解在用NaOH溶液碱化的水中，并用DCM(二氯甲烷)萃取。分离有机相，经Na₂SO₄干燥，并除去溶剂，以得到为淡黄色固体的标题化合物(950 mg, 59 %)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(0.95 g, 4.77 mmol)在THF(四氢呋喃)中的溶液中加入二碳酸二叔丁酯(Boc₂O) (1.5 g)，并将混合物搅拌过夜。通过TLC证实反应完成后，除去溶剂，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/庚烷梯度(10/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到为淡黄色胶状液体的标题化合物(1.1 g, 78 %)。

步骤C

向来自上述步骤B的标题化合物(0.41 g, 1.41 mmol)在THF (5 mL)中的溶液中加入氢化钠(0.15 g, 6.25 mmol)，随后加入对甲苯磺酰氯(TsCl) (0.29 g, 1.45 mmol)。将反应混合物搅拌10分钟。将混合物溶解于EtOAc (20 ml)中，用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/庚烷梯度(20/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到标题化合物(0.45 g, 72 %)。

步骤D

向来自上述步骤C的标题化合物(0.42 g, 0.915 mmol)在二氯甲烷中的溶液中加入于1,4-二噁烷中的2N HCl (5 mL)。将反应混合物搅拌过夜。反应完成后，蒸发反应混合物以除去溶剂，并用乙醚洗涤，以得到为灰白色固体的标题化合物(0.2 g, 58 %)。

步骤E

向来自上述步骤D的标题化合物(5.0 g, 13 mmol)在二氯甲烷(50 mL)中的溶液中加入三乙胺(5 mL)，并搅拌10分钟。将反应混合物用二氯甲烷(20 mL)稀释，用水(2 X 30 mL)和NaCl饱和溶液(30 mL)洗涤。合并的有机层经硫酸钠干燥，并真空浓缩，以得到为游离碱的标题化合物(定量收率)。

制备实施例2

步骤A

向来自制备实施例1步骤B的标题化合物(0.41 g, 1.41 mmol)在THF (5 mL)中的溶液中加入氢化钠(0.067 g, 2.82 mmol)，将悬浮液在室温搅拌20分钟。将反应混合物再次冷却至0℃，并加入碘甲烷(0.24 g, 1.45 mmol)。将反应混合物搅拌3小时。将反应混合物溶解于EtOAc (15 mL)中，并用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(20/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到标题化合物(0.3 g, 70 %)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(0.3 mg, 0.986 mmol)在二氯甲烷中的溶液中加入于1,4-二噁烷中的2N HCl (5 mL)。将反应混合物搅拌过夜。蒸发反应混合物以除去溶剂，并用乙醚洗涤，以得到为灰白色固体的标题化合物(0.12 g, 60 %)。

制备实施例3

步骤A

在冰浴温度下，向1-(4-氟苯基)-1-甲基肼(2 g, 14.0 mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.84 g, 14.0 mmol)在1,4-二噁烷(10mL)中的溶液中加入浓H₂SO₄ (1 mL)。然后将反应混合物在110℃加热过夜。将反应混合物冷却至室温，滤出沉淀物。丢弃滤液。将固体溶解在水(10 mL)中，用NaOH溶液将pH调节至14，并且用二氯甲烷(150 mL)萃取混合物。有机相用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。除去溶剂，以得到为游离碱的标题化合物(1.3 g, 46%)。

制备实施例4

步骤A

在冰浴温度下，向(4-甲氧基苯基)肼(1 g, 5.6 mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.13 g, 5.6 mmol)在1,4-二噁烷(10 mL)中的溶液中加入浓H₂SO₄ (1 mL)。然后将反应混合物在110℃加热3小时。将反应混合物冷却至室温，滤出沉淀物。将固体溶解在用NaOH溶液碱化的水中，并用二氯甲烷萃取。分离有机相，经Na₂SO₄干燥，过滤，并除去溶剂，以得到为淡黄色胶状液体的标题化合物(0.60 g, 53 %)。将粗产物原样用于下一步。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(0.60 mg, 2.9 mmol)在THF中的溶液中加入二碳酸二叔丁酯(0.65 g, 2.9 mmol)，并将混合物搅拌过夜。除去溶剂，并且使用Biotage IsoleraOne纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(80/20)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到为淡黄色固体的标题化合物(0.55 g, 62 %)。

步骤C

向来自上述步骤B的标题化合物(0.55 g, 1.8 mmol)在THF (5 mL)中的溶液中加入氢化钠(0.087 g, 3.6 mmol)，随后加入对甲苯磺酰氯(0.342 g, 1.8 mmol)。将反应混合物搅拌45分钟。反应完成后，将反应混合物溶于EtOAc (200 mL)中，并用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(20/80)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到为灰白色固体的标题化合物(0.45 g ,45 %)。

步骤D

向来自上述步骤C的标题化合物(0.450 g, 0.986 mmol)在二氯甲烷中的溶液中加入于1,4-二噁烷中的2N HCl (5 mL)。将反应混合物搅拌过夜。反应完成后，蒸发反应混合物以除去溶剂，并用乙醚洗涤，以得到为灰白色固体的化合物(0.23 g, 65 %)。

制备实施例5

步骤A

在0℃下，向来自制备实施例4步骤B的标题化合物(0.55 g, 1.8 mmol)在THF (5 mL)中的溶液中加入氢化钠(0.087 g, 3.6 mmol)。将该悬浮液在室温搅拌20分钟。将反应混合物再次冷却至0℃，并加入碘甲烷(0.255 g, 1.8 mmol)。将反应混合物搅拌45分钟。反应完成后，将反应混合物溶于EtOAc (20 ml)中，用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥，过滤并浓缩。使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(80/20)在硅胶柱上纯化粗制混合物，以得到为淡棕色固体的标题化合物(0.40 g, 45 %)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(0.4 g, 1.26 mmol)在二氯甲烷中的溶液中加入于1,4-二噁烷中的2N HCl (5 mL)。将反应混合物搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物蒸发以除去溶剂，并用乙醚洗涤，以得到为白色固体的标题化合物(0.2 g, 73 %)。

制备实施例6

步骤A

将2-氯-5-氟吡啶(10 g, 76.34 mmol)和N-甲基肼(6 mL)的混合物在微波炉中于180℃照射1小时。反应完成后，将反应混合物冷却，并将反应混合物倒入冰冷的水中，并用二氯甲烷(2 x 50 mL)萃取。分离有机相，经Na₂SO₄干燥，并除去溶剂，以得到为淡棕色固体的标题化合物(10 g, 粗品)。将粗产物原样用于下一步。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(10 g, 70.84 mmol)在甲醇(100 mL)中的溶液中加入4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(16.9 g, 85 mmol)，并搅拌过夜。除去溶剂，使用BiotageIsolera One纯化系统采用甲醇/DCM梯度(1/99)在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到为棕色胶状油的标题化合物(5 g, 22 %)。

步骤C

将来自上述步骤B的标题化合物(5 g, 15.50 mmol)和二甘醇(5 mL)的混合物在微波炉中于180℃照射1小时。反应完成后，将反应混合物冷却，并将反应混合物倒入冰冷的水中，并用二氯甲烷(2 x 50 mL)萃取。分离有机相，经Na₂SO₄干燥，并除去溶剂，将粗混合物通过制备型HPLC纯化(柱：Phenomenex Gemini C18 (150*4.6)mm, 3.0μm。流动相A：10mM乙酸铵/Milli-Q水。流动相B：乙腈，流速：1.0 ml/min)，以得到为棕色固体的标题化合物(0.9g, 29 %)。

制备实施例7

步骤A

在0℃下向3-(氟苯基)肼(1 g, 6.1 mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(1.2 g, 6.1mmol)在1,4-二噁烷(10 mL)中的溶液中加入浓H₂SO₄ (1 mL)。然后将反应混合物温热至25℃并在110℃加热3小时。将反应混合物冷却至室温，并滤出沉淀物。将固体溶解在水中，用NaOH溶液碱化，并用二氯甲烷萃取。分离有机相，经Na₂SO₄干燥，并除去溶剂，以得到为淡黄色固体的区域异构体的混合物(0.65 g, 56 %)。

步骤B

向区域异构体的混合物(0.65 g, 3.15 mmol)在THF中的溶液中加入二碳酸二叔丁酯(0.757 g, 3.47 mmol)，并将混合物搅拌12小时。反应完成后(通过TLC监测)，将溶剂减压浓缩，以得到粗产物。将其通过硅胶(60-120目)柱色谱法使用己烷：EtOAc (70:30)纯化，以得到为黄色固体的区域异构体(分别为7-氟-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯和9-氟-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯)的混合物(0.750g, 61 %)，比例为约70：30。

步骤C

区域异构体的混合物(0.750 mg, 70:30)通过SFC手性色谱柱(Chiracel OJ-H；柱：X-bridge C8 (50 x 4.6) mm, 3.5 μm，流动相A：0.1% TFA/水，流动相B：0.1%TFA/乙腈)分离，以100%手性纯度得到为淡黄色固体的第二次洗脱的标题化合物7-氟-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(0.4 mg, 53 %)。以100%手性纯度分离出为淡黄色固体的第一次洗脱的标题化合物9-氟-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(0.25 g, 33 %)。

第二次洗脱的标题化合物：

第一次洗脱的标题化合物：

步骤D

向来自上述步骤C的第二次洗脱的标题化合物(0.4 g, 1.37 mmol)在THF (5 mL)中的溶液中加入氢化钠(0.099 mg, 4.137 mmol)，随后加入对甲苯磺酰氯(0.288 g, 1.51mmol)。将反应混合物搅拌30分钟。将混合物溶解于EtOAc (20 ml)中，用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/庚烷梯度(20/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到标题化合物(0.3 g, 49%)。

步骤E

向来自上述步骤D的标题化合物(0.3 g, 0.676 mmol)在二氯甲烷中的溶液中加入于1,4-二噁烷中的2N HCl (5 mL)。将反应混合物搅拌12小时。反应完成后，将反应混合物蒸发以除去溶剂，并用乙醚洗涤，以得到为灰白色固体的标题化合物(0.2 g 78 %)。

制备实施例8

步骤A

在0℃下向(2-氯-3-氟苯基)肼(10 g, 62.5 mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(12g, 62.5 mmol)在1,4-二噁烷(100 mL)中的溶液中加入浓H₂SO₄ (10 mL)。然后将反应混合物温热至25℃并在110℃加热3小时。将反应混合物冷却至室温，并滤出沉淀物。将固体溶解在水中，用NaOH溶液碱化，并用二氯甲烷萃取。分离有机相，经Na₂SO₄干燥，并除去溶剂，以得到为淡黄色固体的标题化合物(10 g, 72 %)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(10 g, 44.5 mmol)在THF (100 mL)中的溶液中加入二碳酸二叔丁酯(10.5 g, 46.5 mmol)，并将混合物搅拌12小时。反应完成后(通过TLC监测)，将溶剂减压浓缩，以得到粗产物。将其用硅胶(60-120目)柱色谱法纯化，以得到为黄色固体的标题化合物(12 g, 85 %)。

步骤C

向来自上述步骤B的标题化合物(5 g, 15.3 mmol)在无水甲醇(50 mL)中的溶液中加入三乙胺(6.74 mL, 46.18 mmol)和10 % Pd/C (0.2 mg, 20 % wt)。在10巴的压力下进行氢化16小时。通过硅藻土垫过滤反应混合物，并在真空下浓缩，以得到标题化合物(4 g, 90%)。

步骤D

向来自上述步骤C的标题化合物(4 g, 13.7 mmol)在THF (40 mL)中的溶液中加入氢化钠(9.9 g, 41.23 mmol)，随后加入对甲苯磺酰氯(2.88 g, 15.1 mmol)。将反应混合物搅拌30分钟。将混合物溶于EtOAc (200 ml)中，用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/庚烷梯度(20/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到标题化合物(5 g, 82 %)。

步骤E

向来自上述步骤D的标题化合物(3 g, 6.76 mmol)在二氯甲烷(30 mL)中的溶液中加入于1,4-二噁烷中的2N HCl (15 mL)。将反应混合物搅拌12小时。反应完成后，将反应混合物蒸发以除去溶剂，并用乙醚洗涤，以得到为灰白色固体的标题化合物(2 g, 78 %)。

制备实施例9

步骤A

向来自制备实施例8步骤C的标题化合物(0.4 mg, 1.37 mmol)在THF (5 mL)中的溶液中加入氢化钠(0.099 g, 4.137 mmol)，随后加入碘甲烷(0.102 ml, 1.64 mmol)。将反应混合物搅拌2小时。将混合物溶解于EtOAc (20 ml)中，用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/庚烷梯度(20/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到标题化合物(0.3 mg, 73 %)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(0.3 mg, 0.986 mmol)在二氯甲烷中的溶液中加入于1,4-二噁烷中的2N HCl (5 mL)。将反应混合物搅拌过夜。反应完成后，蒸发反应混合物以除去溶剂，并用乙醚洗涤，以得到为灰白色固体的标题化合物(0.18 g 75 %)。

制备实施例10

步骤A

向来自制备实施例7的步骤C的第一次洗脱的标题化合物(0.2 mg, 0.67 mmol)在THF(5 mL)中的溶液中加入氢化钠(0.048 g, 2.137 mmol)，随后加入对甲苯磺酰氯(0.144 g,0.76 mmol)。将反应混合物搅拌30分钟。将混合物溶解于EtOAc (20 ml)中，用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/庚烷梯度(20/80 =>80/20)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到标题化合物(0.155 g, 50 %)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(0.15 g, 0.337 mmol)在二氯甲烷中的溶液中加入于1,4-二噁烷中的2N HCl (5 mL)。将反应混合物搅拌12小时。反应完成后，蒸发反应混合物以除去溶剂，并用乙醚洗涤，以得到为灰白色固体的标题化合物(0.1 g, 71 %)。

制备实施例11

步骤A

向2-(4-氟苯基)-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷(5g, 22.51 mmol)在二氯乙烷(250 mL)中的溶液中加入N-羟基邻苯二甲酰亚胺(7.34 g, 45.03 mmol)、氯化亚铜(I) (2.22 g, 22.51 mmol)、吡啶(2.75 mL, 33.75 mmol)、分子筛(5 g)，并将反应混合物加热至70℃持续12小时。反应完成后，将反应混合物通过硅藻土床过滤，并用乙酸乙酯洗涤。浓缩乙酸乙酯层，使用Biotage Isolera One纯化系统采用己烷/EtOAc梯度(90/10 =>80/20)在硅胶上纯化粗产物，以得到为白色固体的标题化合物(1.4 g, 24 %)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(1.4g, 5.44 mmol)在氯仿：甲醇(9:1, 100 mL)中的溶液中加入水合肼(0.81 g, 16.32 mmol)，并将反应混合物在25℃搅拌12小时。反应完成后，将反应混合物通过硅藻土床过滤，并用二氯甲烷洗涤。浓缩二氯甲烷层，并将粗产物在0℃下加入到乙醚(5 mL)和2N HCl/乙醚(2 mL)中，然后使反应混合物在25℃搅拌30分钟。反应完成后，将反应混合物过滤，真空干燥，以得到灰白色固体(0.44 g, 50 %)。

步骤C

在0℃下，向来自上述步骤B的标题化合物(0.44 g, 2.7 mmol)和1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷(0.44 g, 3.07 mmol)在1,4-二噁烷(5 mL)中的溶液中加入浓H₂SO₄ (0.5mL)。将反应混合物温热至25℃，然后进一步在微波条件下在150℃加热1小时。将反应混合物冷却至25℃，并滤出沉淀物。将固体溶解在水中，用NaOH溶液碱化，并用二氯甲烷萃取。分离有机相，经Na₂SO₄干燥，并将溶剂浓缩，将粗产物原样用于下一步(0.270 g, 52 %)。

制备实施例12

步骤A

在0℃下向4-(氟苯基)肼盐酸盐(10 g, 0.061 mol)和3-氧代-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-甲酸叔丁酯(13.9 g, 0.61mol)在1,4-二噁烷(100 mL)中的溶液中加入浓H₂SO₄ (10mL)，然后将混合物加热至100℃保持12小时。反应完成后，将反应混合物冷却至室温，并通过高真空除去溶剂，以得到粗物质。用30%氢氧化钠溶液碱化粗物质，并沉淀出固体。过滤沉淀的固体，用水(100 mL)和乙醚(100 mL)洗涤，然后将固体在线真空下干燥16小时，以得到为淡棕色固体的标题化合物(11 g, 83 %)。

步骤B

在0℃下向来自上述步骤A的标题化合物(11 g, 0.051 mol)在THF (50 mL)中的溶液中加入三乙胺(11 mL, 0.076 mol)和二碳酸二叔丁酯(11.13 g, 0.051 mol)，然后在室温下搅拌12小时。经TLC证实反应完成后，除去溶剂，并将粗反应混合物通过硅胶柱，使用40%至50%乙酸乙酯/石油醚纯化，以得到为淡黄色固体的标题化合物(7.4 g, 46 %)。

步骤C

在0℃下，向上述步骤B的标题化合物(3 g, 0.009 mol)在THF (30 mL)中的溶液中分批加入氢化钠(60%，于矿物油中；0.57 g，0.014 mol)。添加完成后，使反应混合物在室温搅拌30分钟，然后将反应混合物再次冷却至0℃。在0℃下，向该混合物中滴加溶解于THF(20mL)中的对甲苯磺酰氯(2.16 g, 0.11 mol)。添加完成后，使反应混合物在室温搅拌2小时。通过TLC证实反应完成后，将反应混合物冷却至0℃并用冰水淬灭，随后使用乙酸乙酯(100mL)萃取。用水(30 mL)和盐水溶液(30 mL)洗涤乙酸乙酯层。将有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，以得到粗产物，将其通过硅胶柱使用15%至25%的乙酸乙酯/石油醚纯化，以得到为灰白色固体的标题化合物(2.9 g, 65 %)。

步骤D

在0℃下，向来自上述步骤C的标题化合物(2.9 g , 0.006 mol)在二氯甲烷(10 mL)中的溶液中加入于1,4-二噁烷中的4N HCl (20 mL)。使反应混合物在环境温度下搅拌12小时。反应完成后，蒸发反应混合物以除去溶剂，并用乙醚(10 mL)洗涤，以得到为灰白色固体的标题化合物(2.4 g, 98 %)。

制备实施例13

步骤A

向2,6-二氯苯并[d]噻唑(5 g, 24.5 mmol)在无水二氯甲烷(50 mL)中的溶液中加入吗啉(3.19 g, 36.6 mmol)，并将混合物冷却至0℃。向该冷的反应混合物中滴加三乙胺(3.71 g, 36.7 mmol)，并使该混合物在室温搅拌4小时。反应完成后，将反应混合物用H₂O(2 x 20 mL)处理，并用二氯甲烷萃取。分离有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，以得到白色固体，将其用乙醚研磨，以得到标题化合物(5 g, 96 %)。

制备实施例14

步骤A

向2,5-二氯苯并[d]噻唑(5 g, 24.5 mmol)在无水二氯甲烷(50 mL)中的溶液中加入吗啉(3.19 g, 36.6 mmol)，并将混合物冷却至0℃。向该冷的反应混合物中滴加三乙胺(3.71 g, 36.7 mmol)，并使该混合物在室温搅拌4小时。反应完成后，将反应混合物用H₂O(2 x 20 mL)处理，并用二氯甲烷萃取。分离有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，以得到白色固体，将其用乙醚研磨，以得到标题化合物(4.5 g, 86 %)。

制备实施例15

步骤A

向2,6-二氯苯并[d]噁唑(5 g, 26.8 mmol)在无水二氯甲烷(50 mL)中的溶液中加入吗啉(3.50 g, 40.3 mmol)，并将混合物冷却至0℃。向该冷的反应混合物中滴加三乙胺(4.0 g, 39.6 mmol)，并使混合物在室温搅拌4小时。反应完成后，将反应混合物用H₂O (2x 20 mL)处理，并用二氯甲烷萃取。分离有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，以得到白色固体，将其用乙醚研磨，以得到标题化合物(5 g, 78 %)。

制备实施例16

步骤A

向2,5-二氯苯并[d]噁唑(5 g, 26.8 mmol)在无水二氯甲烷(50 mL)中的溶液中加入吗啉(3.50 g, 40.3 mmol)，并将混合物冷却至0℃。向该冷的反应混合物中滴加三乙胺(4.0 g, 39.6 mmol)，并使混合物在室温搅拌4小时。反应完成后，将反应混合物用H₂O (2x 20 mL)处理，并用二氯甲烷萃取。分离有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，以得到白色固体，将其用乙醚研磨，以得到标题化合物(5.2 g, 81 %)。

制备实施例17

步骤A

向2,6-二氯苯并[d]噻唑(5 g, 24.5 mmol)在无水二氯甲烷(50 mL)中的溶液中加入2M二甲胺/THF (18.37 mL, 36.65 mol)，并将混合物冷却至0℃。向该冷的反应混合物中滴加三乙胺(6.8 mL, 49 mmol)，并使混合物在室温搅拌4小时。反应完成后，将反应混合物用H₂O (2 x 20 mL)处理，并用二氯甲烷萃取。分离有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，以得到白色固体，将其用乙醚研磨，以得到标题化合物(4.8 g, 94 %)。

制备实施例18

步骤A

向2,5-二氯苯并[d]噻唑(5 g, 24.5 mmol)在无水二氯甲烷(50 mL)中的溶液中加入2M二甲胺/THF (18.37 mL, 36.65 mol)，并将混合物冷却至0℃。向该冷的反应混合物中滴加三乙胺(6.8 mL, 49 mmol)，并使混合物在室温搅拌4小时。反应完成后，将反应混合物用H₂O (2 x 20 mL)处理，并用二氯甲烷萃取。分离有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，以得到白色固体，将其用乙醚研磨，以得到标题化合物(4.5 g, 88 %)。

制备实施例19

步骤A

向6-溴-2-氯苯并[d]噻唑(0.45 g, 1.81 mmol)在乙醇(12 mL)中的溶液中加入2M二甲胺溶液(3 mL)，并使用Biotage微波炉在100℃下将混合物加热60分钟。将反应混合物冷却至室温。除去溶剂，将粗产物在硅胶柱上使用乙酸乙酯和庚烷梯度(40/60 => 60/40)纯化，以得到为固体的标题化合物(0.441 g, 95%)。

制备实施例20

步骤A

向2,6-二氯苯并[d]噁唑(5 g, 26.6 mmol)在无水二氯甲烷(50 mL)中的溶液中加入2M二甲胺/THF (26.6 mL, 53.2 mmol)，并将混合物冷却至0℃。向该冷的反应混合物中滴加三乙胺(5.6 mL, 39.9 mmol)，并将混合物在室温搅拌4小时。反应完成后，将反应混合物用H₂O (2 x 20 mL)处理，并用二氯甲烷萃取。分离有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，以得到白色固体，将其用乙醚研磨，以得到标题化合物(5 g, 96 %)。

制备实施例21

步骤A

向2,5-二氯苯并[d]噁唑(5 g, 26.6 mmol)在无水二氯甲烷(50 mL)中的溶液中加入2M二甲胺/THF (26.6 mL, 53.2 mmol)，并将混合物冷却至0℃。向该冷的反应混合物中滴加三乙胺(5.6 mL, 39.9 mmol)，并使该混合物在室温搅拌4小时。反应完成后，将反应混合物用H₂O (2 x 20 mL)处理，并用二氯甲烷萃取。分离有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并蒸发，以得到白色固体，将其用乙醚研磨，以得到标题化合物(4.9 g, 94 %)。

制备实施例22

步骤A

向6-溴-2-氯苯并[d]噻唑(0.8 g, 3.2 mmol)在乙醇(12 mL)中的溶液中加入异丙胺溶液(1 mL)，并使用Biotage微波炉在100℃下加热混合物45分钟。将反应混合物冷却至室温。除去溶剂，将粗产物从EtOAc和正庚烷混合物中结晶，以得到为固体的标题化合物(0.663 g, 75.8 %)。

制备实施例23

步骤A

向6-溴-2-氯苯并[d]噻唑(1 g, 4.0 mmol)在乙醇(6 mL)中的溶液中加入异丙胺溶液(1.5 mL)，并使用Biotage微波炉在100℃加热混合物90分钟。将反应混合物冷却至室温。除去溶剂，将粗产物溶于二氯甲烷(150 mL)中，并用1M NaOH溶液、水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。减压除去溶剂，以得到粗产物，将其在硅胶柱上使用EtOAc和庚烷梯度(20/80 => 50/50)纯化，以得到为固体的标题化合物(0.35 g, 36 %)。

制备实施例24

步骤A

向5-溴-2-氯苯并[d]噻唑(0.9 g, 3.62 mmol)在乙醇(12 mL)中的溶液中加入4M甲胺溶液(1 mL)，并使用Biotage微波炉在100℃下将混合物加热90分钟。将反应混合物冷却至室温。除去溶剂，将粗产物在硅胶柱上使用EtOAc和庚烷梯度(20/80 => 50/50)纯化，以得到为固体的标题化合物(0.57 g, 65 %)。

制备实施例25

步骤A

向5-溴-2-氯苯并[d]噻唑(0.87 g, 3.5 mmol)在乙醇(12 mL)中的溶液中加入异丙胺溶液(1.5 mL)，并使用Biotage微波炉在100℃加热混合物60分钟。将反应混合物冷却至室温。除去溶剂，将粗产物溶于二氯甲烷(150 mL)中，并用1M NaOH溶液、水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。减压除去溶剂，以得到粗产物，将其在硅胶柱上使用EtOAc和庚烷梯度(20/80 => 50/50)纯化，以得到为固体的标题化合物(0.75 g, 79 %)。

制备实施例26

步骤A

将5-溴-3-碘吡啶-2-胺 (5 g, 16.72 mmol)和异硫氰酸苯甲酰酯 (3.29, 20.07mmol)在丙酮(10 mL)中的溶液在60℃下搅拌12小时，通过TLC监测反应。蒸发溶剂，并将固体过滤，用正己烷(200 mL)洗涤并干燥，以得到为灰白色固体的标题化合物(4 g, 52 %)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(4 g, 12.1 mmol)在1,4-二噁烷(60 mL)中的溶液中加入碳酸钾(2.5 g, 18.15 mmol)、L-脯氨酸(0.28 g, 2.43 mmol)和碘化亚铜(I) (0.462g, 2.43 mmol)。然后，将反应混合物在80℃下搅拌16小时，通过TLC监测反应。将反应混合物倒入1.0 L水和1.0 L NH₄Cl饱和水溶液中。将该悬浮液在室温搅拌1小时。过滤固体，用饱和NH₄Cl水溶液(2 x 300 mL)和水(2 x 300 mL)洗涤并干燥，以得到为灰白色固体的标题化合物(2.5 g, 粗品)。

步骤C

将来自上述步骤B的标题化合物(2 g, 5.98 mmol)在70% H₂SO₄ (6, 3.0 vol)中的悬浮液在120℃加热2小时。将反应混合物冷却至室温，并将反应混合物缓慢倒入100 mL的冷水(0℃)中。然后，通过添加50% NaOH水溶液将反应混合物调节至碱性pH。然后，将化合物用EtOAc (6 x 150 mL)萃取。合并的有机层用Na₂SO₄干燥并过滤，然后浓缩溶液，以得到为浅黄色固体的标题化合物(0.3 g, 23 %)。

步骤D

在0℃历经10分钟的时段用注射器向来自上述步骤C的标题化合物(0.3 mg, 1.3mmol)在乙腈(5 mL)中的悬浮液中加入亚硝酸叔丁酯(0.2 ml, 1.95 mmol)。然后，分批加入氯化铜(II) (0.2 g, 1.56 mmol)。在0℃下30分钟后，将反应混合物温热至室温1小时并加热至65℃，然后搅拌4小时。通过TLC监测反应进程。反应完成后，蒸发溶剂，并将产物用水(20 mL)和5% MeOH/DCM (3 x 20 mL)稀释。合并的有机物用盐水(10 mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。粗化合物通过硅胶(60-120)柱色谱法纯化，用1%甲醇/二氯甲烷洗脱，以得到为灰白色固体的标题化合物(0.15 g, 46 %)。

步骤E

向来自上述步骤D的标题化合物(0.18 g, 0.72 mmol)在无水二氯甲烷(5 mL)中的溶液中加入三乙胺(0.3 mL, 2.16 mmol)和吗啉(0.074 g, 0.86 mmol)，并将混合物在室温搅拌6小时。将反应混合物在真空下浓缩。粗化合物通过硅胶(60-120)柱色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯洗脱，以得到为灰黄色(off yellow)固体的标题化合物(0.18 g, 83 %)。

制备实施例27

步骤A

将2-溴-6-氯吡啶-3-胺(5 g, 24.1 mmol)和硫氰酸钾(7 g, 72.3 mmol)在乙醇(50mL)和浓盐酸(37%, 100 mL)中的溶液在100℃下搅拌40-45小时。通过TLC (PE/EA = 7.5/2.5)确认反应完成。将反应混合物冷却至室温并浓缩，以得到棕色固体，将其分配在二氯甲烷(150 mL)和1N NaOH水溶液(50 mL)中。将固体过滤并干燥，以得到为浅黄色固体的标题化合物(3.5 g, 79 % 收率)。

步骤B

在0℃经10分钟的时段用注射器向来自上述步骤A的标题化合物(1.5 g, 8.08 mmol)在乙腈(25 mL)中的悬浮液中加入亚硝酸叔丁酯(1.4 ml, 12.12 mmol)。然后，分批加入溴化铜(II) (2.16 g, 9.69 mmol)。在0℃下30分钟后，使反应混合物温热至室温2小时。通过TLC监测反应进程。反应完成后，蒸发溶剂，并用水(20 mL)和5% MeOH/DCM (3 x 20 mL)稀释混合物。合并的有机物用盐水(10 mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。粗化合物通过硅胶(60-120)柱色谱法纯化，并用1%甲醇/二氯甲烷洗脱，以得到为淡黄色固体的标题化合物(0.65 g, 32 %)。

步骤C

向来自上述步骤B的标题化合物(0.65 g, 2.61 mmol)在无水二氯甲烷(5 mL)中的溶液中加入三乙胺(1.1 mL, 7.83 mmol)和吗啉(0.34 g, 3.91 mmol)，并将混合物在室温搅拌6小时。将反应混合物在真空下浓缩。粗化合物通过硅胶(60-120)柱色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯洗脱，以得到为灰黄色固体的标题化合物(0.6 g, 90 %)。

制备实施例28

步骤A

将2,7-二溴-[1,2,4]三唑并[1,5-a]吡啶(0.4 g, 1.44 mmol)和吗啉(4 mL)的混合物在N₂气氛下回流4小时。将反应混合物浓缩至干。粗化合物通过硅胶(60-120)柱色谱法纯化，用10-100%的石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂洗脱，得到为白色固体的标题化合物(0.27g, 66 %)。

制备实施例29

将3,6-二溴哒嗪(0.2 g, 0.841 mmol)溶解在乙腈(2.5 mL)中。然后加入吗啉(0.110mL, 1.261 mmol)和三乙胺(0.176 mL, 1.261 mmol)，并将该悬浮液在160℃的微波中照射1小时20分钟。将反应混合物用二氯甲烷和水稀释。分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。使用Biotage Isolera One纯化系统，采用正庚烷/乙酸乙酯梯度(100/0 -> 0/100)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到为白色固体的标题化合物(0.168 g, 82 %)。

制备实施例30

在0℃下在氮气下向氢化钠(0.0404 g, 1.682 mmol)在无水THF(3 mL)中的悬浮液中加入吗啉(0.146 mL, 1.682 mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌15分钟，然后加入溶于无水THF (3 mL)中的2,5-二溴吡嗪(0.400 g, 1.682 mmol)。使反应混合物在回流条件下搅拌过夜。将其用水淬灭并将产物用EtOAc萃取三次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。使用Biotage Isolera One纯化系统采用正庚烷/乙酸乙酯梯度(100/0 -> 0/100)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到为白色固体的标题化合物(0.245 g, 60 %)。

制备实施例31

步骤A

在120℃下向2-氯-5-硝基-4-硫氰酸根合嘧啶(10 g, 46.2 mmol)在乙酸(264 mL,4617 mmol)中的热溶液中加入铁(15.47 g, 277 mmol)。将混合物在相同温度下搅拌1小时。使混合物冷却至室温，并通过过滤除去不溶物，并用乙酸洗涤。将滤液在减压下浓缩，并溶解在THF (200 mL)和EtOAc (400 mL)中，并用饱和NH₄Cl水溶液(100 mL)、饱和NaHCO₃溶液(100 mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥并在减压下除去溶剂以得到标题化合物(6.82 g, 79 %)。

步骤B

在0℃下，经30分钟向来自上述步骤A的标题化合物(8.2 g, 43 mmol)在乙腈(20 mL)中的悬浮液中加入亚硝酸叔丁酯(6.8 g, 65.9 mmol)。然后，分批加入溴化铜(II) (11.78g, 52.8 mmol)。在0℃下30分钟后，使反应混合物温热至室温并搅拌12小时。加入水(50mL)和EtOAc (100 mL)，并分离各相。将水层用EtOAc萃取两次，并将有机层合并，经Na₂SO₄干燥，并将溶剂减压蒸发。使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/正庚烷(20/80)在HP-Sil SNAP筒上纯化残余物，以得到标题化合物(4.94 g, 45 %)。

步骤C

将来自上述步骤B的标题化合物(0.157 g, 0.627 mmol)溶于吗啉(3 mL, 0.627mmol)中，并在室温下搅拌2小时。将反应混合物用二氯甲烷和水稀释。分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。使用BiotageIsolera One纯化系统采用正庚烷/乙酸乙酯梯度(100/0-> 0/100)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到为白色固体的标题化合物 (0.048 g, 30 %)。

制备实施例32

在0℃下，在氮气下，向氢化钠(0.077 g, 3.21 mmol)在无水THF(5 mL)中的悬浮液中加入(1R,5S)-3-氧杂-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷盐酸盐(0.457 g, 3.06 mmol)。将反应混合物搅拌15分钟，然后加入溶解在无水THF (5 mL)中的2,5-二溴吡嗪(0.800 g, 3.36mmol)。使反应混合物在回流条件下搅拌过夜。将反应混合物用水淬灭，并将产物用乙酸乙酯萃取3次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。使用Biotage Isolera One纯化系统采用正庚烷/乙酸乙酯梯度(100/0-> 0/100)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到为白色固体的标题化合物(0.038 mg, 5 %)。

制备实施例33

步骤A

将乙酸钯(II) (0.00651 g, 0.029 mmol)和2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(XPhos) (0.0415 g, 0.087 mmol)放入反应小瓶中，并加入脱气的1,4-二噁烷(2 mL)。将所得溶液短暂脱气。将悬浮液在100℃(在预热的加热块上)加热少于1分钟，直到溶液的颜色从橙色变成深粉红色。然后，将小瓶从加热块中取出，并加入来自制备实施例1的标题化合物(0.110 g, 0.290 mmol)、来自制备实施例29的标题化合物(0.078 g, 0.319 mmol)和碳酸铯(0.331 g, 1.015 mmol)。用氩气填充反应小瓶，然后将其关闭。将反应混合物在100℃下加热12小时。将反应混合物用乙酸乙酯和水稀释。分离有机层，水层再用乙酸乙酯萃取两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并在减压下蒸发溶剂。使用Biotage IsoleraOne纯化系统采用正庚烷/乙酸乙酯梯度(90/10 -> 0/100)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到为黄色固体的标题化合物(0.072 g, 49 %)。

制备实施例34至41f

除了使用下表中所示的三环氨基-和溴/氯-衍生物以外，按照制备实施例33中所述的钯偶联程序，制备以下化合物：

。

制备实施例42

步骤A

将乙酸钯(II) (0.0045 g, 0.020 mmol)和4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(XANTPHOS) (0.035 g, 0.061 mmol)放入反应小瓶中，并加入脱气的1,4-二噁烷(4 mL)。将所得溶液短暂脱气。将悬浮液在100℃(在预热的加热块上)加热少于1分钟，直到溶液的颜色从橙色变成深粉红色。然后，将小瓶从加热块中取出，并加入来自制备实施例1步骤E的标题化合物(70 mg, 0.203 mmol)、来自制备实施例26的标题化合物(0.067 g, 0.224mmol)和碳酸铯(0.232 g, 0.771 mmol)。用氩气填充反应小瓶，然后将其关闭。将反应混合物在100℃下加热18小时。将反应混合物用乙酸乙酯和水稀释。分离有机层，水层用乙酸乙酯再萃取两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并在减压下蒸发溶剂。使用BiotageIsolera One纯化系统采用二氯甲烷/乙基甲醇(100/00 -> 95/05)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到为黄色固体的标题化合物(0.052 g, 45 %)。

制备实施例43

步骤A

将乙酸钯(II) (0.0045 g, 0.020 mmol)和4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(XANTPHOS) (0.035 g, 0.061 mmol)放入反应小瓶中，并加入脱气的1,4-二噁烷(4 mL)。将所得溶液短暂脱气。将悬浮液在100℃(在预热的加热块上)加热少于1分钟，直到溶液的颜色从橙色变成深粉红色。然后，将小瓶从加热块中取出，并加入来自制备实施例1步骤E的标题化合物(70 mg, 0.203 mmol)、来自制备实施例27的标题化合物(0.067 g, 0.224mmol)和碳酸铯(0.232 g, 0.771 mmol)。用氩气填充反应小瓶，然后将其关闭。将反应混合物在100℃下加热18小时。将反应混合物用乙酸乙酯和水稀释。分离有机层，水层用乙酸乙酯再萃取两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并在减压下蒸发溶剂。使用BiotageIsolera One纯化系统采用二氯甲烷/乙基甲醇(100/00 -> 95/05)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到为黄色固体的标题化合物(0.048 g, 42 %)。

制备实施例44

步骤A

将3,6-二溴哒嗪(0.2 g, 0.841 mmol)溶解在乙腈(2.5 mL)中。然后加入8-氧杂-3-氮杂双环[3.2.1]辛烷(0.105 g, 0.925 mmol)和三乙胺(0.176 mL, 1.261 mmol)，并将该悬浮液在微波中照射至160℃持续1小时20分钟。将反应混合物用二氯甲烷和水稀释。分离有机层，水层用二氯甲烷萃取两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。使用Biotage Isolera One纯化系统采用正庚烷/乙酸乙酯梯度(100/0-> 0/100)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到为米色固体的标题化合物(0.152 g, 67 %)。

制备实施例45

步骤A

向2,6-二氯苯并[d]噁唑(1.2 g, 6.3 mmol)的溶液中加入于无水乙醇中的33 wt. %甲胺溶液(8 mL)，并使用Biotage微波炉在100℃下将混合物加热30分钟。将反应混合物冷却至室温，并溶于二氯甲烷(150 mL)。有机相用水、1N NaOH溶液和盐水洗涤，然后经Na₂SO₄干燥。除去溶剂，并得到标题化合物(1.08 g, 94 %)。

步骤B

在0℃下，向来自上述步骤A的标题化合物(39 mg, 1.643 mmol)在无水THF (1.5 mL)中的搅拌悬浮液中缓慢加入6-氯-N-甲基苯并[d]噁唑-2-胺(100 mg, 0.548 mmol)在无水THF (2 mL)中的溶液，并在相同温度下搅拌30分钟。然后在0℃下滴加4-甲基苯-1-磺酰氯(107 mg, 0.561 mmol)在无水THF (1.5 mL)中的溶液，并将反应混合物在0℃下搅拌2小时。将反应混合物在0℃下用冰水(4 mL)淬灭。然后将产物用乙酸乙酯萃取3次。用水、盐水洗涤合并的有机萃取物，经Na₂SO₄干燥，过滤并减压蒸发，以得到为米色固体的标题化合物(154 mg, 83 %)。

制备实施例46

步骤A

在0℃下向NaH (0.47 g, 19.55 mmol)在THF (20 mL)中的悬浮液中滴加市售的1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(2.0 g, 7.35 mmol) (溶于THF)。然后将混合物在室温搅拌1小时。之后，在0℃下加入甲苯磺酰氯(1.5 g, 7.82 mmol) (溶于THF)，然后将混合物在室温搅拌2小时。通过TLC检查反应完成后，将反应混合物用冰水淬灭，随后使用乙酸乙酯萃取。浓缩有机层，以得到标题化合物(1.8 g, 65 %)。将产物原样用于下一步。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(1.8 g, 4.22 mmol)在DCM (20 mL)中的溶液中加入于二噁烷中的4M HCl (5 mL)。将反应混合物搅拌过夜。反应完成后，将反应混合物蒸发以除去溶剂，并将残余物用乙醚洗涤，以得到为灰白色固体的标题化合物(1.0 g, 66%)。

制备实施例47

步骤A

在0℃下向市售的(2-氟苯基)肼盐酸盐(2 g, 12.34 mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(2.45 g, 12.34 mmol)在二噁烷(20 mL)中的溶液中加入浓H₂SO₄ (2 mL)。然后将反应混合物在100℃加热4小时。通过TLC证实反应完成后，将反应混合物冷却至25℃，然后浓缩。将粗混合物用10% NaOH溶液碱化，并滤出沉淀物。固体用水洗涤并在真空下干燥，以得到标题化合物(1.7 g, 75%)。

步骤B

在室温下，向来自上述步骤A的标题化合物(1.7 g，粗品)在THF (20 mL)中的搅拌溶液中加入TEA (3.76 mL, 26.82 mmol)和二碳酸二叔丁酯(2.34 mL, 10.73 mmol)。将混合物搅拌12小时。通过TLC证实反应完成后，除去溶剂，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/庚烷梯度(10/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到为淡黄色固体的标题化合物(700 mg, 27%)。

步骤C

在0℃下，向NaH (144 mg, 3.61 mmol)在THF (15 mL)中的悬浮液中滴加来自上述步骤B的标题化合物(700 mg, 2.41 mmol) (溶于THF)。然后将混合物在室温搅拌1小时。之后，在0℃下加入甲苯磺酰氯(549 mg, 2.89 mmol) (溶于THF)，然后将混合物在室温搅拌2小时。通过TLC证实反应完成后，将反应混合物用冰水淬灭，随后使用乙酸乙酯萃取。浓缩有机层，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(10/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到标题化合物(900 mg, 84%)。

步骤D

向来自上述步骤C的标题化合物(900 mg, 2.02 mmol)在DCM (10 mL)中的溶液中加入于二噁烷中的2N HCl (5 mL)。将反应混合物在室温搅拌2小时。反应完成后，将反应混合物蒸发以除去溶剂，并将残余物用乙醚洗涤，以得到为淡棕色固体的标题化合物(450 mg,65%)。

制备实施例48

步骤A

在0℃下，向NaH (300 mg, 12.39 mmol)在THF (15 mL)中的悬浮液中滴加来自制备实施例47，步骤B的标题化合物(1.2 g, 4.13 mmol) (溶于THF)。然后将反应混合物在室温搅拌1小时。之后，在0℃下加入碘甲烷 (0.5 mL, 8.26 mmol)，然后将混合物在室温搅拌2小时。完成后，将反应混合物用冰水淬灭，随后使用乙酸乙酯萃取。浓缩有机层，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(10/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到标题化合物(900 mg, 72 %)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(900 mg, 2.96 mmol)在DCM (10 mL)中的溶液中加入于二噁烷中的4M HCl (5 mL)。将反应混合物在室温搅拌2小时。反应完成后，蒸发反应混合物以除去溶剂，残余物用乙醚洗涤，以得到为淡棕色固体的标题化合物(500 mg, 83%)。

制备实施例49

步骤A

向市售的2-溴-6-氯-1,8-萘啶(0.2 g, 0.821 mmol)在无水乙腈(5 mL)中的溶液中加入碳酸钾(0.335 mg, 2.46 mmol)和吗啉(0.11 g, 1.23 mmol)。将反应混合物加热至100℃保持3小时。真空浓缩反应混合物，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(10/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到为淡黄色固体的标题化合物(170 mg, 83 %)。

制备实施例50

步骤A

向市售的2-溴-6-氯-1,7-萘啶(0.5 g, 2.05 mmol)在无水乙腈(5 mL)中的溶液中加入碳酸钾(0.837 mg, 6.16 mmol)和吗啉(0.27 g, 3.08 mmol)。将反应混合物加热至100℃保持3小时。将反应混合物在真空下浓缩，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(10/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到为淡黄色固体的标题化合物(270 mg, 53 %)。

制备实施例51

步骤A

向市售的2,7-二氯喹啉(0.5 g, 2.52 mmol)在无水DMF(5 mL)中的溶液中加入碳酸钾(1 g, 7.52 mmol)和吗啉(0.32 g, 3.78 mmol)。将反应混合物加热至100℃保持3小时。真空浓缩反应混合物，以得到为淡黄色固体的标题化合物(500 mg, 80%)。

制备实施例52

步骤A

向市售的2,6-二氯喹啉(0.5 g, 2.52 mmol)在无水DMF (5 mL)中的溶液中加入碳酸钾(1 g, 7.52 mmol)和吗啉(0.32 g, 3.78 mmol)。将反应混合物加热至100℃保持3小时。将反应混合物在真空下浓缩，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(10/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到为淡黄色固体的标题化合物(500mg, 80 %)。

制备实施例53

步骤A

将市售的4,6-二氯吡啶-3-胺(8.0 g, 49.07 mmol)和异硫氰酸苯甲酰酯(7.3 mL,53.98 mmol)在丙酮(120 mL)中的溶液在60℃搅拌3小时。通过TLC监测反应。蒸发溶剂，将固体过滤，用正己烷(100 mL)洗涤，并干燥，以得到为灰白色固体的期望产物(14.0 g,87%)。

步骤B

在0℃下，向来自上述步骤A的标题化合物(14.0 g, 42.94 mmol)在N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP) (70 mL)中的溶液中加入甲醇钠(NaOMe) (4.6 g, 85.88 mmol)。然后将混合物加热至120℃，并继续搅拌4小时。通过TLC监测反应。将反应混合物倒入冷水(300 mL)中，并获得白色沉淀。过滤固体，用水(300 mL)和正己烷(200 mL)洗涤。将化合物在真空下干燥6小时，以得到为白色固体的期望产物(14.0 g，粗品)。将产物原样用于下一步。

步骤C

将来自上述步骤B的标题化合物(14.0 g, 48.4 mmol)在70% H₂SO₄ (50.0 mL)中的悬浮液在110℃加热4小时。将反应混合物冷却至室温，并将反应混合物缓慢倒入200 mL冷水(0℃)中。然后，通过加入50%NaOH水溶液将反应混合物调节至碱性pH。然后，用EtOAc (6 x100mL)萃取化合物。合并的有机层经Na₂SO₄干燥并过滤，然后浓缩溶剂，以得到为浅黄色固体的期望产物(6 g, 67 %)。

步骤D

在0℃下，经10分钟的时段用注射器向来自上述步骤C的标题化合物(5.0 g, 27.02mmol)在乙腈(120 mL)中的悬浮液中加入亚硝酸叔丁酯(4.8 mL, 40.54 mmol)。然后，分批加入溴化铜(II) (9.0 g, 40.54 mmol)。在0℃下30分钟后，使反应混合物温热至室温2.5小时，通过TLC监测反应进程。反应完成后，蒸发溶剂，并用水(200 mL)和5 % MeOH/DCM (3x 200 mL)稀释。合并的有机物用盐水(50 mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并减压浓缩，以得到为白色固体的标题化合物(6.5 g)。将产物原样用于下一步。

步骤E

向来自上述步骤D的标题化合物(6.5 g, 26.09 mmol)在无水DCM (100 mL)中的溶液中加入三乙胺(11.2 mL, 81.5 mmol)和吗啉(2.8 mL, 28.13 mmol)。将反应混合物在室温搅拌4小时。将反应混合物在真空下浓缩。使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(10/80 => 80/20)在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到为淡黄色固体的标题化合物(4.7g, 71 %)。

制备实施例54

向2,5-二氯-1,3-苯并噁唑(0.25 g, 0.0013 mol)在乙腈(15 mL)中的搅拌溶液中加入K₂CO₃ (0.538 g, 0.0039 mol)和5-氧杂-8-氮杂螺[3.5]壬烷(0.178 g, 0.0014 mol)。之后，将反应混合物加热至70℃持续12小时。通过TLC证实反应完成后，向反应混合物中加入DCM和水(50 mL)。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，以得到为白色固体的标题化合物(0.30 g, 80.21%)。

制备实施例55

向2,5-二氯-1,3-苯并噁唑(0.60 g, 0.0032 mol)在乙腈(15 mL)中的搅拌溶液中加入K₂CO₃ (1.32 g, 0.0096 mol)和2-甲氧基乙烷-1-胺(0.266 g, 0.0035 mol)。之后，将反应混合物加热至70℃持续12小时。通过TLC证实反应完成后，向反应混合物中加入DCM和水(50 mL)。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，以得到为棕色固体的标题化合物(0.41 g, 56.24%)。

制备实施例56

向2,5-二氯-1,3-苯并噁唑(0.719 g, 0.0038 mol)在DCM (15 mL)中的搅拌溶液中加入TEA (2.67 ml, 0.0191 mol)和(2R)-2-甲基吗啉 (0.5 g, 0.00494 mol)，并在25℃下搅拌12小时。通过TLC证实完成反应后，向反应混合物中加入DCM和水(50 mL)。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，以得到为白色固体的标题化合物(0.6 g, 45.4%)。

制备实施例57

向2,5-二氯-1,3-苯并噁唑(0.360 g, 0.0019 mol)在DCM (15 mL)中的搅拌溶液中加入TEA(1.33 ml，0.0095 mol)和(2S)-2-甲基吗啉(0.25 g, 0.00247 mol)，并在25℃下搅拌12小时。通过TLC确认反应完成后，向反应混合物中加入DCM和水(50 mL)。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩。使用Biotage Isolera One纯化系统采用20-25%乙酸乙酯/石油醚在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到为白色固体的标题化合物(0.3 g, 45.5%)。

制备实施例58

在0℃下向2,5-二氯-1,3-苯并噁唑 (1.20 g, 6.38 mmol)在无水DCM (50mL)中的溶液中加入(3R)-3-甲基吗啉 (0.775 g, 7.65 mmol)和Et₃N (1.94 g, 19.10 mmol)，并在25℃下搅拌4小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物用水(20 mL)稀释，并用DCM(20 mL x 2)萃取。合并的有机萃取物经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下蒸发。

使用Biotage Isolera One纯化系统采用10-20%乙酸乙酯/石油醚在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到标题化合物(1.0 g,59.9%)。

制备实施例59

在0℃下向2,5-二氯-1,3-苯并噁唑 (1.20 g, 6.38 mmol)在无水DCM (50mL)中的溶液中加入(3S)-3-甲基吗啉 (0.775 g, 7.65 mmol)和Et₃N (1.94 g, 19.10 mmol)，并在25℃下搅拌4小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物用H₂O (20mL)稀释，并用DCM(20 mL x 2)萃取。合并的有机萃取物经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下蒸发。

使用Biotage Isolera One纯化系统采用10-20%乙酸乙酯/石油醚在硅胶柱上纯化粗反应混合物，以得到标题化合物(0.8 g,49.6%)。

制备实施例60

向2,5-二氯-1,3-苯并噁唑(0.5 g, 0.00265 mol)在乙腈(10 mL)中的搅拌溶液中加入K₂CO₃ (1.1 g, 0.00797 mol)和2-甲氧基-N-甲基乙烷-1-胺(0.284 g, 0.00319 mol)。之后，将反应混合物加热至70℃持续12小时。通过TLC证实反应完成后，向反应混合物中加入DCM和水(50 mL)。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，以得到为棕色液体的标题化合物(0.61 g, 95 %)。

制备实施例61

步骤A

向2-氨基-3-氯苯酚(4 g, 0.0280 mol)在乙醇(80 mL)中的搅拌溶液中加入二硫代碳酸O-乙酯钾盐(4.49 g, 0.0280 mol)，然后在N₂下加热至85℃持续12小时。通过LCMS证实反应完成后，将反应混合物浓缩，通过使用乙酸酸化粗产物(pH = 5)，并将固体过滤，用水洗涤，在真空下干燥6小时以得到为淡棕色固体的4-氯苯并[d]噁唑-2-硫醇(4.6 g, 89%)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(4.6 g, 0.0244 mol)在DCM (90 mL)中的溶液中加入草酰氯(3.20 mL, 0.0374 mol)，随后在0℃下加入DMF (1 mL)，然后在25℃下搅拌 1小时。然后在0℃下加入TEA (10 mL, 0.0734 mol)和吗啉(2.5 mL, 0.0293 mol)，并在氮气下在25℃搅拌2h。TLC证实反应完成后，加入水(40 mL)，并用DCM (2x50 mL)萃取。浓缩有机层，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用10-15%乙酸乙酯/石油醚在硅胶柱上纯化粗品，以得到为淡黄色固体的标题化合物(3.4 g, 58%)。

制备实施例62

步骤A

在0℃下向NaH (0.47 g,19.8 mmol)在THF (10 mL)中的悬浮液中滴加1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(1.8 g, 6.61 mmol) (溶于THF)，然后在室温下搅拌1小时。之后，在0℃下加入碘甲烷(0.7 mL, 11.76 mmol)，然后在室温搅拌2小时。通过TLC监测完成后，将反应混合物用冰水淬灭，随后使用乙酸乙酯萃取。浓缩有机层以得到粗反应混合物5-甲基-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(1.5 g，粗品)。将产物原样用于下一步。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(1.5 g, 5.24 mmol)在DCM (20 mL)中的溶液中加入于二噁烷中的4.0 M HCl (5 mL)。将反应混合物搅拌过夜。反应完成后，蒸发反应混合物以除去溶剂，并用乙醚洗涤，以得到为棕色固体的标题化合物(800 mg, 粗品)。

制备实施例63

步骤A

向(3-甲氧基苯基)肼盐酸盐(10 g, 57.4 mmol)和4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(11.3g, 57.4 mmol)在乙醇(100 mL)中的溶液中加入酒石酸。加入二甲基脲(30:70, 10 g)，并在70℃下加热16小时。将反应混合物冷却至25℃并在真空下浓缩。将残余物溶于水中，并用NaOH溶液(30%)碱化至pH = 14，并用DCM萃取。分离有机相，经Na₂SO₄干燥，过滤，将溶剂减压蒸发，以得到为淡黄色胶状物的7-甲氧基-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚(2.5 g,21 %)。将粗产物原样用于下一步。

步骤B

在25℃下，向来自上述步骤A的标题化合物(600 mg, 2.9 mmol)在THF (6 mL)中的溶液中加入三乙胺(0.8 mL, 5.8 mmol)和Boc酸酐(650 mg, 3 mmol)，并搅拌12小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物减压浓缩，并将粗产物通过快速柱色谱法使用己烷：EtOAc (80:20)纯化，以得到为淡黄色固体的7-甲氧基-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(610 mg, 68 %)。

步骤C

在0℃下，向来自上述步骤B的标题化合物(550 mg, 1.8 mmol)在THF (5 mL)中的溶液中加入NaH (60%矿物油, 0.14 g, 3.6 mmol)，并搅拌30分钟。然后加入对甲苯磺酰氯(342mg, 1.8 mmol)并搅拌45分钟。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物用水淬灭，并用EtOAc (20 mL x 3)萃取。用水、盐水洗涤合并的有机萃取物，并经Na₂SO₄干燥。过滤，并减压蒸发溶剂，以得到为灰白色固体的7-甲氧基-5-甲苯磺酰基-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(550 mg, 66 %)。将产物原样用于下一步。

步骤D

在0℃下，向来自上述步骤C的标题化合物(550 mg, 1.204 mmol)在无水DCM (5 mL)中的溶液中缓慢加入HCl (g)/二噁烷(2M, 5 mL)，并在25℃下搅拌12小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物在减压下蒸发以得到粗产物。将其用乙醚洗涤，以得到为灰白色固体的7-甲氧基-5-甲苯磺酰基-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚(350 mg, 81 %)。

制备实施例64

步骤A

在0℃下向8-甲基-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚(1 g, 5.37 mmol)在DCM(20 mL)中的搅拌溶液中加入TEA (2.25 mL, 16.1 mmol)和BOC酸酐(1.85 mL, 8.05mol)，然后在25℃搅拌12小时。通过TLC证实反应完成后，向反应混合物中加入水，随后使用DCM萃取。分离有机层，并用盐水溶液洗涤，浓缩并用己烷洗涤，以得到为灰白色固体的标题化合物(1.1 g, 71%)。

步骤B

在0℃下，向氢化钠(0.125 g, 3.13 mmol)在THF (10 mL)中的悬浮液中滴加来自上述步骤A的标题化合物(0.6 g, 2.08 mmol)(溶解在20 mL THF中)，然后在室温下搅拌30分钟。之后，在0℃下滴加甲苯磺酰氯(1.19 g, 6.25 mmol)(溶于20 mL THF中)，然后在室温下搅拌3小时。通过TLC证实反应完成后，将反应混合物用冰水淬灭，将形成的固体过滤并用水洗涤并干燥，以得到为白色固体的标题化合物(0.550 g, 57 %)。

步骤C

在0℃下，向来自上述步骤B的标题化合物(0.55 g, 1.20 mmol)在DCM中的溶液中加入于二噁烷中的4M HCl (4 mL)。将反应混合物搅拌2小时。反应完成后，蒸发反应混合物以除去溶剂，并用乙醚过滤，以得到为白色固体的标题化合物(0.40 g, 85.9 %)。

制备实施例65

步骤A

在0℃下向8-氯-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚(1 g, 4.84 mmol)在DCM (20mL)中的搅拌溶液中加入TEA (2.02 mL, 14.5 mmol)和BOC酸酐(1.67 mL, 7.26 mmol)，然后在25℃搅拌12小时。通过TLC证实反应完成后，向反应混合物中加入水，随后使用DCM萃取。分离有机层，并用盐水溶液洗涤，浓缩，以得到为白色固体的8-氯-1,3,4,5-四氢吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(1 g, 66.5%)。

步骤B

在0℃下，向冷却至0℃的氢化钠(0.096 g, 2.42 mmol)在THF (10 mL)中的悬浮液中滴加来自上述步骤A的标题化合物(0.5 g, 1.61 mol)(溶于20 mL THF中)，然后在室温下搅拌30分钟。之后，在0℃下滴加甲苯磺酰氯(0.921 g, 48.3 mol)(溶于20 mL THF中)，并且然后在室温下搅拌3小时。通过TLC证实反应完成后，将反应混合物用冰水淬灭，随后使用乙酸乙酯(100 mL)萃取。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩。产物通过硅胶柱色谱法使用石油醚/乙酸乙酯(75:25)纯化，以得到为白色固体的8-氯-5-(对甲苯磺酰基)-3,4-二氢-1H-吡啶[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(0.450 g, 60 %)。

步骤C

向0℃下向来自上述步骤B的标题化合物(0.45 g, 0.97 mol)在DCM中的溶液中加入于二噁烷中的4M HCl (3 mL)。将反应混合物搅拌2小时。反应完成后，蒸发反应混合物以除去溶剂，并用乙醚浓缩，以得到为白色固体的标题化合物(0.32 g, 91%)。将产物原样用于下一步。

制备实施例66

步骤A

在0℃下向5-溴-2-氯苯并[d]噁唑(1 g, 4.30 mmol)在无水 DCM (10 mL)中的溶液中加入吗啉(0.56 g, 6.42 mmol)和Et₃N (1.7 mL, 12.9 mmol)，并在25℃下搅拌4小时。反应完成后(通过TLC监测)，将反应混合物用H₂O (10 mL)稀释，并用DCM (10 mL x 2)萃取。合并的有机萃取物经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下蒸发以得到粗产物。将其用乙醚(100 mL)研磨，过滤，用乙醚(5 mL)洗涤，干燥，以得到为灰白色固体的标题化合物(0.85 g, 71%)。

制备实施例67

步骤A

向4,6-二氯吡啶-3-胺(2.5 g, 15.3 mmol)在THF (50 mL)中的搅拌溶液中滴加于THF中的三光气(4.55 g, 15.3 mol)，然后加入TEA (4.28 mL, 30.7 mol)并加热至回流2小时。将反应混合物在真空下浓缩。将残余物溶于乙腈(50 mL)中，并加入甲苯(50 mL)和吗啉(1.34 g, 15.3 mmol)，并加热至110℃持续12小时。检查TLC后，将粗品浓缩并通过硅胶柱色谱法使用石油醚：乙酸乙酯(20:80)纯化，以得到为白色固体的N-(4,6-二氯-3-吡啶基)吗啉-4-甲酰胺(3.0 g, 70.1%)。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(3.0 g, 10.8 mmol)在1,4-二噁烷(5 mL)中的溶液中加入Cs₂CO₃ (10.5 g, 32.4 mol)、1,10-菲咯啉(0.972 g, 5.40 mol)和碘化亚铜(1.03 g,5.40 mol)，然后加热至120℃保持12小时。将反应混合物通过硅藻土过滤，并用DCM/MeOH洗涤，浓缩，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用EtOAc/己烷梯度(40/60)在硅胶柱上纯化粗品，以得到为灰白色固体的标题化合物(0.150 g, 粗品)。将粗产物原样用于下一步。

制备实施例68

步骤A

在0℃下，向8-乙氧基-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚(1 g, 4.62 mmol)在DCM(20 mL)中的搅拌溶液中加入TEA (1.97 mL, 13.87 mmol)和BOC酸酐(1.5 mL, 6.93mol)，然后在25℃搅拌12小时。通过TLC证实反应完成后，向反应混合物中加入水，随后使用DCM萃取。分离有机层并用盐水溶液洗涤，浓缩并用己烷洗涤以获得为棕色固体的8-乙氧基-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(0.8 g, 54 %)。

步骤B

在0℃下，向氢化钠(0.136 g, 2.84 mmol)在THF (5 mL)中的悬浮液中滴加来自上述步骤A的标题化合物(0.3 g, 0.95 mmol)(溶于10 mL THF中)，然后在室温下搅拌30分钟。之后，在0℃下滴加甲苯磺酰氯(0.27 g, 1.42 mmol)(溶于10 mL THF中)，然后在室温下搅拌3小时。通过TLC证实反应完成后，将反应混合物用冰水淬灭，将形成的固体过滤，用水洗涤并干燥，以得到为白色固体的8-乙氧基-5-甲苯磺酰基-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-甲酸叔丁酯(0.32 g, 72 %)。将产物原样用于下一步。

步骤C

在0℃下向来自上述步骤B的标题化合物(0.32 g, 0.68 mmol)在DCM中的溶液中加入于二噁烷中的4M HCl (4 mL)。将反应混合物搅拌2小时。反应完成后，蒸发反应混合物以除去溶剂，并用乙醚过滤，以得到为棕色固体的标题化合物(0.13 g, 56 % )。将产物原样用于下一步。

制备实施例69

步骤A

向4-氧代哌啶-1-甲酸叔丁酯(10.00 g, 0.0502 mol)在乙醇(100 mL)中的搅拌溶液中加入盐酸羟胺(6.98 g, 0.100 mol)和CH₃COONa (8.23 g, 0.100 mol)，然后在氮气氛下加热至90℃持续12小时。通过LCMS证实反应完成后，将反应混合物浓缩，并向粗物质中加入水(100 mL)，随后通过使用二氯甲烷(250 mL)萃取。浓缩有机层，并将粗产物通过硅胶柱(Biotage)使用18-30%乙酸乙酯/石油醚纯化以获得为白色固体的4-(羟基亚氨基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(5 g, 46.4 %)。

步骤B

在0℃下，向氢化钠(0.268 g, 7.00 mmol)在DMF (3 mL)中的悬浮液中滴加来自上述步骤A的标题化合物 (0.500 g, 2.33 mmol)(溶解在5 mL DMF中)，然后在室温下搅拌60分钟。之后，在0℃下滴加2-氟吡啶(0.340 g, 3.50 mmol)(溶解在2 mL DMF中)，然后在室温下搅拌3小时。通过TLC证实反应完成后，将反应混合物用冰水淬灭，随后使用乙酸乙酯(30mL)萃取。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，以获得为淡棕色固体的4-氧代-3-(2-氧代-1,2-二氢吡啶-3-基)哌啶-1-甲酸叔丁酯(300 mg, 粗品)。将粗产物原样用于下一步。

步骤C

将来自上述步骤B的标题化合物(0.5 g, 1.71mmol)在浓H₂SO₄ (2.0 mL)中的悬浮液在氮气氛下于室温搅拌16小时。之后检查LCMS，其仅指示原料，然后将反应混合物在氮气氛下加热至60℃持续16小时。之后，检查LCMS，其指示产品质量的80%。将反应混合物冷却至室温，向其中加入10%乙腈水溶液(20.0 mL)，并通过使用固体K₂CO₃碱化反应混合物，然后过滤固体。浓缩滤液，以得到为棕色胶状油的标题化合物(250 mg, 粗品)。将产物原样用于下一步。

步骤D

在0℃下，向来自上述步骤C的标题化合物(0.6 g, 3.15 mmol)在四氢呋喃(10.0 mL)中的搅拌溶液中加入TEA (1.32 mL, 9.46 m0mol)和BOC酸酐(0.869 mL, 3.78 mmol)，然后在氮气氛下在25℃下搅拌12小时。通过TLC证实反应完成后，将反应混合物浓缩并将粗产物通过硅胶柱(Biotage)使用15-20%乙酸乙酯/石油醚纯化，以得到为灰白色固体的7,8-二氢呋喃并[2,3-b:4,5-c']二吡啶-6(5H)-甲酸叔丁酯(500 mg, 53 %)。

步骤E

在0℃下向来自上述步骤D的标题化合物(0.5 g, 1.67 mmol)在二氯甲烷(5 mL)中的搅拌溶液中加入4.0 M HCl/二噁烷 (2 mL)，然后在0℃-20℃搅拌2小时。通过TLC和LCMS证实反应完成后，将反应混合物浓缩，以得到为灰白色固体的标题化合物(350 mg，定量)。

制备实施例70

步骤A

向2,5-二氯-1,3-苯并噁唑(0.25 g, 0.0013 mol)在乙腈(15 mL)中的搅拌溶液中加入K₂CO₃ (0.55 g, 0.0040 mol)和(2S,6R)-2,6-二甲基吗啉(0.17 g, 0.0014 mol)。之后，将反应混合物加热至70℃持续12小时。

通过TLC证实反应完成后，向反应混合物中加入DCM和水(50 mL)。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，以得到为白色固体的标题化合物(0.2 g, 56 %)。

制备实施例71

步骤A

向2,5-二氯-1,3-苯并噁唑(0.6 g, 0.0032 mol)在乙腈(15 mL)中的搅拌溶液中加入K₂CO₃ (1.32 g, 0.0096 mol)和叔丁胺(0.255 g, 0.0035 mol)。之后，将反应混合物加热至70℃持续12小时。

通过TLC证实反应完成后，向反应混合物中加入DCM和水(50 mL)。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，以得到为棕色固体的标题化合物(0.4 g, 55 %)。

制备实施例72

步骤A

向6-溴-2-氯喹唑啉(0.3 g, 1.234 mmol)在乙腈(10 mL)中的搅拌溶液中加入K₂CO₃(0.34 g, 2.467 mmol)和吗啉(0.17 g, 1.85 mmol)。之后，将反应混合物加热至70℃持续12小时。

通过TLC证实反应完成后，向反应混合物中加入DCM和水(50 mL)。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，以得到为淡黄色固体的标题化合物(0.25 g, 69 %)。将产物原样用于下一步。

制备实施例73

步骤A

向2,6-二氯-1,5-萘啶(100 mg, 0.502 mmol)在二噁烷(3 mL)中的搅拌溶液中加入三乙胺(0.210 ml, 1.507 mmol)和吗啉(0.052 ml, 0.603 mmol)。然后将反应混合物在110℃下搅拌。4小时后，反应未完成，因此，加入三乙胺(0.210 ml, 1.507 mmol)，并将反应混合物在110℃下进一步搅拌过夜。将反应混合物浓缩至干，然后溶解在二氯甲烷中，并用饱和NH₄Cl水溶液洗涤。将水层用二氯甲烷萃取两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并减压蒸发，以得到为米色固体的标题产物(93 mg, 74 %)。

制备实施例74

步骤A

将2-溴-5-氯吡啶(200 mg, 1.039 mmol)溶于乙腈(2.5 mL)中，向其中加入(1S,4S)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷盐酸盐(211 mg, 1.559 mmol)和三乙胺(0.362 mL, 2.60mmol)，并将悬浮液在微波中照射至160℃持续1小时20分钟。然后将样品在水(20 mL)和二氯甲烷(20 mL)之间萃取。将水层用二氯甲烷洗涤两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。使用Biotage Isolera One纯化系统采用二氯甲烷/甲醇梯度(100/0 ->90/10)在硅胶柱上纯化粗品，以得到为米色固体的产物(57 mg, 26 %)。

制备实施例75

步骤A

将2-溴-5-氯吡啶(200 mg, 1.039 mmol)溶于乙腈(2.5 mL)中，向其中加入(1R,4R)-2-氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚烷盐酸盐(211 mg, 1.559 mmol)和三乙胺(0.362 mL, 2.60mmol)，并将悬浮液在微波中照射至160℃持续1小时20分钟。然后将样品在水(20 mL)和二氯甲烷(20 mL)之间萃取。将水层用二氯甲烷洗涤两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤并在减压下浓缩。使用Biotage Isolera One纯化系统采用二氯甲烷/甲醇梯度(100/0 ->90/10)在硅胶柱上纯化粗品，以得到为米色固体的产物(51 mg, 23 %)。

实施例1

步骤A

向脱气的四氢呋喃(5 mL)中加入氯-(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯)[2-(2-氨基乙基)苯基]钯(II)-甲基-叔丁基醚加合物(PdRuPhos G1) (0.017 g,0.024 mmol)、2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基联苯(RuPho) (0.011 g, 0.024 mmol)，来自制备实施例2的标题化合物(0.05 g, 0.024 mmol)和市售的4-(6-溴苯并[d]噻唑-2-基)吗啉(0.073 g, 0.029 mmol)。然后，加入双(三甲基甲硅烷基)氨基锂(LiHMDS)在四氢呋喃中的1M溶液(1 mL, 1 mmol)。将得到的反应混合物加热回流2小时。将反应混合物冷却至室温，溶于二氯甲烷(100 mL)。有机相用水和盐水洗涤，并经Na₂SO₄干燥。减压除去溶剂。使用Biotage Isolera One纯化系统采用乙酸乙酯/正庚烷梯度(80/20 => 100/0)在硅胶柱上纯化粗产物，以得到标题化合物(0.070 g, 69 %)。

实施例2

步骤A

向制备实施例1的标题化合物(0.150 g, 1 eq)在无水1,4-二噁烷(5 mL)中的搅拌溶液中加入市售的4-(6-溴苯并[d]噻唑-2-基)吗啉(1 eq)、叔丁醇钠(3 eq)，并将混合物在N₂气氛下脱气10分钟。向该反应混合物中加入Pd₂(dba)₃ (0.05 eq)和Ru-Phos (0.1 eq)，并将混合物加热至100℃，直到反应完成。反应完成后，将反应混合物通过硅藻土床过滤，并用EtOAc洗涤。浓缩滤液，并将粗产物通过柱色谱法或制备型HPLC纯化，以得到标题化合物6，如表2所示。

实施例3至96e

除了使用下表中所示的三环氨基-和溴/氯-衍生物之外，按照实施例1和2中所述的钯偶联程序，制备以下化合物。分别按照制备实施例42和43中所述的程序制备实施例71和72，随后进行实施例97中所述的脱保护程序。

实施例97

将来自制备实施例33的标题化合物(0.072 g, 0.142 mmol)和碳酸铯(0.107 g,0.328 mmol)放入微波管中，随后放入MeOH (1.5 mL)和THF (3 mL)。将反应混合物在微波中照射至110℃持续30分钟，然后使其冷却至室温。减压除去溶剂，并使用Biotage IsoleraOne纯化系统采用正庚烷/乙酸乙酯(80/20-> 0/100)的梯度在硅胶柱上纯化残余物，以得到为黄色固体的标题化合物(0.027 g, 53 %)。

实施例98至105f

除了使用下表中所示的甲苯磺酰基保护的前体之外，按照实施例97中所述的甲苯磺酸酯裂解程序，制备以下化合物：

。

实施例106

步骤A

向来自制备实施例7的标题化合物(500 mg, 1.31 mmol)在DMF (5 mL)中的溶液中加入2,5-二氯苯并噁唑(327 mg, 1.74 mmol)和碳酸钾(602 mg, 4.36 mmol)，并加热至100℃持续8小时。反应完成后，将反应混合物倒入冰冷却的水中；过滤沉淀出的固体并干燥，以得到标题化合物。将产物原样用于下一步而不经进一步纯化(0.500 g, 77 %)。

步骤B

在50 mL的两颈圆底烧瓶中，加入无水1,4-二噁烷(5 mL)并脱气20分钟。向其中加入乙酸钯(67 mg, 0.1008 mmol)和2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(144 mg, 0.302mmol)。所得溶液为橙色，并继续脱气另外10分钟。将悬浮液在预热的油浴上在100℃下加热几秒钟(20-30秒)。颜色变为深绿色。除去油浴，并脱气5-10分钟。向其中加入来自上述步骤A的标题化合物(500 mg, 1.008 mmol)、吗啉(88 mg, 1.008 mmol)和碳酸铯(0.98 g,3.024 mmol)，并将反应混合物加热至100℃持续3小时。3小时后，LC-MS显示产物为主要峰。通过硅藻土垫过滤反应混合物，并在真空下浓缩，以得到标题化合物。将产物原样用于下一步而不经进一步纯化(0.450 g, 82 %)。

步骤C

向来自上述步骤B的标题化合物(450 mg, 0.82 mmol)在1,4-二噁烷：甲醇(1:1; 5mL)中的溶液中加入叔丁醇钠(230 mg, 2.4 mmol)并加热至70℃持续16小时。将反应混合物在真空下浓缩。使用Biotage Isolera One纯化系统采用石油醚/EtOAc梯度(0-100%)在硅胶柱上进行纯化，以得到为固体的标题化合物(0.270 g, 84 %)。

实施例107

步骤A

向来自制备实施例7的标题化合物(500 mg, 1.318 mmol)在DMF (5 mL)中的溶液中加入2,5-二氯苯并噻唑(268 mg, 1.32 mmol)和碳酸钾(545 mg, 3.95 mmol)，并加热至100℃持续8小时。反应完成后，将反应混合物倒入冰冷却的水中，过滤沉淀出的固体并干燥，以得到标题化合物(500 mg, 74 %)。将产物原样用于下一步而不经进一步纯化。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(200 mg, 0.39 mmol)在无水二噁烷(5 mL)中的搅拌溶液中加入吗啉(51 mg, 0.58 mmol)、叔丁醇钠(112 mg, 1.17 mmol)并在N₂气氛下脱气10分钟。向该反应混合物中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0)(17.9 mg, 0.019 mmol)和2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基联苯(18.2 mg, 0.039 mmol)并加热至100℃，直至反应完成。反应完成后(通过LCMS监测)，将反应混合物通过硅藻土过滤，并用EtOAc洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到粗产物。使用Biotage Isolera One纯化系统采用石油醚/EtOAc梯度(0-100%)在硅胶柱上进行纯化，以得到为固体的标题化合物(50 mg, 33 %)。

实施例108

步骤A

向来自制备实施例7的标题化合物(1 g, 2.63 mmol)在DMF (10 mL)中的溶液中加入2,6-二氯苯并噻唑(0.537 g, 2.63 mmol)和碳酸钾(1.09 g, 7.89 mmol)并加热至100℃持续8小时。反应完成后，将反应混合物倒入冰冷却的水中，过滤沉淀出的固体并干燥，以得到标题化合物(1.0 g, 74 %)。将产物原样用于下一步而不经进一步纯化。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(150 mg, 0.293 mmol)在无水二噁烷(5 mL)中的搅拌溶液中加入吗啉(39 mg, 0.44 mmol)、叔丁醇钠(85 mg, 0.87 mmol)，并在N2气氛下脱气10分钟。向该反应混合物中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (13.4 mg, 0.0015 mmol)和2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基联苯(13.65 mg, 0.029 mmol)并加热至100℃，直至反应完成。反应完成后(通过LCMS监测)，将反应混合物通过硅藻土过滤，并用EtOAc洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到粗产物。使用Biotage Isolera One纯化系统采用石油醚/EtOAc梯度(0-100%)在硅胶柱上进行纯化，以得到为固体的标题化合物(60 mg, 50 %)。

实施例109

步骤A

向来自制备实施例7的标题化合物(250 mg, 0.725 mmol)在DMF (5 mL)中的溶液中加入2,6-二氯苯并噁唑(166 mg, 0.88 mmol)和碳酸钾(326 mg, 2.36 mmol)并加热至100℃持续8小时。反应完成后，将反应混合物倒入冰冷却的水中，过滤沉淀出的固体并干燥，以得到标题化合物(250 mg, 70 %)。将产物原样用于下一步而不经进一步纯化。

步骤B

向来自上述步骤A的标题化合物(250 mg, 0.505 mmol)在无水二噁烷(5 mL)中的搅拌溶液中加入吗啉(53 mg, 0.60 mmol)、叔丁醇钠(145 mg, 1.52 mmol)，并在N2气氛下脱气10分钟。向该反应混合物中加入三(二亚苄基丙酮)二钯(0) (23.1 mg, 0.0252 mmol)和2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基联苯(23.53 mg, 0.051 mmol)并加热至100℃，直至反应完成。反应完成后(通过LCMS监测)，将反应混合物通过硅藻土过滤，并用EtOAc洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到粗产物。使用Biotage Isolera One纯化系统采用石油醚/EtOAc梯度(0-100%)在硅胶柱上进行纯化，以得到为固体的标题化合物(50 mg, 25 %)。

实施例110

步骤A

向来自制备实施例1的标题化合物(0.15 g, 0.43 mmol)在无水1,4-二噁烷(5 mL)中的搅拌溶液中加入来自制备实施例50的标题化合物(0.17 g, 0.43 mmol)和Cs₂CO₃ (0.420g, 1.29 mmol)。将反应混合物在N₂气氛下脱气10分钟。然后加入Pd(OAc)₂; (0.009 g,0.043 mmol)和2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(0.062 g; 0.129 mmol)，并将反应混合物加热至100℃直至反应完成。反应完成后(通过LCMS监测)，将反应混合物通过硅藻土过滤，并用乙酸乙酯洗涤。将滤液在减压下浓缩以得到粗产物。粗物质通过快速柱色谱法或制备型HPLC纯化，以得到甲苯磺酰基保护的化合物。向甲苯磺酰基化合物(1.0 eq)在二噁烷:MeOH (1:1, 10 vol)中的溶液中加入NaOtBu (3 eq)，并加热至70℃持续6小时。将反应混合物在真空下浓缩，并将粗产物进行柱纯化，以得到所需产物。粗物质通过快速柱色谱法或制备型HPLC纯化，以得到标题化合物(0.042 g, 24%)。

实施例111和112

如实施例110所述，按照在钯偶联程序之后进行甲苯磺酰基脱保护，制备以下化合物。

实施例113

步骤A

将乙酸钯(II) (0.013 g, 0.058 mmol)和4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(XANTPHOS) (0.101 g, 0.174 mmol)放入反应小瓶中并脱气。加入1,4-二噁烷(6 mL)。将所得溶液短暂脱气。将悬浮液在100℃(在预热的加热块上)加热少于1分钟，直到溶液的颜色从橙色变成深粉红色。然后，将小瓶从加热块中取出，并加入来自制备实施例52的标题化合物(148 mg, 0.581 mmol)、来自制备实施例1的标题化合物(0.200 g, 0.581 mmol)和碳酸铯(0.662 g, 2.033 mmol)。用氩气填充反应小瓶，然后将其关闭。将反应混合物在100℃下加热18小时。将反应混合物用乙酸乙酯和水稀释。分离有机层，水层用乙酸乙酯再萃取两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并在减压下蒸发溶剂。使用Biotage Isolera One纯化系统采用正庚烷/乙酸乙酯(100/00 --> 50/50)梯度在硅胶柱上纯化粗产物。将获得的粗反应混合物(0.261 g, 0.469 mmol)和碳酸铯(0.214 g, 0.658 mmol)放入微波管中，随后放入MeOH (4 mL)和THF (8 mL)。将反应混合物在微波中照射至110℃持续30分钟，然后使其冷却至室温。减压除去溶剂，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用二氯甲烷/甲醇(100/00 --> 95/05)的梯度在硅胶柱上纯化残余物，以得到为黄色固体的标题化合物(0.020 g, 9 %)。

实施例114

步骤A

将乙酸钯(II) (0.013 g, 0.058 mmol)和4,5-双(二苯基膦基)-9,9-二甲基呫吨(XANTPHOS) (0.101 g, 0.174 mmol)放入反应小瓶中并脱气。加入1,4-二噁烷(6 mL)。将所得溶液短暂脱气。将悬浮液在100℃(在预热的加热块上)加热少于1分钟，直到溶液的颜色从橙色变成深粉红色。然后，将小瓶从加热块中取出，并加入来自制备实施例51的标题化合物(144 mg, 0.581 mmol)、来自制备实施例1的标题化合物(0.200 g, 0.581 mmol)和碳酸铯(0.662 g, 2.033 mmol)。用氩气填充反应小瓶，然后将其关闭。将反应混合物在100℃下加热18小时。将反应混合物用乙酸乙酯和水稀释。分离有机层，水层用乙酸乙酯再萃取两次。合并的有机层经Na₂SO₄干燥，过滤，并在减压下蒸发溶剂。使用Biotage Isolera One纯化系统采用正庚烷/乙酸乙酯梯度(100/00 --> 50/50)在硅胶柱上纯化粗产物。将获得的粗反应混合物(0.122 g, 0.219 mmol)和碳酸铯(0.214 g, 0.658 mmol)放入微波管中，随后放入MeOH (4 mL)和THF (8 mL)。将反应混合物在微波中照射至110℃持续30分钟，然后使其冷却至室温。减压除去溶剂，并使用Biotage Isolera One纯化系统采用二氯甲烷/甲醇(100/00 --> 95/05)的梯度在硅胶柱上纯化残余物，以得到为黄色固体的标题化合物(0.081 g, 35 %)。

实施例115

步骤A

将Pd(OAc)₂ (16 mg, 0.072 mmol)和2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基联苯(XPhos; 103 mg, 0.2177 mmol)加至反应小瓶中，并加入脱气二噁烷(5 ml)。用氩气填充小瓶并密封。将悬浮液在100℃下加热1分钟，然后加入8-氟-5-甲苯磺酰基-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚(制备实施例1)(250 mg, 0.725 mmol)、4-(4-溴苯基)吗啉(210mg, 0.87 mmol)和Cs₂CO₃ (707 mg, 2.177 mmol)，并将溶液在100℃加热18小时。将反应混合物用乙酸乙酯(30 mL)和水(30 mL)稀释。分离有机相，水相用乙酸乙酯再萃取两次。合并的有机相经Na₂SO₄干燥，过滤，并在减压下蒸发溶剂。通过采用DCM/MeOH梯度(100/0 -> 95/05)在HP-Sil柱(Biotage)上纯化粗品，以得到为黄色固体的4-(4-(8-氟-5-甲苯磺酰基-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-基)苯基)吗啉 (235 mg, 64 %)。

向4-(4-(8-氟-5-甲苯磺酰基-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-基)苯基)吗啉(0.235 mg, 0.465 mmol)在二噁烷:MeOH (1:1, 5 vol)中的溶液中加入NaOtBu(133 mg, 1.39 mmol)，并加热至70℃持续6小时。将反应混合物在真空下浓缩，并将粗产物在HP-Sil柱(Biotage)上通过采用DCM/MeOH梯度(100/0 -> 95/05)进行柱纯化，以得到为灰白色固体的标题化合物(57 mg, 35 %)。

实施例116

向7-氟-5-甲苯磺酰基-2,3,4,5-四氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚(制备实施例7)(250mg, 0.7267 mmol)在无水二噁烷(5 mL)中的搅拌溶液中加入5-氯-N-(2-甲氧基乙基)-N-甲基苯并[d]噁唑-2-胺(制备实施例60) (190 mg, 0.7994 mmol)、叔丁醇钠(202 mg,2.180 mmol)，并在N₂气氛下脱气10分钟。向该反应混合物中加入Ruphos G4 Pd (60 mg,0.0726 mmol)并加热至100℃直至反应完成。反应完成后，将反应混合物通过硅藻土床过滤，用EtOAc洗涤。浓缩滤液，并通过柱色谱法采用DCM/MeOH梯度(100/0 -> 95/05)在HP-Sil柱(Biotage)上纯化粗品，以得到标题化合物(37 mg, 13 %)。

实施例117至145

按照实施例115和实施例116中报道的程序，制备以下化合物。

实施例146

步骤A

在0℃下向氢化钠(0.0293 g, 0.764 mmol)在DMF (3 mL)中的悬浮液中滴加5-(7-氟-1,3,4,5-四氢吡啶并[4,3-b]吲哚-2-基)-2-吗啉代-1,3-苯并噁唑 (实施例45) (0.100g, 0.255 mmol)(溶解在3 mL DMF中)，然后在室温下搅拌60分钟。之后，在0℃下滴加碘乙烷(0.0596 g, 0.382 mmol)(溶于2mL DMF中)，然后在室温下搅拌3小时。通过TLC监测反应完成后，将反应混合物用冰水淬灭，随后使用乙酸乙酯(20 mL)萃取。分离有机层，经硫酸钠干燥，过滤，然后浓缩，以得到粗品，然后通过硅胶柱(Biotage)使用40-50%乙酸乙酯/石油醚纯化至为灰白色固体的5-(5-乙基-7-氟-3,4-二氢-1H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-基)-2-吗啉代-1,3-苯并噁唑(15 mg, 14 %)。

实施例147至153

除了使用下表中所示的三环氨基和溴/氯衍生物之外，按照如实施例1、2和115中所述的钯偶联程序，制备以下化合物。

本发明化合物的HCl盐

实施例89 HCl

步骤A

向4-(6-(7-氟-1,3,4,5-四氢-2H-吡啶并[4,3-b]吲哚-2-基)噻唑并[4,5-c]吡啶-2-基)吗啉 (实施例89) (0.1 g, 0.244 mmol)在无水DCM (5 mL)中的冷却至0℃的溶液中加入4M HCl/二噁烷 (0.2 mL)并搅拌1小时。将反应混合物真空浓缩并用乙醚研磨至为棕色固体的标题化合物(0.09 g, 83 %)。

实施例

按照如实施例89 HCl中所述的盐酸盐程序，制备以下化合物。

本发明化合物的放射性配体合成

实施例³H-12

将催化剂加至氚反应容器中，随后加入实施例12原料(1.0 mg, 0.003 mmol)在二氯甲烷中的溶液。将该容器连接至氚线，并在-200℃下加压至氚气。将溶液搅拌8小时，冷却至-200℃并除去过量的气体。用4 x 1 mL甲醇冲洗反应烧瓶，将其各自转移至100mL回收烧瓶中。将合并的有机相在真空下蒸发(粗收率：124 mCi)。将粗物质通过HPLC纯化，将流动相在真空下蒸发，并将产物重新溶解在无水乙醇中(收率：17 mCi，纯度，＞ 97%)。通过质谱法确定比活度为80.6 Ci/mmol。

实施例³H-45

将催化剂加至氚反应容器中，随后加入实施例45原料(1.0 mg, 0.003 mmol)在二氯甲烷中的溶液。将该容器连接至氚线，并在-200℃下加压至氚气。将溶液搅拌8小时，冷却至-200℃并除去过量的气体。用4 x 1 mL甲醇冲洗反应烧瓶，将其各自转移至100mL回收烧瓶中。将合并的有机相在真空下蒸发(粗收率：124 mCi)。将粗物质通过HPLC纯化，将流动相在真空下蒸发，并将产物重新溶解在无水乙醇中(收率：17 mCi，纯度，＞ 99%)。通过质谱法确定比活度为96.8 Ci/mmol。

生物测定描述

通过硫黄素T(ThT)进行的全长Tau(flTau)解聚测定

将人Tau的最长同种型(2N4R；441个氨基酸)在细菌中表达并纯化。对于通过ThT进行的Tau解聚测定，在37℃下，在存在50 µM肝素(Sigma-Aldrich)和10 mM DTT(Sigma-Aldrich)的情况下，在750 RPM下摇动下，使PBS中的35 µM重组全长(fl)Tau聚集24小时。将化合物溶解在无水二甲基亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich)中以达到10 mM的浓度。将 flTau聚集体和化合物的系列稀释液在PBS(体积50 µL)中混合在一起至最终浓度为2μM的flTau聚集体和160至0.04 µM的化合物。将混合物在室温(RT)下孵育30分钟，然后将40 µL该混合物转移至黑色384孔测定板(Perkin-Elmer)中，并与10 µL于PBS中的100 µM ThT/250 mM甘氨酸(两者均来自Sigma-Aldrich)混合。在Tecan读数器上一式一份或一式两份测量荧光(相对荧光单位；RFU)(激发：440nm；发射：485nm)。然后计算flTau解聚的百分比，并假设单结合位点拟合模型，使用GraphPad Prism版本5(GraphPad Software)确定半数最大有效浓度(EC₅₀)。

通过ThT进行的Tau K18解聚测定

将包含人Tau441最长同种型(2N4R)的氨基酸244-372的Tau K18片段在细菌中表达并纯化或购买自SignalChem。对于通过ThT进行的K18解聚测定，在37℃下，在存在50 µM肝素(Sigma-Aldrich)和10 mM DTT(Sigma-Aldrich)的情况下，在750 RPM下摇动下，使PBS中的35 µM重组K18聚集24小时。将化合物溶解在无水二甲基亚砜(DMSO，Sigma-Aldrich)中以达到10 mM的浓度。将K18聚集体和化合物的系列稀释液在PBS(体积50 µL)中混合在一起至最终浓度为2μM的K18聚集体和160至0.04 µM的化合物。将混合物在室温(RT)下孵育30分钟，然后将40 µL该混合物转移至黑色384孔测定板(Perkin-Elmer)中，并与10 µL于PBS中的100 µM ThT/250 mM甘氨酸(两者均来自Sigma-Aldrich)混合。在Tecan读数器上一式一份或一式两份测量荧光(相对荧光单位；RFU)(激发：440nm；发射：485nm)。然后计算K18解聚的百分比，并假设单结合位点拟合模型，使用GraphPad Prism版本5(GraphPad Software)确定半数最大有效浓度(EC₅₀)。

测量以下实施例化合物：

说明：+++ EC₅₀ < 10 uM; ++ EC₅₀ 10<x<25 uM; + EC₅₀ 25<x<50 uM。

减少细胞内Tau聚集

在完全培养基[DMEM-F12 4.5 g/L Glutamax (Invitrogen)、15% FBS (Biochrom)、1%Peni/Strep (Invitrogen)，补充有2.5 µg/ml G418 (Sigma-Aldrich)选择抗生素]中培养过表达携带P301L突变的人Tau全长形式的人神经母细胞瘤细胞系。实验前一天，将5x10⁵个细胞/孔铺板在6孔板中的3 mL完全培养基中。第二天，将细胞与DMSO或5 µM本发明化合物于37℃孵育另外24小时。孵育后，将细胞用胰蛋白酶消化，重悬于100 µl均质缓冲液[25 mMTris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA，含有磷酸酶抑制剂(30 mMNaF, 0.2 mM Na₃VO₄, 1 nM冈田酸, 1 mM PMSF, 5 mM Na₄P₂O₇)和蛋白酶抑制剂混合物(Complete^TM, Roche)]中，然后通过三个快速冷冻和解冻循环进行物理裂解。然后直接在AlphaLISA测定中测试样品。

通过AlphaLisa使用以下抗体对对磷酸化的、聚集的和总的Tau进行定量：

● HT7-受体珠 + 生物素 (BT)-Tau13-供体珠: 总Tau

● HT7-受体珠 + 生物素 (BT)-HT7-供体珠: 聚集的人Tau。

Tau13(Abcam)使用EZ-Link® NHS-PEO固相生物素化试剂盒(ThermoScientific)进行生物素化，而HT7-生物素则来自商业来源(Thermo Scientific)。

对于每个抗体对，优化受体珠和生物素化抗体的浓度。首先以于PBS中的稀释系列测试所有样品，以确定每个样品和测定的线性范围和最佳稀释。对于最终方案，将以下试剂加入到384孔白色OptiPlate (PerkinElmer)中：

● 5 µL测试稀释样品

● 20 µL的以下终浓度的生物素-mAb受体珠混合物：

● 1.25 nM的HT7-BT与10 µg/ml的HT7-Acc珠的组合

● 5 nM的Tau13-BT与2.5 µg/ml的HT7-Acc珠的组合。

在室温下将该混合物孵育1小时后，在黑暗中加入25 µL 25 µg/mL的链霉亲和素供体珠(Perkin Elmer)。孵育30分钟后，使用EnSpire Alpha仪器和EnSpire Workstation3.00版分析板。将聚集Tau的数据标准化为总Tau，然后表示为DMSO处理细胞的百分比。

测试以下实施例化合物：

说明：+++ %>50; ++ % 50<x<25; + % 25<x<10。

本发明化合物的体内功效

实施例12和实施例45的测试的体内研究设计

双转基因rTg4510小鼠表达在tet诱导型CaMKII启动子的控制下携带P301L突变的全长人Tau (Tau4R0N-P301L) (Ramsden等人, J. Neurosci., 2005 • 25(46):10637-10647)。仅表达四环素控制的反式激活因子(tTA)的单只转基因小鼠被用作基因型对照。该研究包括4个处理组(tTa组n = 15只雌性，和处理组n = 11只雌性小鼠/组)，其具有如下组分布(见表9)。在5月龄时开始，每天一次或每两天一次通过管饲法给药化合物或媒介物对照1个月。所有的小鼠都在食物中接受200 ppm的多西环素，持续3周，并在前两天以于4%蔗糖中的1.5 mg/mL在饮用水中加入负荷剂量的多西环素。给药时多西环素给药在第2周开始，并持续整个给药周期。

对所有动物进行脑脊髓液(CSF)分析，同时对10只动物/组进行错误折叠的Tau(MC1)、总小胶质细胞(Iba1)和吞噬小胶质细胞(CD68)的组织学检查。

表9: 实施例12和实施例45的测试的体内研究设计

基因型	小鼠数量	处理/剂量
			tTA	15	媒介物<sup>(a)</sup>
rTg4510	11	媒介物<sup>(a)</sup>
			rTg4510	11	实施例12 (30 mg/kg，每两天一次)
rTg4510	11	实施例45 (30 mg/kg，每两天一次)

^(a)媒介物：0.5% w/v 羟丙基甲基纤维素4000 cps; 0.5% w/v Tween 80。

脑脊髓液(CSF)收集和分析

通过标准注射麻醉对小鼠进行深度麻醉，并用冷PBS经心脏灌注。用手术剪将颈部的毛和皮去除(小鼠没有被斩首)。通过钝器解剖以最少出血小心地去除颅底和脑干周围的组织。一旦脑膜暴露在颅底的枕骨大孔区域中，就将27ga的蝶形针保持垂直于颅骨，并横向插入脑脊髓液(CSF)空间。将样品快速浸入液氮中，并保存在-80℃下，直到通过AlphaLISA进行生化分析。使用以下抗体对对CSF Tau中的总人Tau进行定量：HT7-受体珠+生物素(BT)-Tau13-供体珠。使用EZ-Link® NHS-PEO固相生物素化试剂盒(Thermo Scientific)对Tau13 (Abcam)抗体进行生物素化。对于最终方案，将以下试剂加入到384孔白色OptiPlate(PerkinElmer)中：

● 5 µL测试稀释样品

● 20 µL的以下终浓度的生物素-mAb受体珠混合物：0.6 nM的Tau13-BT与2.5 µg/ml的HT7-Acc珠的组合。

将该混合物在室温下孵育1小时后，在黑暗中加入25 µL 25 µg/mL的链霉亲和素供体珠(Perkin Elmer)。孵育30分钟后，使用EnSpire Alpha仪器和EnSpire Workstation3.00版分析板。数据通过单因素ANOVA随后进行事后比较来分析，并且显示的统计数据是指与媒介物处理的rTg4510小鼠相比的差异。

如图1中所示，实施例12和实施例45均降低了CSF中的Tau水平。

实施例12和实施例45处理的rTg4510小鼠的组织学评价

灌注后，接着取出大脑并在半矢状半切。室温下，将右半球固定在PBS中的4%多聚甲醛中3小时，通过在4℃下浸在15%蔗糖中3天来冷冻保存，并准备用于冷冻切片。然后将固定的半球在冷冻模具中的OCT培养基上的干冰中冷冻，并用Leica CM3050低温切片机在矢状冷冻切片(厚度为10μm)。从大约12个中外侧水平收集每组10只小鼠的切片。来自每只动物七个矢状水平的系统随机切片组用于量化Iba1和CD68免疫反应性，而来自中外侧水平4的1个切片/动物用于评估Tau错误折叠(MC1单克隆抗体)。从-20℃取出冷冻切片并在室温下风干25分钟。用免疫组化笔液体阻滞剂包围脑组织，并在室温下在PBS中洗涤5分钟1次和10分钟1次。在室温下用于PBS中的10%正常山羊血清(NGS)和0.25% Triton X-100进行阻滞和透化2小时。然后将切片用纸吸干，并在4℃在潮湿箱中与在含有5% NGS和0.25% Triton X-100的PBS中以1：1000稀释的小鼠单克隆MC1抗体孵育过夜。在室温下，将切片在PBS中洗涤3次持续10分钟，并在室温下避光与在PBS中以1：1000稀释的Cy3标记的山羊抗小鼠IgG (H+L)二抗(Jackson)孵育30分钟。在PBS中洗涤三次持续10分钟后，在室温下将切片与0.1%Sudan Black (Sigma)在70%乙醇中的溶液孵育30秒，以减少组织的自发荧光。将切片在PBS中洗涤3次持续10分钟，使用含DAPI的ProLong Gold Antifade试剂(Molecular Probes)封固(mount)并盖上盖玻片。使用数字玻片扫描仪(Panoramic 250 Flash, 3D HistechLtd.)对切片进行成像，并使用图像可视化软件Visiopharm对其进行定量。

在上皮层的额叶皮层中分析MC1染色。在额叶皮层周围绘制了一个对应于20倍放大视野的感兴趣区域(ROI)。在Visiopharm中使用MC1染色的预定阈值(像素强度阈值大于30(8位图片))并排除小于20 μm²的所有检测物体，对该ROI进行分析。数据通过单因素ANOVA随后进行事后检验来分析。

如图2中所示，实施例12和实施例45均减小了MC1阳性面积。这些数据表明，在rTg4510中用实施例12和实施例45进行的处理均降低了该侵袭性Tau转基因模型中错误折叠的Tau水平。

为了评估上述测试化合物对Tau的作用是否也对神经炎症标志物产生影响，将切片标记为大鼠抗小鼠CD68克隆FA-11 (BD Biosciences)、山羊多克隆抗Iba1抗体(Abcam)，并用DAPI复染色。使用高度交叉吸收的荧光标记的二抗(Thermo Fisher)显现抗体结合。在抗体稀释剂(Dako)中稀释抗体，用M.O.M血清(Vector)封闭非特异性内源性IgG结合，然后进行初次孵育。使用LED (Colibri2)照明和灵敏的Orca Flash 4.0单色相机，在20倍放大(平场复消色差物镜)下，在通过ZEN软件驱动的Axio Scan Z1玻片扫描仪上对封固的切片进行整体成像。数据通过单因素 ANOVA然后进行事后比较来分析，并且显示的统计数据是指与媒介物处理的rTg4510小鼠相比的差异。

如图3A中所示，实施例12和实施例45均降低了作为Iba1免疫反应性区域测量的小胶质细胞增生。此外，实施例12和45均降低了CD68阳性的高度活化的吞噬小胶质细胞(图3B)。这些数据一起表明，在rTg4510中用实施例12和实施例45进行的处理均降低了该侵袭性Tau转基因模型中神经炎症的水平。

减少来自人AD和PSP脑切片的神经原纤维缠结(NFT)中的Tau错误折叠

来自一个AD病例和两个PSP病例的新鲜冷冻组织切片获自商业分销商(TissueSolutions, UK)。在室温下在潮湿箱中，将组织切片与100 µM实施例45或DMSO孵育大约60小时。孵育后，将切片在PBS中洗涤3次，在4℃下用低聚甲醛(PFA; Sigma)固定10分钟，然后在PBS中再次洗涤3次。然后将切片在封闭缓冲液(PBS，10%纯山羊血清(NGS)，0.25% TritonX)中在室温下透化1小时。封闭后，在4℃下将切片与Tau构象抗体(MC1单克隆抗体)在封闭缓冲液(5% NGS, 0,25% Triton X)中孵育过夜。第二天，将切片在PBS中洗涤3次持续5分钟，并在室温下与Cy3缀合的AffiniPure山羊抗小鼠抗体(Jackson laboratories)孵育1小时。多余的抗体通过在PBS中洗涤3次持续5分钟除去。为了减少自发荧光，在室温下将切片与溶于70%乙醇的0.1% Black Sudan(Sigma)孵育8分钟。最后，将切片在PBS中洗涤5次持续5分钟，并使用含DAPI的ProLong Gold Antifade试剂(Invitrogen)封固在盖玻片下。然后将切片在室温下干燥24小时，然后使用数字玻片扫描仪(Pannoramic P250 Flash III, 3DHistech Ltd.)成像，并使用Visiopharm软件对NFT中的Tau错误折叠进行定量。如图4中所示，实施例45将NFT中的Tau错误折叠减少了约30%，对AD和PSP人脑样品具有相似的效力。

人AD脑切片中³H-实施例45的离体高分辨率放射自显影

来自一个AD病例的新鲜冷冻组织切片获自商业分销商(Tissue Solutions, UK)。对于放射自显影，将脑切片在4℃下用4% PFA (Sigma)固定15分钟。在室温下将切片与单独的20nM [³H]-实施例45或与20 nM [³H]-实施例45和5μM非放射性实施例45一起孵育1小时。然后如下洗涤切片：首先，在冰冷的缓冲液中洗涤1分钟，然后在冰冷的70%乙醇中洗涤两次持续1分钟，在冰冷的缓冲液中洗涤1分钟，最后在冰冷的蒸馏水中短暂冲洗。随后将该切片在空气流中干燥1小时，然后在不透光的载玻片储存箱中于4℃暴露于Ilford NuclearKmulsion Type K5 (Agar Scientific)5天。根据制造商的说明，始终在安全灯照亮的暗室中暴露于乳液，并将乳液碎片在等体积的40℃预热水中熔化。5天后，根据制造商的说明将这些切片显影。使用ProLong Gold Antifade试剂(Invitrogen)封固切片，并使用数字玻片扫描仪(Pannoramic P250 Flash III, 3D Histech Ltd.)成像。

如图5中所示，实施例45示出了人AD脑样品中的Tau NFT上的特异性靶结合(target enagemet)。

Claims

1.式(I)的化合物：

其中

A选自

可以在任何可利用的位置与Q连接，其中

被一个或多个取代基R^j取代，并且其中

可以任选被一个或多个取代基R取代；

B选自O和NR^a；

E和V独立地选自N、NR⁵、O和S；

G选自苯环、嘧啶环和吡啶环；

J选自O和N-R¹；

Q选自N和C-R¹；

Y选自CZ和N，条件是当Y是N和Y¹、Y²和Y³是 CZ时，B是N-烷基或O；

Y¹选自CZ和N；

Y²选自CZ和N；

Y³选自CZ和N；

Z独立地选自H、卤素、O-烷基、烷基和CN；

R独立地选自

和-NR³R⁴;

R^a选自 H和烷基；

R^j独立地选自-卤素、-O-烷基、-CF₃、-CN、-NR³R⁴、

R¹选自 H和烷基；

R²独立地选自烷基、F和=O，其中所述烷基可以任选被卤素、-OH或-O-烷基取代，并且其中如果两个R²处于孪位，则它们可以连接以形成3至6-元环；

R⁵选自H和烷基；

n是0、1、2、3或4；

r和s独立地是0、1、2或3；和

t和u独立地是1、2或3。

2.根据权利要求1的化合物，其是式(Ia)的化合物：

其中A、B、R^b、R^c、R^d、R^e、R^f、R^g、Y和Z如权利要求1中所定义。

3.根据权利要求1的化合物，其是式(Ib)的化合物：

其中 A、B、R^b、R^c、R^d、R^e、R^f、R^g和Z如权利要求1中所定义。

4.根据权利要求1至3中任一项的化合物，其中 A是

，其中

可以在任何可利用的位置与Q或与N连接，并且其中

可以任选被一个或多个取代基R取代。

5.根据权利要求1至4中任一项的化合物，其是式(Ic)的化合物：

其中E、R、V和Z如权利要求1中所定义。

6.根据权利要求1的化合物，其中所述化合物选自

。

7.药物组合物，其包含如权利要求1至6中任一项所定义的化合物和任选的药学上可接受的载体或赋形剂。

8.如权利要求1至6中任一项所定义的化合物，其用作药物。

9.式(I)的化合物:

其中

A选自

可以在任何可利用的位置与Q连接、其中

被一个或多个取代基R^j取代，并且其中

可以任选被一个或多个取代基R取代；

B选自 O和NR^a；

E和V独立地选自N、NR⁵、O和S；

G选自苯环、嘧啶环和吡啶环；

J选自O和N-R¹；

Q选自N和C-R¹；

Y选自CZ和N；

Y¹选自CZ和N；

Y²选自CZ和N；

Y³选自CZ和N；

Z独立地选自H、卤素、O-烷基、烷基和CN；

R独立地选自

和-NR³R⁴;

R^a选自H和烷基；

R^b、R^c、R^d、R^e、R^f和R^g独立地选自H和烷基，或R^b、R^c、R^d、R^e、R^f和R^g中的任何两个可以连接以形成3至8-元环；

R^j独立地选自-卤素、-O-烷基、-CF₃、-CN、-NR³R⁴、

R¹选自H和烷基；

R⁵选自H和烷基；

n是0、1、2、3或4；

r和s独立地是0、1、2或3；和

t和u独立地是1、2或3。

10.用于根据权利要求9所述用途的化合物，其中所述式(I)的化合物如权利要求1至6中任一项所定义。

11.治疗、预防或减轻与Tau蛋白聚集体相关的病症或异常的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物。

12.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物在制备用于治疗、预防或减轻与Tau蛋白聚集体相关的病症或异常的药物中的用途。

13.用于根据权利要求9所述用途的化合物，根据权利要求11的方法、或根据权利要求12的用途，其中所述病症选自阿尔茨海默病(AD)、家族性AD、原发性年龄相关性Tau蛋白病(PART)、克雅病、拳击员痴呆、唐氏综合征、Gerstmann-Sträussler-Scheinker病(GSS)、包涵体肌炎、朊病毒蛋白脑淀粉样血管病、创伤性脑损伤(TBI)、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、关岛帕金森症-痴呆综合征、非关岛运动神经元病伴神经原纤维缠结、嗜银颗粒痴呆、皮质基底节变性(CBD)、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化、17号染色体相关的额颞叶痴呆伴帕金森症(FTDP-17)、Hallervorden-Spatz病、多系统萎缩(MSA)、C型Niemann-Pick病、苍白球-脑桥-黑质变性、皮克氏病(PiD)、进行性皮质下胶质增生、进行性核上性麻痹(PSP)、亚急性硬化性全脑炎、缠结优势型痴呆、脑炎后帕金森症、强直性肌营养不良、亚急性硬化性全脑病、LRRK2突变、慢性创伤性脑病(CTE)、家族性英国型痴呆、家族性丹麦型痴呆、其他额颞叶变性、瓜德罗普帕金森症、脑组织铁沉积神经变性病、SLC9A6-相关智力迟钝、白质Tau蛋白病伴球状胶质细胞包涵体、癫痫、路易体痴呆(LBD)、轻度认知障碍(MCI)、多发性硬化、帕金森病、HIV相关痴呆、成年型糖尿病、老年性心脏淀粉样变性、青光眼、缺血性发作、AD和亨廷顿病中的精神病，优选阿尔茨海默病(AD)、皮质基底节变性(CBD)、皮克氏病(PiD)和进行性核上性麻痹(PSP)。

14.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物，其用于降低Tau聚集。

15.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物，其用于防止Tau聚集体形成和/或用于抑制Tau聚集。

16.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物，其用于细胞内干扰Tau聚集体。

17.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物，其用于在体内减少Tau错误折叠和过度磷酸化。

18.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物，其用于减少神经炎性标志物。

19.降低Tau聚集的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物。

20.防止Tau聚集体形成和/或抑制Tau聚集的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物。

21.细胞内干扰Tau聚集体的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物。

22.在体内减少Tau错误折叠和过度磷酸化的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物。

23.减少神经炎性标志物的方法，所述方法包括向有此需要的对象给药有效量的如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物。

24.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物在制备用于降低Tau聚集的药物中的用途。

25.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物在制备用于防止Tau聚集体形成和/或用于抑制Tau聚集的药物中的用途。

26.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物在制备用于细胞内干扰Tau聚集体的药物中的用途。

27.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物在制备用于在体内减少Tau错误折叠和过度磷酸化的药物中的用途。

28.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物在制备用于减少神经炎性标志物的药物中的用途。

29.混合物，其包含如权利要求1至6中任一项所定义的化合物和至少一种选自与权利要求1至6中任一项所定义的化合物不同的治疗剂的其他生物活性化合物，

30.根据权利要求29的混合物，其中所述化合物和/或其他生物活性化合物以治疗有效量存在。

31.根据权利要求29或30的混合物，其中所述其他生物活性化合物选自抗氧化应激的化合物、抗凋亡化合物、金属螯合剂、DNA修复抑制剂如哌仑西平和代谢物、3-氨基-1-丙磺酸(3APS)、1,3-丙二磺酸盐(1,3PDS)、α-分泌酶激活剂、β-和γ-分泌酶抑制剂、糖原合成酶激酶3抑制剂、O-GlcNAcase (OGA)抑制剂、神经递质、β-折叠破坏剂、β淀粉样蛋白清除/耗竭细胞组分的引诱剂、N-末端截短的淀粉样蛋白β的抑制剂包括焦谷氨酸化的淀粉样蛋白β3-42、抗炎分子、或胆碱酯酶抑制剂(ChEI)如他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐和/或加兰他敏、M1激动剂、其它药物包括任何淀粉样蛋白或Tau修饰药物和营养补充剂、抗体，包括任何其功能等效抗体或功能部分或疫苗。

32.根据权利要求31的混合物，其中所述其他生物活性化合物是胆碱酯酶抑制剂(ChEI)。

33.根据权利要求31的混合物，其中所述其他生物活性化合物选自他克林、卡巴拉汀、多奈哌齐、加兰他敏、烟酸和美金刚。

34.根据权利要求31的混合物，其中所述其他生物活性化合物是抗体，特别是单克隆抗体，包括任何其功能等效抗体或功能部分。

35.根据权利要求29至34中任一项的混合物，其中所述化合物和/或其他生物活性化合物以治疗有效量存在。

36.如权利要求1至6或9中任一项所定义的化合物作为分析参考物或体外筛选工具的用途。