CN111748601B - 一种杀菌产品有效作用时间与杀菌效力的检测方法 - Google Patents

一种杀菌产品有效作用时间与杀菌效力的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种杀菌产品有效作用时间与杀菌效力的检测方法，其步骤包括：（1）测试前根据实际作用面积选择所需的微生物载体套件；（2）利用载体套件进行有效作用时间筛选；（3）利用载体套件进行单位面积杀菌效力测试；（4）利用公式计算单位面积杀菌效力与测试结果分析。本发明适用于杀菌产品研发，可快速确定产品的有效作用时间，准确检测模拟使用中的单位面积杀菌效力，同时本测试配套载体使微生物分布更平均，测试变量更贴近实际，且环境变量可控，从而降低了测试结果的不确定性，提高了可靠度。此外，本方案有套件可重复使用，测试操作简单，成本低，易重复等特点，非常有利于在新型杀菌产品研发过程中，对新产品性能的调试评估。

Description

一种杀菌产品有效作用时间与杀菌效力的检测方法
技术领域
本发明涉及微生物检测技术领域，尤其指一种适用于新型杀菌产品的效力检测，可快速确定新杀菌产品的有效作用时间，以及检测模拟使用中的单位面积杀菌效力的检测方法。
背景技术
病原体是指可造成人类感染的微生物，其中包括细菌，真菌和霉菌。目前已知的3万种细菌和12万种真菌中，有5％的物种会对人体有害甚至导致死亡。例如：在中世纪的欧洲曾爆发大规模的鼠疫，当时因为人们对健康的认识有限，鼠疫杆菌(Yersinia pestis)通过寄生在啮齿类动物上的跳蚤，传播至人类居民区造成2500万人丧生，同时这也是人类历史上最致命的瘟疫事件之一。直到21世纪关于鼠疫的报道还时常出现在人们的视野中，致病微生物对人类的威胁从未远去。因此，有效杀灭微生物对人类的健康有着至关重要的作用。
目前，杀菌产品的种类繁多，杀菌产品市场因为人们对健康的重视而日益增加。根据2020年的研究数据显示，杀菌产品市场规模达到$50亿美元，市场市值在过去的5年中以每年5.5％的速度增长。同时研究表明，近年来因为气候变暖，新型疾病和瘟疫频频出现在世界各地，各国纷纷加大普及消毒卫生知识的力度，而人们的卫生意识也在逐步提高。相应的杀菌产品也在人们生活中普及，各种含氯消毒液、苯扎氯铵湿巾、消毒酒精等渐渐成为各大超市的畅销品。
我国有14亿人口，杀菌用品市场庞大，近年来，我国加大对医疗卫生事业的投入力度，各大厂商也因此研发各种新型杀菌产品。因此，对于新型杀菌产品而言，能够快速确定其杀菌性能和作用时间是设立新产品的关键，而且，一种测试环境变量可控、检测步骤简单、易重复、结果可靠性高的杀菌产品测试技术方案，对新型杀菌产品的研发尤为重要。
本技术方案可快速确定新产品的有效作用时间，测试时考虑到了样品液菌株残留与物理除菌对测试结果的影响。配合实验载体套件不同的使用方式，本方案能准确模拟杀菌产品的真实使用环境，从而得出准确可靠的实验结果，并通过本方法提供的公式快速算出单位面积杀菌效力。此外配套的可重复使用的微生物载体套件，可使微生物分布更均匀，载体板和底座适用于现有的实验器皿，让模拟使用环境测试可以在超净工作台等环境变量可控的地方进行，减少了环境和微生物载体对实验的影响。此外微生物载体板可以用多种材料制作(不锈钢，玻璃等)，因此能模拟不同物体表面的测试情况。配套底座设有卡位和防贴合孔，方便取放且能适合不同材质的载体，从而让测试操作更简便、载体套件更统一也更容易进行重复测试。本测试方案可以快速、准确、可靠地测出新型杀菌产品的实际使用效果，因此，非常有利于在新型杀菌产品研发过程中，对新产品性能的综合评估。
发明内容
本发明的目的旨在克服了在新型杀菌产品研发过程中，难以准确快速确定有效作用时间，模拟使用情况杀菌效力测试中的环境变量不可控，载体不统一且难以操作，重复测试之间结果误差大，微生物分布不均匀，模拟测试结果和实际使用结果差别大的缺陷，等诸多方面的不足。提供一种可在模拟使用环境中，检测杀菌产品的有效作用时间与单位面积杀菌效力，且测试环境变量可控、测试步骤简单可靠、易重复、测试成本低的杀菌产品杀菌效力的检测方法。在本发明中，所述的环境变量为：温度、湿度、有机干扰度和载体材质等，而这些所有环境变量均为可控变量。而且，在测试中，也考虑到了测试液菌株残留(以下用Cr作标记)与物理除菌值(以下用Cp作标记)两种会影响实际使用效果的测试变量，使得本测试结果较一般测试更为准确，更贴近真实使用情况。还有，在测试中，所用的微生物会等量均匀分布在载体套件上，避免了局部浓度过高而造成的假阳性。
为了达到上述目的，本发明的检测方法步骤如下。
(1)测试所需载体套件：测试前根据实际作用面积选择对应载体套件，若实际作用面积等于或大于25cm2，选取25cm2的载体套件，若实际作用面积小于25cm2，选取用4cm2的载体套件，所述25cm2载体套件的载体板均分成25格，每格为10mm×10mm，所述4cm2载体套件的载体板均分成4格，每格为10mm×10mm。
(2)使用载体套件进行有效作用时间筛选：其步骤如下：
步骤1：载体套件染菌，用浓度为5.0×108–1.0×109cfu/ml的菌悬液滴给载体套件染菌，若为25cm2的载体套件，用微量移液器分别向载体板上的每个网格滴加4μl菌悬液并均匀涂在网格中，直至滴满每格，待干燥后，其载体板载菌量应在5.0×107–1.0×108cfu的范围内，若为4cm2的载体套件，用微量移液器分别向载体板上的每个网格滴加5μ菌悬液并均匀涂在网格中，直至滴满每格，待干燥后，其载体板载菌量应在1.0×107–2.0×107cfu的范围内；步骤2：测试不同作用时间，取出步骤1已染菌的载体板，将其载菌面朝下放入向装有10ml待测样品的无菌广口瓶内，开始计时并震荡60秒，当计时到60秒、3分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟时，每个时间点用移液枪分别取20μl样品滴入10支10ml恢复培养基中并作为实验测试组，此步骤重复3次；
步骤3：测试阴性与阳性对照组，阳性对照组包含：载菌量计算、培养基有效恢复对照和有效中和对照，所述载菌量计数应将载体板放入装有10ml 0.1％蛋白胨水的平底无菌瓶子中，震荡60秒后做菌株计数，载菌量应在套件规定参数内，所述有效恢复对照将100μl含10-100cfu的菌悬液加入10ml恢复培养基，所述有效中和对照应将20μ待测样品加入10ml恢复培养基，震荡10秒后将100μl含10-100cfu的菌悬液加入同一支培养基，阴性对照组：取3支恢复培养基，1支加20μl待测样品，1支加入20μl无菌蛋白胨盐水，1支保持未开封，此后，将所述测试组60支培养基与所述对照组5支培养基在37℃培养箱中培养48小时，培养后进行检查，若三次测试中每次该时间点的10支培养基均为阴性，且通过阳性与阴性对照，则将该时间点作为有效作用时间，并用于下述使用载体套件进行单位面积杀菌效力的检测中。
(3)使用载体套件进行单位面积杀菌效力测试：使用载体套件进行有效作用时间筛选后，根据待测产品的实际用法将染菌后的载体板进行如下三种检测作用方法的一种或多种：
浸泡作用法：染菌后将30组载体板载菌面朝下，分别放入装有10ml待测样品的无菌广口瓶中，震荡60秒，并且浸泡至有效作用时间后，取出该载体板，再将其放入装有10ml中和液的无菌广口瓶中，震荡60秒，作为载体板测试组，与此同时，从载体板测试组取1ml测试后的样品液加入9ml中和液，震荡10秒，作为样品残留菌计数组，然后，将载体板测试组与残留菌计数组在中和液中中和10分钟后进行菌株计数，此外，取3套染菌载体板分别放入10ml 0.1％蛋白胨水中，震荡60秒后，做菌株计数，其计数结果作为阳性对照，另取一套未染菌载体板重复前述步骤作为阴性对照，最后，所述载体板测试组、样品残留菌计数组和所述对照组于37℃培养箱中培养48小时后进行菌落计数；
喷洒作用法：测试前将喷壶经消毒及无菌环境进行风干；然后取400ml待测样品加入喷壶内，测量喷洒10ml待测样品完全覆盖载体板面积所需的喷洒次数，此后，将喷壶用架子安装在距离样品20-30cm处，取出30个装有干燥后的染菌载体套件的培养皿，并用喷壶分别向染菌载体板均匀地喷洒待测样品，其喷洒次数为测试前测量的次数，待作用至有效作用时间后，用无菌镊子取出载体板，再将其载菌面朝下转移至装有10ml中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒，作为载体板测试组用于菌株计数，与此同时取1ml测试后样品液加入9ml中和液，震荡10秒，作为测试样品残留菌计数组，然后将载体板测试组与样品残留菌计数组均在中和液作用10分钟后进行菌株计数，此外，取3套染菌载体板分别放入10ml 0.1％蛋白胨水中，震荡60秒后做菌株计数，其计数结果作为阳性对照，另取一套未染菌载体重复以上步骤作为阴性对照，最后，载体板测试组、样品残留菌计数组与所述对照组在37℃培养箱中培养48小时后进行菌落计数；
擦拭作用法：测试前将31个无菌棉球放入500ml无菌广口瓶，加入310ml待测样品浸泡2分钟，另外将3个无菌棉球放入50ml无菌广口瓶，加入30ml无菌硬水用于对照组，测试时，取30个装有干燥后的染菌载体套件的培养皿，分别用泡过样品的无菌棉球擦拭载体板，(擦拭时从左上端网格开始，从左到右从上到下“Z”字形擦拭3次)，待其作用至有效作用时间后用无菌镊子取出载体板，并将其载菌面朝下转移至装有10ml中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒，作用10分钟后，作为载体板测试组用于菌株计数，另取3套染菌载体分别用浸泡过无菌硬水的无菌棉球取代浸泡过样品的棉球，与测试组重复相同步骤，用于物理除菌对照组，再取3套染菌载体分别放入10ml 0.1％蛋白胨水中，震荡60秒后做菌株计数，计数结果作为阳性对照，以及另取一套未染菌载体与测试组重复相同步骤作为阴性对照，载体板测试组，物理除菌组与所述对照组在37℃培养箱中培养48小时后进行菌落计数；
所述三种检测作用方法的载体板测试组为30组，并记为Ct1-Ct30，样品残留菌计数组为30组，并记为Cr1-Cr30，阳性计数对照组为3组，并记为Cc1-Cc3，物理除菌对照组为3组，并记为Cp1-Cp3。
(4)利用公式计算单位面积杀菌效力：其步骤如下：
步骤1：将使用载体套件进行单位面积杀菌效力测试中的载体测试组菌落数(Ct1-Ct30)、样品残留菌计数组菌落数(Cr1-Cr30)、阳性对照组菌落数(Cc1-Cc3)和物理除菌组菌落数(Cp1-Cp3)使用以下求和公式进行求和计算，其菌落数之和分别为Ct、Cr、Cc和Cp，其菌落计数求和公式(cfu)：
步骤2：根据测试选取所需载体套件大小与三种检测作用方法选择下述公式代入步骤1的菌落数求和计算结果并得出单位面积杀菌数与单位面积杀菌对数值；
应用于25cm2的载体板，其浸泡作用法和喷洒作用法杀菌效力计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数(cfu/cm2)：R＝(Cc-0.1×(Ct+Cr))/75
平均每平方厘米杀菌对数值：
Rlog＝log(Cc/75)-log((Ct+Cr)/750)
应用于25cm2的载体板，其擦拭作用法计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数(cfu/cm2)：R＝(Cc-0.1×Ct)/75
平均每平方厘米杀菌对数值：Rlog＝log(Cc/75)-log(Ct/750)
平均每平方厘米净除菌数(除去物理除菌值)(cfu/cm2)：
Rn＝(Cp-0.1×Ct)/75
平均每平方厘米净杀菌对数值(除去物理除菌值)：
Rlogn＝log(Cp/75)-log(Ct/750)
应用于4cm2的载体板，其浸泡作用法和喷洒作用法的杀菌效力计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数(cfu/cm2)：R＝(Cc-0.1×(Ct+Cr))/12
平均每平方厘米杀菌对数值：
Rlog＝log(Cc/12)-log((Ct+Cr)/120)
应用于4cm2的载体板，其擦拭作用法的计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数(cfu/cm2)：R＝(Cc-0.1×Ct)1/2
平均每平方厘米杀菌对数值：Rlog＝log(Cc/12)-log(Ct/120)
平均每平方厘米净除菌数(除去物理除菌值)(cfu/cm2)：
Rn＝(Cp-0.1×Ct)/12
平均每平方厘米净杀菌对数值(除去物理除菌值)：
Rlogn＝log(Cp/12)-log(Ct/120)。
一种应用于上述检测方法的载体套件，分别为4cm2载体套件与25cm2的载体套件，所述载体套件包括：载体板，该载体板为4cm2或25cm2方形结构，其表面设有标记线，并且将其均分成4或25格，每格为10mm×10mm，所述载体套件还包括：底座，所述底座为直径50mm或80mm圆形结构，底座的中线上设有一个长15mm的长形漏孔或者两边设有两个长20mm的长形漏孔，底座的表面设有用于载体板的4个方形分布的“L”形卡口。该技术方案中，采用两套特定尺寸的载体套件，可以简化后期计算复杂程度，若采用其它大小规格的载体套件，其后期计算较为复杂，此外，载体版上的标记线可将其均分若干方格。
与现有技术相比，本发明可快速确定新产品的有效作用时间，其测试时考虑到了样品液菌株残留与物理除菌对测试结果的影响。配合实验载体套件不同的使用方式，能准确模拟杀菌产品的真实使用环境，从而得出准确可靠的实验结果，并通过本检测方法提供的公式快速算出单位面积杀菌效力。此外，配套的可重复使用的微生物载体套件，可使微生物分布更均匀，载体板和底座适用于现有的实验器皿，让模拟使用环境测试可以在超净工作台等环境变量可控的地方进行，减少了环境和微生物载体对实验的影响。还有，微生物载体板可以用多种材料制作(不锈钢，玻璃等)，因此能模拟不同物体表面的测试情况。配套底座设有卡位和防贴合孔，方便取放且能适合不同材质的载体，从而让测试操作更简便、载体套件更统一也更容易进行重复测试。本测试方案可以快速、准确、可靠地测出新型杀菌产品的实际使用效果，因此非常有利于在新型杀菌产品研发过程中，对新产品性能的综合评估。
附图说明
图1为本发明的流程图。
图2为本发明的25cm2的载体套件结构图。
图3为本发明的4cm2的载体套件结构图。
具体实施方式
参照图1，本发明先准备测试菌株并做实验菌株确认，然后根据产品使用环境确定有机干扰度，使用合适的干扰剂制备菌悬液，最后进行以下内容：(1)选取测试所需的微生物载体套件；(2)利用载体套件进行有效作用时间筛选；(3)利用载体套件进行模拟使用环境灭菌测试；(4)实验结果分析方法与单位面积杀菌效力计算公式，其具体测试步骤如下。
1.选取测试所需载体套件。
本发明需要用配套的测试载体套件进行测试(如图2、3所示)，其共有两套测试用的载体套件，分别为25cm2的载体套件与4cm2的载体套件，每套配均有载体板4与底座1，底座为玻璃材质，载体板可根据使用环境选用玻璃、不锈钢、陶瓷等材质制作。
如图2所示，上述25cm2的载体套件的底座为直径80mm、厚3mm的圆形结构，圆形中线两边设有2个长20mm、宽5mm的漏孔3，表面设有4个方形分布的“L”形卡口2，卡口每个长5mm、宽2mm、高2mm。载体板为长宽50mm×50mm、厚3mm的方形结构，其表面设有标记线5，将载体板均分成25格，每格为10mm×10mm。
如图3所示，上述的4cm2的载体套件的底座1为直径50mm、厚3mm的圆形结构，圆形中线上端设有1个长15mm，宽5mm的漏孔3，表面设有4个方形分布的“L”形卡口2，卡口每个长5mm、宽2mm、高2mm。载体板为长宽20mm×20mm、厚3mm的方形结构，其表面设有标记线5，将载体板均分成4格，每格为10mm×10mm。
使用时将载体板放置于底座内，底座内的漏孔可方便载体板取放，并解决了加注液体后大气压导致载体板与底座难以分离的问题，底座上的“L”形卡口可固定载体板以防止载体板晃动影响测试。测试前应根据实际使用情况下的作用面积选择载体套件，若作用面积大于或等于25cm2，需选择25cm2的载体套件，若作用面积小于25cm2或作用于小物件的产品可选择4cm2的载体套件。测试时根据下述测试方法规定的参数将菌悬液滴加在载体板方格中，并用吸头涂匀，待干燥后进行测试。
上述载体套件除了解决了现有模拟测试载体不统一、菌株分布不均匀的问题外，还具有可高压蒸汽灭菌、重复利用、成本低的优势。此测试适用于现有的培养皿与无菌广口瓶，使得模拟环境测试可以在超净工作台中进行，从而排除了环境因素的干扰，套件载体板可以根据实际使用情况选择不同材质，并可以模拟浸泡、擦拭和喷洒等不同的作用方法，使得测试更贴近真实情况，结果更可靠。
2.利用载体套件进行产品有效作用时间筛选。
本步骤涉及的测试器材：采用测试器材：4套高压蒸汽灭菌后的载体套件(25cm2或4cm2)，0.1％无菌蛋白胨水，中和恢复培养基，无菌平底无菌广口瓶，微量移液器，镊子，一次性无菌培养皿(90mm或60mm)，恒温培养箱。
本次测试默认选用大肠杆菌(E.coli ATCC 10536)和金黄葡萄球菌(S.aureusATCC 6538)，其它可用测试菌株参考附录一(见说明书尾页)。测试前制备24小时培养菌并做菌株确认，然后根据实际使用环境并根据附录二(见说明书尾页)选择选合适的有机干扰剂制备浓度为5.0×108-1.0×109cfu/ml的菌悬液，该浓度值可以方便计算，快速得出结果。测试需准备65支中和恢复培养液用于测试组与对照组，如无特殊要求，测试在常温下进行。此外，在测试中，每一个数量单位可以有±5％的误差。
选取25cm2的载体套件测试步骤：
1)用微量移液器取菌悬液在载体板网格上滴4μl菌悬液并用吸头均匀涂在网格中，滴满25格，将载体放入培养皿后转移到37℃培养箱烘干或于超净工作台上自然风干。载体板载菌量应在5.0×107 -1.0×108cfu；
2)取直径8cm-10cm的平底无菌广口瓶，加入10ml待测样品；
3)用镊子将培养皿中的载体板从底座取出，其载菌面朝下放入平底无菌广口瓶中，开始计时并震荡60秒；
4)计时到60秒、3分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟时,每个时间点用移液枪分别取20μl样品，滴入10支10ml恢复培养基中。每次测试6个时间点共60支恢复培养基，本测试重复3次。测试样品和实验对照同时放在37℃培养箱中培养48小时，培养后检查是否浑浊。
选取4cm2的载体套件测试步骤：
1)用微量移液器取菌悬液在载体网格上滴5μl菌悬液并用吸头均匀涂在网格中，滴满4格，将载体放入培养皿后转移到37℃培养箱中烘干，或于超净工作台上自然风干。载体载菌量应在1.0×107–2.0×107cfu；
2)取直径3cm-5cm的平底无菌广口瓶，加入10ml待测样品；
3)用镊子将培养皿中的载体板从底座取出，载菌面朝下放入无菌广口瓶中，开始计时并震荡60秒；
4)当计时到60秒、3分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟时,每个时间点用移液枪分别取20μl样品，滴入10支10ml恢复培养基中。每次测试6个时间点共60支恢复培养基，本测试重复3次。测试样品和实验对照同时放在37℃培养箱中培养48小时，培养后检查是否浑浊。
菌株计数：取1套干燥后的染菌载体，以10ml无菌蛋白胨盐水0.1％代替灭菌产品，将干燥后的载体板的载菌面朝下放入无菌广口瓶中，震荡60秒后做菌株计数。载菌量应在步骤1规定的浓度区间中。
培养基有效恢复对照：取1支未开封的恢复培养基，加入100μl含有10-100cfu的菌悬液，放入37℃培养箱，培养48小时。
有效中和对照：取1支未开封的恢复培养基，加入20μl待测样品，震荡60秒，静置5分钟后加入100μl含有10-100cfu的菌悬液，放入37℃培养箱，培养48小时。
阴性对照：取3支恢复培养基，1支加20μl待测样品，1支加入20μl无菌蛋白胨盐水，1支保持未开封，将3支恢复培养基与未用过的稀释液放入37℃培养箱，一起培养48小时。另外，未用过的培养基、中和液、无菌硬质水、稀释液、杀菌产品也应一同放入37℃培养箱培养48小时作为阴性对照。
上述两套载体套件进行产品有效作用时间筛选结果判定，三次测试中，该时间点内10支培养基均为阴性则判定该时间点为该灭菌产品有效作用时间。该测试结果同时需通过阳性与阴性对照测试，菌株计数应在步骤1所规定的浓度区间内。
3.利用载体套件进行模拟使用环境灭菌测试(即单位面积杀菌效力测试)。
本步骤涉及测试器材：浸泡作用法、喷洒作用法需34套高压蒸汽灭菌后的载体套件(25cm2或4cm2)，擦拭作用法需37套高压蒸汽灭菌后的载体套件(25cm2或4cm2)、0.1％无菌蛋白胨水、无菌硬质水、中和液、平底无菌广口瓶、微量移液器、镊子、喷壶、一次性培养皿(直径90mm或60mm)、恒温培养箱。
测试培养实验菌株并做菌株确认，取24小时培养菌株，并根据附录二(见说明书尾页)选取合适的有机干扰剂制成浓度为5.0×108–1.0×109cfu/ml的菌悬液。准备产品适用的中和液与对照组，如无特殊要求测试在常温下进行。
测试所用的载体套件大小与上述有效作用时间筛选测试所使用的套件相同，其中，30套载体套件为测试组，3套载体套件为阳性对照、1套载体套件为阴性对照，擦拭作用法测试需额外3套载体套件用于物理除菌对照。利用载体套件进行模拟使用环境灭菌测试中使用的载体套件与载体载菌量，与该产品之前完成的有效作用时间筛选测试相同。根据产品作用方法选择实施方案，分别为：浸泡作用法、喷洒作用法、擦拭作用法。
本步骤载体套件对应参数如下。
4cm2的载体配套60mm培养皿与直径3cm-5cm的平底无菌广口瓶。染菌方法：用微量移液器取菌悬液在载体板网格上每格滴5μl菌悬液，并用吸头均匀涂在网格中，滴满4格，将载体板放入培养皿后转移到37℃培养箱中烘干，或于超净工作台上自然风干，载体板载菌量应在1.0×107–2.0×107cfu。
25cm2的载体配套90mm培养皿与直径8cm-10cm的平底无菌广口瓶。染菌方法：用微量移液器取菌悬液在载体板网格上每格滴4μl菌悬液并用吸头均匀涂在网格中，滴满25格，将载体板放入培养皿后转移到37℃培养箱中烘干，或于超净工作台上自然风干。载体板载菌量应在5.0×107–1.0×108cfu。
利用载体套件进行浸泡作用法测试步骤：
1)取出30个装有干燥后的染菌载体套件的培养皿，分别向内加入10ml待测杀菌产品；
2)待测样品作用至有效作用时间后用无菌镊子取出载体板，并将其载菌面朝下转移至装有10ml中和剂的平底无菌广口瓶中，震荡60秒，作为载体板测试组，同时取1ml测试后的样品加入9ml中和液，震荡10秒，作为测试样品残留菌计数组；
3)载体板测试组与测试样品残留菌计数组均在中和液中作用10分钟后，分别取1ml至2个培养皿做菌株计数，并连续稀释5次至10-6用于菌株计数；
阳性对照：取3个干燥后的染菌载体板，分别以10ml无菌蛋白胨水代替中和液，将干燥后的载体板的载菌面朝下，放入含有10ml无菌蛋白胨水的无菌广口瓶中，震荡60秒后做菌株计数，其载菌量应在载体套件参数规定的浓度区间内；
阴性对照：取1个无菌载体，加入10ml杀菌产品，与载体板测试组进行相同的测试步骤。中和后分别取1ml中和液接种至2个装有10ml营养培养基的培养皿，在37℃培养箱中培养48小时作为测试阴性对照。另外，未用过的培养基、中和液、无菌蛋白胨水、稀释液、杀菌产品也应一同放入37℃培养箱培养48小时作为阴性对照。
上述浸泡作用法结果判定：培养后进行菌落计数，30组载板体测试组菌落计数，每组依次记为Ct1至Ct30，且30组载板体测试组菌落计数之和记为Ct。30组测试样品残留菌菌落计数，每组依次记为Cr1至Cr30，30组测试样品残留菌菌落计数，计数之和记为Cr。3组阳性对照菌落计数，每组依次记为Cc1至Cc3，3组阳性对照菌落计数之和记为Cc。数据记录后按照对应公式计算可得平均每平方厘米杀菌效力，测试阳性对照组载菌量在规定区间内，且阴性对照没有菌株生长，则可判定实验结果有效。
此外，该浸泡作用法记录载板体测试组30组菌株计数数据，测试结果需通过阳性与阴性对照测试，测试菌株计数应在所用载体参数规定范围内。
利用载体套件进行喷洒作用法测试步骤：
1)测试前用浓度为0.5％的过氧乙酸溶液浸泡塑料喷壶，浸泡10分钟后取出喷壶，用2L无菌水浸泡清洗，之后在无菌环境下自然风干30分钟；
2)将400ml待测样品加入塑料喷壶，调整喷壶流量，用量筒测量喷洒10ml样品所需的喷洒次数，喷洒次数应为2-5次并能完全覆盖载体面积；
3)将塑料喷壶用架子安装在距离样品20-30cm处，该距离是模拟使用距离，也是测试所需遵守的规则之一，然后取出30个装有干燥后的染菌载体套件的培养皿，分别用喷壶向染菌载体板均匀的喷洒待测样品，喷洒次数应为测试前测量的次数，且应确保培养皿内的样品量能完全覆盖载体面积；
4)待测样品作用至有效作用时间后用无菌镊子取出载体板，载菌面朝下转移至装有10ml中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒，作为载体板测试组。同时，取1ml测试后的样品加入9ml中和液，震荡10秒，作为测试样品残留菌计数组。载体板测试组与样品残留菌计数组均在中和液中作用10分钟后，分别取1ml至2个培养皿做菌株计数，并连续稀释5次至10-6用于菌株计数。阳性对照与阴性对照测试与上述浸泡作用法测试相同。其结果判定与上述浸泡作用法测试相同。
利用载体套件进行擦拭作用法测试步骤：
1)测试前应将31个无菌棉球放入500ml无菌广口瓶，加入310ml待测样品浸泡2分钟，确保棉球充分吸收样品。另外应将3个无菌棉球放入50ml无菌广口瓶，加入30ml无菌硬水用于对照组；
2)取出30个装有干燥后的染菌载体套件的培养皿，分别用泡过样品的无菌棉球擦拭载体板，擦拭时应覆盖载体上每一个网格，从左上端网格开始，从左到右从上到下“Z”字形擦拭3次。作用至有效作用时间后，用无菌镊子取出载体板，载菌面朝下转移至装有10ml中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒，作用10分钟后，分别取1ml至2个培养皿用于菌株计数，并连续稀释5次至10-6用于载体板测试组菌株计数；
阳性对照：本测试阳性对照分两组。(1)载菌量对照：分别取3个干燥后的染菌载体板，载菌面朝下转移至装有10ml中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒，连续稀释5次至10-6用于菌株计数，其载菌量应在所用载体对应参数的规定范围；(2)物理除菌对照：分别取3个干燥后的染菌载体板，用无菌硬水浸泡的棉球代替样品浸泡的无菌棉球，然后与测试组进行相同的步骤，并进行菌株计数；
阴性对照：取1套无菌载体套件，用无菌硬水浸泡的棉球代替样品浸泡的无菌棉球，然后与载体板测试组进行相同的步骤。中和后分别取1ml中和液接种至2个装有10ml营养培养基的培养皿，以37℃培养箱中培养48小时作为测试的阴性对照。另外，未用过的培养基、中和液、无菌硬质水、稀释液、杀菌产品也应一同放入37℃培养箱中培养48小时作为阴性对照。
上述擦拭作用法结果判定：培养后进行菌落计数，30组测试组菌落计数依次记为Ct1至Ct30，30组测试组菌落计数之和记为Ct。3组阳性对照菌落计数，每组依次记为Cc1至Cc3，3组阳性对照菌落计数之和记为Cc。3组物理除菌对照菌落计数，每组依次记为Cp1至Cp3，3组物理除菌对照菌落计数之和记为Cp。数据记录后按照下述对应公式计算，可得平均每平方厘米杀菌效力，测试结果需通过阳性与阴性对照测试，测试菌株计数应在所用载体参数规定范围内。
4.实验结果分析方法与单位面积杀菌效力计算公式。
1)利用载体套件进行杀菌产品有效作用时间筛选：培养48小时后检查试管，若中和恢复培养基浑浊则定义为阳性(+)，澄清则定义为阴性(-)。三次测试中，该时间点10支培养基均为阴性，则判定该时间点为测试灭菌产品有效作用时间。该测试结果需通过阳性与阴性对照测试，测试菌株计数应在所用载体参数规定范围内。此测试所得的有效作用时间点将作为待测产品的作用时间，用于载体套件模拟环境灭菌测试。
2)利用载体套件进行模拟环境灭菌测试：载体板测试组，样品残留菌计数组与对照组在37℃培养箱中培养48小时后进行菌落计数，计算出每一组载体板测试组菌落计数(Ct1-Ct30)，测试样品残留菌菌落计数(Cr1-Cr30)，阳性对照组菌落计数(Cc1-Cc3)和物理除菌组菌落计数(Cp1-Cp3)。然后按照下述方法代入下表公式计算灭菌效力。本测试包含每平方厘米杀菌数量，与每平方厘米杀菌对数值两个指标。当杀菌效力较弱，或研究产品抑菌效力较低时，则着重参考每平方厘米杀菌数量。待测产品杀菌效力较强或要求杀菌对数值较高时，应着重参考杀菌对数值，当杀菌对数值大于3时，可判定该杀菌产品有效杀灭对应微生物。
实验结果具体计算方法共分如下两步。
步骤一：菌落计数后，将30组测试组每组菌落计数按顺序记为Ct1至Ct30；30组测试样品残留菌计数组，每组菌落计数按顺序记为Cr1至Cr30；阳性对照组每组菌落计数按顺序记为Cc1至Cc3；擦拭作用法测试含3组物理除菌对照组，每组菌落计数按顺序记为Cc1至Cc3。将所得数据记录在实验记录表上，然后代入以下公式进行求和计算：
Ct＝(Ct1+Ct2+Ct3.....+Ct30)
Cr＝(Cr1+Cr2+Cr3.....+Cr30)
Cc＝(Cc1+Cc2+Cc3)
Cp＝(Cp1+Cp2+Cp3)
式中：
Ct-30组测试组每组菌落计数之和(cfu)；
Cr-30组测试样品残留菌计数组菌落计数之和(cfu)；
Cc-3组阳性对照组菌落计数之和(cfu)；
Cp-3组物理除菌对照组菌落计数之和(cfu)。
步骤二：完成求和计算后，根据测试使用套件大小(25cm2的载体套件或4cm2的载体套件)与作用方法(浸泡作用法、喷洒作用法、擦拭作用法)，选择下述公式代入步骤一所得的计算结果，进行杀菌效力计算。
应用于25cm2的载体板，其浸泡作用法和喷洒作用法杀菌效力计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数：R＝(Cc-0.1×(Ct+Cr))/75
平均每平方厘米杀菌对数值：
Rlog＝log(Cc/75)-log(((Ct+Cr)/750)
上述式中：
Ct-30组测试组每组菌落计数之和(cfu)；
Cr-30组测试样品残留菌计数组菌落计数之和(cfu)；
Cc-3组阳性对照组菌落计数之和(cfu)；
R-平均每平方厘米杀菌计数(cfu/cm2)；
Rlog-平均每平方厘米杀菌对数值。
应用于25cm2的载体板，其擦拭作用法计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数：R＝(Cc-0.1×Ct)/75
平均每平方厘米杀菌对数值：Rlog＝log(Cc/75)-log(Ct/750)
平均每平方厘米净除菌数(除去物理除菌值)：Rn＝(Cp-0.1×Ct)/75
平均每平方厘米净杀菌对数值(除去物理除菌值)：
Rlogn＝log(Cp/75)-log(Ct/750)
上述式中：
Ct-30组测试组每组菌落计数之和(cfu)；
Cr-30组测试样品残留菌计数组菌落计数之和(cfu)；
Cc-3组阳性对照组菌落计数之和(cfu)；
R-平均每平方厘米杀菌计数(cfu/cm2)；
Rlog-平均每平方厘米杀菌对数值；
Rn—除去物理除菌效力的平均每平方厘米净杀菌计数(cfu/cm2)；
Rlogn—除去物理除菌效力的平均每平方厘米净杀菌对数值。
应用于4cm2的载体板，其浸泡作用法和喷洒作用法的杀菌效力计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数：R＝(Cc-0.1×Cr)/12
平均每平方厘米杀菌对数值：
Rlog＝log(Cc/12)-log((Ct+C)/120)
上述式中：
Ct—30组测试组每组菌落计数之和(cfu)；
Cr—30组测试样品残留菌计数组菌落计数之和(cfu)；
Cc—3组阳性对照组菌落计数之和(cfu)；
R—平均每平方厘米杀菌计数(cfu/cm2)；
Rlog—平均每平方厘米杀菌对数值。
应用于4cm2的载体板，其擦拭作用法的计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数：R＝(Cc-0.1×Ct)/12
平均每平方厘米杀菌对数值：Rlog＝log(Cc/12)-log(Ct/120)
平均每平方厘米净除菌数(除去物理除菌值)：Rn＝(Cp-0.1×Ct)/12
平均每平方厘米净杀菌对数值(除去物理除菌值)：
Rlogn＝log(Cp/12)-log(Ct/120)
上述式中：
Ct—30组测试组每组菌落计数之和(cfu)；
Cr—30组测试样品残留菌计数组菌落计数之和(cfu)；
Cc—3组阳性对照组菌落计数之和(cfu)；
R—平均每平方厘米杀菌计数(cfu/cm2)；
Rlog—平均每平方厘米杀菌对数值；
Rn—除去物理除菌效力的平均每平方厘米净杀菌计数(cfu/cm2)；
Rlogn—除去物理除菌效力的平均每平方厘米净杀菌对数值。
上述单位面积杀菌效力结果分析：若计算结果平均每平方厘米杀菌对数值或净杀菌对数值大于3，则表明测试产品对测试菌有杀菌作用。本测试最小灵敏度为10cfu，25cm2的载体套件测试最小每平方厘米灵敏度为0.4cfu/cm2，载体板测试组(Ct)与样品残留计数组(Cr)之和最小值应大于等于750cfu，小于该值按750cfu进行计算。4cm2的载体套件测试最小每平方厘米敏度为2.5cfu/cm2，载体测试组(Ct)与样品残留计数组(Cr)之和最小值应大于等于120cfu，小于该值按120cfu进行计算。最终平均每平方厘米杀菌计数结果应大于最小灵敏度，若结果小于最小灵敏度，则表明测试产品对测试所用菌无杀菌作用，结果应取0cfu/cm2。
以下实施案例仅用于帮助检测人员理解本发明技术方案，但不以任何形式限制本发明技术方案。
其具体实施例：家用新型灭菌液091219，主要成分：酒精(75％)无菌水，茶树精油(0.05％)。该产品定位在于家用物体表面消毒，根据产品实际使用环境，该产品使用环境有机干扰程度较低，物体表面积大于25cm2，因此，采用25cm2的玻璃载体套件进行喷洒作用法测试，有机干扰剂为0.3％牛蛋白血清。根据以往测试结果，用含有0.6％吐温的TSB作为中和液与恢复培养液，胰蛋白大豆琼脂作为培养基，测试使用大肠杆菌(E.coli ATCC 10536)与金黄葡萄球菌(S.aureus ATCC 6538)作为测试菌株。
利用25cm2的载体套件进行产品有效作用时间筛选，其测试步骤：
(1)用0.3％牛蛋白血清制备大肠杆菌菌悬液与金黄葡萄球菌菌悬液，取8套25cm2载体套件，4套用于大肠杆菌，4套用于金黄葡萄球菌；
(2)用移液枪在载体板网格上滴4μl菌悬液，并用吸头将菌悬液均匀地涂在网格中，重复滴满25格，将载体套件放入37℃培养箱烘干；
(3)取3套烘干后的大肠杆菌载体套件，用无菌镊子将25cm2的载体板从底座取出，载菌面朝下放入直径8cm的300ml无菌广口瓶中。加入10ml待测样品，开始计时，同时震荡混匀60秒；
(4)当作用时间到1分钟、3分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟时，用移液枪于每个时间点，分别取20μl样品，分别滴入10支10ml的恢复培养基中。恢复培养基放在37℃度培养箱中培养48小时。
对金黄葡萄球菌的载体板重复以上步骤。
测试阳性对照组分为：载体菌株计数、培养基有效恢复对照、有效中和对照。
载体菌株计数：取1套烘干后的载体套件，用无菌镊子将25cm2的载体板从底座取出，其载菌面朝下放入直径8cm的300ml无菌广口瓶中，用10ml无菌硬水替代10ml待测样品，震荡60秒，作菌株计数。
培养基有效恢复对照：取2支未开封的恢复培养基，1支加入100μl含10-100cfu的大肠杆菌菌悬液，另1支加100μl含10-100cfu的金黄葡萄球菌悬液。放入37℃培养箱中，培养48小时。
有效中和对照：取2支未开封的恢复培养基，分别加入20μl待测样品，震荡60秒，静置5分钟后，取1支加100μl含10-100cfu的大肠杆菌菌悬液，另1支加100μl含10-100cfu的金黄葡萄球菌悬液，放入37℃培养箱培养48小时。
阴性对照：取3恢复支培养基，1支加20μl待测样品，1支加入20μl无菌硬质水，1支保持未开封，将3恢复支培养基与未用过的稀释液放入37℃培养箱中，一起培养48小时。
测试结果：
表1
表2
阳性对照 大肠杆菌(10536) 金黄葡萄球菌(6538)
菌株计数(cfu) 8.25×107 8.71×107
恢复培养基对照 + +
有效中和对照 + +
表3
阴性对照 无菌硬质水 待测样品 未开封恢复培养基
培养结果 - - -
上述测试结果分析：如表1所示，3次测试中的样品，在1分钟作用时间后10支培养基均为阴性，则样品对两种测试细菌的有效作用时间为1分钟。此外，本次测试中两种测试菌载菌量均在5.0×107-1.0×108cfu之间，且结果通过阳性对照与阴性对照验证，则判定本次测试结果为有效结果。
利用25cm2的载体板进行喷洒作用法测试步骤：
1)测试前用浓度为0.5％的过氧乙酸溶液浸泡塑料喷壶，浸泡10分钟后取出喷壶，用2L无菌水浸泡清洗，之后无菌环境下自然风干30分钟；
2)将400ml待测样品加入喷壶，调整喷壶流量，用量筒测量喷洒10ml样品所需的喷洒次数。喷壶流量调整后得出，3次喷洒可喷洒出10ml样品并能完全覆盖载体板；
3)用0.3％牛蛋白血清制备大肠杆菌菌悬液与金黄葡萄球菌菌悬液。取66套25cm2载体套件，33套用于大肠杆菌，33套用于金黄葡萄球菌。分别用移液枪在载体网格上滴4μl菌悬液，并用吸头将菌悬液在网格中涂均匀，重复滴满25格，并将载体套件放入37℃培养箱烘干；
4)将喷壶用架子安装在距离样品30cm处，取出30个装有干燥后的大肠杆菌载体套件的培养皿。分别用喷壶向染菌载体均匀的喷洒待测样品，每个载体喷洒3次。作用1分钟后，用无菌镊子取出载体，载菌面朝下转移至装有10ml中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒，作载体板测试组菌株计数。同时取1ml测试后的样品，加入9ml中和液，震荡10秒，作测试样品残留菌计数。测试组与样品残留菌计数组在中和液中作用10分钟后，分别取1ml至2个培养皿做菌株计数，并用0.1％蛋白胨水，次连续稀释5次至10-6，用于菌株计数。
对于金黄葡萄球菌重复以上步骤。
阳性对照：取3套干燥后的大肠杆菌载体套件，用无菌镊子取出载体，载菌面朝下转移至装有10ml中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒后，用0.1％蛋白胨水，连续稀释5次至10-6，做菌株计数。
对于金黄葡萄球菌重复以上步骤。
阴性对照:取2个无菌载体，加入10ml杀菌产品，与测试组进行相同的测试步骤。中和后分别取1ml中和液，接种至两个分别装有10ml营养培养基的培养皿中，以37℃培养48小时作为测试阴性对照。另外，未用过的培养基、中和液、0.1％蛋白胨水、杀菌产品也应一同放入37℃培养箱中，培养48小时作为阴性对照。
测试结果：
表4
表5
阳性对照计数 大肠杆菌(稀释度，cfu) 金黄葡萄球菌(稀释度，cfu)
Cc1 (10-6)85，88 (10-6)91，100
Cc2 (10-6)81，89 (10-6)97，103
Cc3 (10-6)85，83 (10-6)93，95
合计Cc 2.56×108 2.90×108
表6
阴性对照 测试对照 0.1％蛋白胨水 中和剂 测试样品 未开封恢复培养基
培养结果 - - - - -
上述测试结果分析：根据表4表5可得大肠杆菌的Ct、Cr与Cc，将其代入公式可得每平方厘米的杀菌计数为3.41×106，杀菌对数值为6.53。根据表5、6，测试结果通过阳性对照与阴性对照，阳性对照计数也在载体参数规定的范围内，测试结果准确有效。
附录一
测试可选用以下微生物：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa NCTC 6749)；普通变形杆菌(Proteus vgaris NCTC 4635)；大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 10536)；金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 6538)；猪霍乱沙门氏菌(Salmonellacholeraesuis ATCC 10708)；生孢梭菌(Clostridium sporogenes ATCC 3584)；枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 6633)；白色念珠菌(Candida albicans ATCC 10231)；巴西曲霉(Aspergillus brasiliensis ATCC 16404)。
附录二
测试需根据实际有机干扰情况选择以下有机干扰剂制备菌悬液：无有机干扰：无菌硬质水；低度有机干扰：无菌0.3％牛蛋白血清溶液；中度有机干扰：无菌3.0％牛蛋白血清溶液；重度有机干扰：无菌10％牛蛋白血清溶液。

Claims (1)

1.一种杀菌产品有效作用时间与杀菌效力的检测方法，其特征是，包括如下步骤：
(1)测试所需载体套件：载体套件分别为4cm2载体套件与25cm2的载体套件，所述每套载体套件包括：载体板，该载体板为4cm2或25cm2方形结构，其表面设有标记线，并且将其均分成4或25格，每格为10mm×10mm，所述每套载体套件还包括：底座，所述底座为直径50mm或80mm圆形结构，底座的中线上设有一个长15mm的长形漏孔或者两边设有两个长20mm的长形漏孔，底座的表面设有用于载体板的4个方形分布的“L”形卡口；测试前根据实际作用面积选择对应载体套件，若实际作用面积等于或大于25cm2，选取25cm2的载体套件，若实际作用面积小于25cm2，选取用4cm2的载体套件；
(2)使用载体套件进行有效作用时间筛选：其步骤如下，
步骤1：载体套件染菌，用浓度为5.0×108–1.0×109cfu/ml的菌悬液滴给载体套件染菌，若为25cm2的载体套件，用微量移液器分别向载体板上的每个网格滴加4μl菌悬液并均匀涂在网格中，直至滴满每格，待干燥后，其载体板载菌量应在5.0×107–1.0×108cfu的范围内，若为4cm2的载体套件，用微量移液器分别向载体板上的每个网格滴加5μl菌悬液并均匀涂在网格中，直至滴满每格，待干燥后，其载体板载菌量应在1.0×107–2.0×107cfu的范围内；步骤2：测试不同作用时间，取出步骤1已染菌的载体板，将其载菌面朝下放入向装有10ml待测样品的无菌广口瓶内，开始计时并震荡60秒，当计时到60秒、3分钟、5分钟、10分钟、20分钟、30分钟时，每个时间点用移液枪分别取20μl样品滴入10支10ml恢复培养基中并作为实验测试组，此步骤重复3次；
步骤3：测试阴性与阳性对照组，阳性对照组包含：载菌量计算、培养基有效恢复对照和有效中和对照，所述载菌量计数应将载体板放入装有10ml 0.1％蛋白胨水的平底无菌瓶子中，震荡60秒后做菌株计数，载菌量应在套件规定参数内，所述有效恢复对照将100μl含10-100cfu的菌悬液加入10ml恢复培养基，所述有效中和对照应将20μ待测样品加入10ml恢复培养基，震荡10秒后将100μl含10-100cfu的菌悬液加入同一支培养基，阴性对照组：取3支恢复培养基，1支加20μl待测样品，1支加入20μl无菌蛋白胨盐水，1支保持未开封，此后，将所述测试组60支培养基与所述对照组5支培养基在37℃培养箱中培养48小时，培养后进行检查，若三次测试中每次该时间点的10支培养基均为阴性，且通过阳性与阴性对照，则将该时间点作为有效作用时间，并用于下述使用载体套件进行单位面积杀菌效力的检测中；(3)使用载体套件进行单位面积杀菌效力测试：使用载体套件进行有效作用时间筛选后，根据待测产品的实际用法将染菌后的载体板进行如下三种检测作用方法的一种或多种：浸泡作用法：染菌后将30组载体板载菌面朝下，分别放入装有10ml待测样品的无菌广口瓶中，震荡60秒，并且浸泡至有效作用时间后，取出该载体板，再将其放入装有10ml中和液的无菌广口瓶中，震荡60秒，作为载体板测试组，与此同时，从载体板测试组取1ml测试后的样品液加入9ml中和液，震荡10秒，作为样品残留菌计数组，然后，将载体板测试组与残留菌计数组在中和液中中和10分钟后进行菌株计数，此外，取3套染菌载体板分别放入10ml 0.1％蛋白胨水中，震荡60秒后，做菌株计数，其计数结果作为阳性对照，另取一套未染菌载体板重复前述步骤作为阴性对照，最后，所述载体板测试组、样品残留菌计数组和所述对照组于37℃培养箱中培养48小时后进行菌落计数；
喷洒作用法：测试前将喷壶经消毒及无菌环境进行风干；然后取400ml待测样品加入喷壶内，测量喷洒10ml待测样品完全覆盖载体板面积所需的喷洒次数，此后，将喷壶用架子安装在距离样品20-30cm处，取出30个装有干燥后的染菌载体套件的培养皿，并用喷壶分别向染菌载体板均匀地喷洒待测样品，其喷洒次数为测试前测量的次数，待作用至有效作用时间后，用无菌镊子取出载体板，再将其载菌面朝下转移至装有10ml中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒，作为载体板测试组用于菌株计数，与此同时取1ml测试后样品液加入9ml中和液，震荡10秒，作为测试样品残留菌计数组，然后将载体板测试组与样品残留菌计数组均在中和液作用10分钟后进行菌株计数，此外，取3套染菌载体板分别放入10ml 0.1％蛋白胨水中，震荡60秒后做菌株计数，其计数结果作为阳性对照，另取一套未染菌载体重复以上步骤作为阴性对照，最后，载体板测试组、样品残留菌计数组与所述对照组在37℃培养箱中培养48小时后进行菌落计数；
擦拭作用法：测试前将31个无菌棉球放入500ml无菌广口瓶，加入310ml待测样品浸泡2分钟，另外将3个无菌棉球放入50ml无菌广口瓶，加入30ml无菌硬水用于对照组，测试时，取30个装有干燥后的染菌载体套件的培养皿，分别用泡过样品的无菌棉球擦拭载体板，擦拭时从左上端网格开始，从左到右从上到下“Z”字形擦拭3次，待其作用至有效作用时间后用无菌镊子取出载体板，并将其载菌面朝下转移至装有10ml中和剂的无菌广口瓶中，震荡60秒，作用10分钟后，作为载体板测试组用于菌株计数，另取3套染菌载体分别用浸泡过无菌硬水的无菌棉球取代浸泡过样品的棉球，与测试组重复相同步骤，用于物理除菌对照组，再取3套染菌载体分别放入10ml 0.1％蛋白胨水中，震荡60秒后做菌株计数，计数结果作为阳性对照，以及另取一套未染菌载体与测试组重复相同步骤作为阴性对照，载体板测试组，物理除菌组与所述对照组在37℃培养箱中培养48小时后进行菌落计数；
所述三种检测作用方法的载体板测试组为30组，并记为Ct1-Ct30，样品残留菌计数组为30组，并记为Cr1-Cr30，阳性计数对照组为3组，并记为Cc1-Cc3，物理除菌对照组为3组，并记为Cp1-Cp3；
(4)利用公式计算单位面积杀菌效力：其步骤如下：
步骤1：将使用载体套件进行单位面积杀菌效力测试中的载体测试组菌落数Ct1-Ct30、样品残留菌计数组菌落数Cr1-Ct30、阳性对照组菌落数Cc1-Cc3和物理除菌组菌落数Cp1-Cp3使用求和公式进行求和计算，其菌落数之和分别为Ct、Cr、Cc和Cp，
其菌落cfu计数求和公式：
Ct＝(Ct1+Ct2+Ct3.....+Ct30)
Cr＝(Cr1+Cr2+Cr3.....+Cr30)
Cc＝(Cc1+Cc2++Cc3)
Cp＝(Cp1+Cp2+Cp3)；
步骤2：根据测试选取所需载体套件大小与三种检测作用方法选择下述公式代入步骤1的菌落数求和计算结果并得出单位面积杀菌数与单位面积杀菌对数值，
应用于25cm2的载体板，其浸泡作用法和喷洒作用法杀菌效力计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数：R＝(Cc-0.1×(Ct+Cr))/75
平均每平方厘米杀菌对数值：
Rlog＝log(Cc/75)-log((Ct+Cr)/750)
应用于25cm2的载体板，其擦拭作用法计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数：R＝(Cc-0.1×Ct)/75
平均每平方厘米杀菌对数值：Rlog＝log(Cc/75)-log(Ct/750)
除去物理除菌值的平均每平方厘米净除菌数：
Rn＝(Cp-0.1×Ct)/75
除去物理除菌值平均每平方厘米净杀菌对数值：
Rlogn＝log(Cp/75)-log(Ct/750)
应用于4cm2的载体板，其浸泡作用法和喷洒作用法的杀菌效力计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数：R＝(Cc-0.1×(Ct+Cr))/12
平均每平方厘米杀菌对数值：
Rlog＝log(Cc/12)-log((Ct+Cr)/120)
应用于4cm2的载体板，其擦拭作用法的计算公式如下：
平均每平方厘米杀菌数：R＝(Cc-0.1×Ct)/12
平均每平方厘米杀菌对数值：Rlog＝log(Cc/12)-log(Ct/120)
除去物理除菌值的平均每平方厘米净除菌数除去物理除菌值：
Rn＝(Cp-0.1×Ct)/12
除去物理除菌值的平均每平方厘米净杀菌对数值：
Rlogn＝log(Cp/12)-log(Ct/120)。
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