CN111748559A - Ctnnb1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用，属于细胞工程和基因工程技术领域。本发明检测了猪不同时期卵巢组织、不同大小卵泡及其颗粒细胞中CTNNB1mRNA的相对表达量，以及超表达和抑制CTNNB1后颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素的分泌情况。结果显示，CTNNB1基因参与促进颗粒细胞的增殖和雌二醇的分泌，抑制颗粒细胞的凋亡和睾酮、孕酮的分泌，说明CTNNB1基因参与母猪卵巢卵泡的发育和成熟。本发明为母猪卵巢卵泡发育过程中的分子机制研究积累了材料。

Description

CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用

技术领域

本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，具体涉及CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

背景技术

卵巢作为哺乳动物的关键繁殖器官，其主要功能是产生并排出卵子。哺乳动物初情期后，下丘脑-垂体-性腺轴的生长分泌机能逐渐完善，其分泌至血液中的促性腺激素水平升高，并作用于卵巢，促进卵巢发挥排卵和分泌生殖激素的功能。卵泡是卵巢的功能单位，由卵母细胞、颗粒细胞和膜细胞构成，其生长发育以及选择性排卵过程都受到了内分泌、旁分泌以及自分泌因子等的调控。不同发育阶段的卵泡均存在于卵巢皮质结构中，卵泡以卵泡波的形式被募集，并在生殖激素的刺激下逐步发育成熟，形成一个周期性排卵过程。根据卵泡发育的形态结构变化，可将卵泡大致分为原始卵泡、生长卵泡和成熟卵泡三个生长阶段。卵泡发育最为显著的形态变化特征为颗粒细胞的增殖。原始卵泡时期，卵母细胞被单层扁平状的颗粒细胞所包裹，随着卵泡的发育，颗粒细胞逐渐增殖至数层，且形态也由扁平状变为柱状，并在卵泡成熟排卵前形成包裹卵母细胞的卵丘颗粒细胞和紧贴卵泡内壁的壁层颗粒细胞。颗粒细胞通过促性腺激素受体、类固醇激素、各类生长因子及细胞因子等调控卵泡的发育和闭锁。目前关于CTNNB1基因对猪卵巢颗粒细胞功能的影响尚未见报道。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用。通过基因工程技术改变CTNNB1基因在猪颗粒细胞中的表达量，确定其在猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及类固醇激素分泌中的应用。

本发明的另一目的在于提供CTNNB1基因在制备调节猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的药物中的应用。

本发明的再一目的在于提供CTNNB1基因作为猪生长发育标志物的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用。

体外环境下，CTNNB1基因促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡。

体外环境下，CTNNB1基因促进猪卵巢颗粒细胞雌二醇的分泌，抑制猪卵巢颗粒细胞睾酮和孕酮的分泌。

CTNNB1基因在制备调节猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的药物中的应用。

所述的调节猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的方式为：增加CTNNB1基因的表达，促进卵巢颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌、抑制卵巢颗粒细胞的凋亡和睾酮和孕酮分泌；抑制CTNNB1基因的表达，抑制卵巢颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌、促进卵巢颗粒细胞的凋亡和睾酮和孕酮分泌。

所述的增加CTNNB1基因的表达优选通过如下方法实现：构建含有CTNNB1基因的超表达载体，将超表达载体转染猪卵巢颗粒细胞。

所述的抑制CTNNB1基因的表达优选通过如下方法实现：将抑制CTNNB1基因表达的siRNA转染猪卵巢颗粒细胞。

CTNNB1基因作为猪卵巢卵泡的生长发育标志物的应用。

体外环境下，卵泡期卵巢组织中所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量极显著高于(P<0.01)排卵期卵巢组织，排卵期卵巢组织中所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量极显著高于(P<0.01)黄体期卵巢组织。

体外环境下，在不同大小卵泡组织中，所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且中卵泡(3mm-6mm)和大卵泡(>6mm)CTNNB1基因的mRNA相对表达量显著高于小卵泡(<3mm)。

体外环境下，在不同大小卵巢颗粒细胞中，所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且中卵泡(3mm-6mm)和大卵泡(>6mm)中颗粒细胞CTNNB1基因的mRNA相对表达量显著高于小卵泡(<3mm)的颗粒细胞。

一种抑制CTNNB1基因表达的siRNA(si-CTNNB1)，其核苷酸序列如下：5′-ATACCATTCCATTGTTTGT-3′(SEQ ID NO.1)。

所述的抑制CTNNB1基因表达的siRNA的应用环境为体外环境。

本发明的验证结果如下：

1、本发明通过qRT-PCR方法检测到母猪卵泡期卵巢组织中CTNNB1 mRNA相对表达量极显著高于(P<0.01)排卵期卵巢组织，排卵期卵巢组织中CTNNB1 mRNA相对表达量又极显著高于(P<0.01)黄体期卵巢组织。结果说明CTNNB1可能参与猪卵巢卵泡的发育成熟。

2、本发明通过qRT-PCR方法检测到卵泡CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且中卵泡(3mm-6mm)和大卵泡(>6mm)中CTNNB1基因mRNA相对表达量显著高于(P<0.05)小卵泡(<3mm)(图2)。结果说明CTNNB1可能参与促进猪卵泡的生长发育。

3、本发明通过qRT-PCR方法检测到猪卵巢颗粒细胞中CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且中卵泡(3mm-6mm)和大卵泡(>6mm)中颗粒细胞CTNNB1基因的mRNA相对表达量显著高于(p<0.05)小卵泡(<3mm)颗粒细胞。结果说明CTNNB1的表达可能参与调控猪卵泡发育过程中颗粒细胞的功能。

3、本发明通过EdU法检测猪卵巢颗粒细胞的增殖情况，发现超表达CTNNB1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，颗粒细胞的增殖率极显著升高(P<0.01)。抑制CTNNB1基因表达后，与对照组(NC)相比，颗粒细胞的增殖率极显著降低(P<0.01)。

4、本发明通过Annexin V-FITC/PI技术检测猪卵巢颗粒细胞的凋亡情况，发现超表达CTNNB1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，颗粒细胞的凋亡率显著降低(P<0.05)。抑制CTNNB1基因表达后，与对照组(NC)相比，颗粒细胞的凋亡率显著升高(P<0.05)。

5、本发明通过ELISA技术检测猪卵巢颗粒细胞类固醇激素分泌情况，发现超表达CTNNB1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，细胞上清中雌二醇浓度显著增加(p<0.05)，睾酮浓度极显著减少(p<0.01)，孕酮浓度显著减少(p<0.05)。抑制CTNNB1基因表达后，与对照组NC相比，细胞上清中雌二醇浓度极显著减少(p<0.01)，睾酮浓度极显著增加(p<0.01)，孕酮浓度极显著增加(p<0.01)。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明检测了母猪不同时期卵巢组织、不同大小卵泡及其颗粒细胞中CTNNB1mRNA的相对表达量，并检测了超表达和抑制CTNNB1后颗粒细胞的增殖、凋亡、类固醇激素分泌情况。本发明的结果显示CTNNB1基因参与促进颗粒细胞的增殖和雌二醇的分泌，抑制颗粒细胞的凋亡和睾酮、孕酮分泌，说明CTNNB1基因参与母猪卵巢卵泡的生长发育和成熟。本发明为CTNNB1调控猪卵巢颗粒细胞的分子机制研究积累了材料。

附图说明

图1是不同时期猪卵巢组织中CTNNB1 mRNA的相对表达量统计图。

图2是不同大小卵泡中CTNNB1 mRNA的相对表达量统计图。

图3是不同大小卵泡的颗粒细胞中CTNNB1 mRNA的相对表达量统计图。

图4是EdU法检测超表达CTNNB1后颗粒细胞增殖的结果图。

图5是EdU法检测抑制CTNNB1表达后颗粒细胞增殖的结果图。

图6是Annexin V-FITC法检测超表达CTNNB1后颗粒细胞凋亡的结果图。

图7是Annexin V-FITC法检测抑制CTNNB1表达后颗粒细胞凋亡的结果图。

图8是ELISA法检测超表达CTNNB1后颗粒细胞类固醇激素分泌的结果图。

图9是ELISA法检测抑制CTNNB1表达后颗粒细胞类固醇激素分泌的结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1中不同时期母猪卵巢组织来源于阳江宝骏猪场的长大二元杂母猪；卵泡、颗粒细胞来源于广州市白云区孔旺记屠宰场的商品母猪。

实施例1总RNA抽提及反转录

1、组织/细胞RNA提取参照Takara公司TRIzol操作说明书，具体操作步骤如下：

(1)分别将卵泡期、排卵期和黄体期的卵巢组织用液氮研磨后，取50～100mg的组织加入1mL TRIzol，反复吹混匀；分别将大卵泡(>6mm)、中卵泡(3mm-6mm)和小卵泡(<3mm)组织用液氮研磨后，取50～100mg的组织加入1mL TRIzol，反复吹混匀；分别将大卵泡(>6mm)、中卵泡(3mm-6mm)和小卵泡(<3mm)颗粒细胞贴壁培养至合适密度，弃培养基，1×PBS清洗细胞两次，再按每10cm²的细胞培养板底面积直接加入1mL TRIzol。

(2)冰上静置10min以充分裂解组织/细胞，4℃条件下12000rpm离心5min，转移上清至新1.5mL RNase-free管中，弃沉淀。

(3)往步骤(2)的上清中加入200μL氯仿，剧烈震荡15～30s混匀，冰上静置15min，4℃条件下12000rpm离心15min。

(4)转移上层水相至新的1.5mL RNase-free EP管中。

(5)往步骤(4)的上层水相中加入0.5mL异丙醇，轻轻地上下颠倒混匀，冰上静置10min，4℃条件下12000rpm离心10min。

(6)弃上清后于室温下沿管壁加入1mL用DEPC水稀释的75％(v/v)乙醇以洗涤RNA，4℃条件下12000rpm离心5min，弃上清。

(7)真空干燥5～10min，注意避免RNA沉淀干燥过度。

(8)加入30～50μL DEPC水以溶解RNA沉淀。

2、mRNA的反转录参照Takara公司的PrimeScript^TM RT Master Mix试剂说明书进行，具体操作步骤如下：

(1)每500ng步骤1中抽提的总RNA加入2μL的PrimeScript^TM RT Master Mix试剂，并加入RNase Free H₂O，使溶液总体系为10μL。

(2)将上述混合液进行PCR，反应程序为：37℃、15min，85℃、5s。

实施例2qRT-PCR

将实施例1的反转录产物cDNA分别进行基因相对表达量的检测，参照ThermoScientific公司的Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2X)试剂说明书进行。实验采用比较Ct值法计算目的基因的相对表达量，具体计算公式如下：

基因相对表达量＝2^{-{〈﹙实验组目的基因Ct值﹚-﹙实验组内参基因Ct值﹚〉-〈﹙对照组目的基因Ct值﹚-﹙对照组内参基因Ct值﹚〉}}

其中GAPDH作为内参基因，本发明所用到的qRT-PCR引物为：

qRT-PCR-CTNNB1 Forward：5′-GCTGTTCGCCTTCACTAC-3′；

Reverse：5′-CTGATGAGCACGAACCAG-3′；

qRT-PCR-GAPDH Forward：5′-TCGGAGTGAACGGATTTG-3′；

Reverse：5′-TCACCCCATTTGATGTTGG-3′。

结果显示，1)母猪卵泡期卵巢组织中CTNNB1 mRNA相对表达量极显著高于(P<0.01)排卵期卵巢组织，排卵期卵巢组织中CTNNB1 mRNA相对表达量又极显著高于(P<0.01)黄体期卵巢组织(图1)。结果说明CTNNB1的表达参与猪卵巢卵泡的发育成熟。2)母猪卵巢在性腺轴分泌生殖激素的正负反馈调节作用下会呈现出周期性排卵，且卵巢表面有大小不等的卵泡出现。因此，本发明按照直径大小将卵巢卵泡划分为小卵泡(<3mm)、中卵泡(3mm-6mm)和大卵泡(>6mm)，并以母猪不同大小卵泡组织的cDNA为模板，通过qRT-PCR方法检测发现卵泡CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且中卵泡(3mm-6mm)和大卵泡(>6mm)中CTNNB1基因mRNA相对表达量显著高于(P<0.05)小卵泡(<3mm)(图2)。结果说明CTNNB1参与促进猪卵泡的生长发育。3)猪卵泡颗粒细胞中CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且中卵泡(3mm-6mm)颗粒细胞中CTNNB1基因mRNA相对表达量显著高于(p<0.05)小卵泡(<3mm)颗粒细胞；大卵泡(>6mm)颗粒细胞中CTNNB1基因mRNA相对表达量极显著高于(p<0.01)小卵泡(<3mm)颗粒细胞。(图3)。以上结果说明CTNNB1的表达参与调控猪卵泡发育过程中颗粒细胞的功能。

实施例3构建CTNNB1基因的超表达载体

(1)利用BioEdit软件分析发现CTNNB1基因(Gene ID:397657)的CDS区序列NM_214367.1:201-2546(SEQ ID NO.2)无KpnI和XhoI两种限制性内切酶酶切位点，而pcDNA3.1(+)载体(购自Invitrogen公司)存在KpnI和XhoI酶切位点。

(2)利用primer premier 5.0软件设计CTNNB1基因CDS区的扩增引物，其上下游引物分别加上KpnI和XhoI酶切位点序列，其中引物序列如下：

CTNNB1-F：5′-GGGGTACCATGGCTACCCAAGCTGATTTG-3′；

CTNNB1-R：5′-CCGCTCGAGTTACAGGTCAGTATCAAACCAGGC-3′。

(3)以猪卵巢颗粒细胞cDNA(实施例1步骤2反转录获得)为模板，PCR扩增目的片段。PCR反应体系：0.5μL cDNA、5μL 2×Taq Plus Master Mix、0.3μL上游引物、0.3μL下游引物、Nuclease-free water将体系补至10μL。反应程序为95℃预变性3min；95℃变性30s，58.8℃复性30s，72℃延伸2min，循环35次；72℃延伸10min，4℃保存。扩增产物经胶回收纯化、双酶切、回收后连接至pcDNA3.1(+)载体，再经转化、筛选、测序鉴定正确后抽提无内毒素质粒(无内毒素质粒小量提取试剂盒购自广州Magen公司)，构建成功的重组真核表达载体，命名为pcDNA3.1-CTNNB1。

实施例4卵巢颗粒细胞的培养

(1)将健康母猪的卵巢，放入1×PBS(含1％双抗(m/v，青霉素和链霉素，下同))中，置于冰上并迅速带回实验室。

(2)用1×PBS(含1％双抗)清洗卵巢3次，迅速转入无菌培养室。

(3)在无菌培养室的超净台上，用1mL无菌一次性注射器吸取卵巢有腔卵泡中的卵泡液，加入含适量DMEM的离心管中，室温下1000rpm离心5min。

(4)弃上清，加入预热的1×PBS(含1％双抗)，轻柔吹打以重悬细胞沉淀，重复清洗细胞2次。

(5)配制DMEM完全培养基：89％高糖型DMEM+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗。

(6)用完全培养基重悬细胞，接种于75mL培养瓶；置于37℃、5％CO₂的培养箱中静置培养。

实施例5卵巢颗粒细胞的接种和转染

(1)实施例4培养的颗粒细胞汇合度达到90％左右时，倒掉培养基，用预热的1×PBS清洗细胞2次。

(2)加入0.25％(m/v)胰蛋白酶消化约5min，显微镜下观察到大部分细胞漂起后，立即加入等量完全培养基(配置方法同实施例4步骤(5))终止消化。

(3)将细胞悬液转移至15mL离心管中，1000rpm离心5min，倒掉上清。

(4)1×PBS清洗细胞2次，2次1000rpm离心5min。

(5)用完全培养基轻轻重悬细胞沉淀，均匀分到每个孔中，再用完全培养基补充体积，轻轻摇匀，放培养箱中培养24h左右。

(6)观察颗粒细胞的生长状态，待细胞汇合度达70～80％左右进行转染。

(7)将实施例3的重组真核表达载体pcDNA3.1-CTNNB1(pcDNA3.1转染颗粒细胞作为对照组)转染至步骤(6)获得的颗粒细胞中，以实现在颗粒细胞中超表达CTNNB1基因。转染方法按Invitrogen公司的

3000Transfection Kit试剂盒说明书进行；每组设置3个重复。

(8)将小干扰RNA片段si-CTNNB1(si-CTNNB1：5′-ATACCATTCCATTGTTTGT-3′)和对照组NC(均由广州市锐博生物科技有限公司合成，NC货号为Lot：R0824)转染至步骤(6)获得的颗粒细胞中，以实现抑制颗粒细胞中CTNNB1基因的表达。转染方法按Invitrogen公司的

3000Transfection Kit试剂盒说明书进行；每组设置3个重复。

(9)转染后的细胞置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养。

(10)根据实验目的在转染1～3天后收集细胞。

实施例6颗粒细胞增殖检测

本发明于转染24h后采用EdU法检测实施例5获得的细胞增殖情况，实验参照广州市锐博生物科技有限公司的Cell-LightTMEdU Apollo 567In vitro Kit试剂盒说明书进行。采用48孔板，具体操作步骤如下：

(1)用DEME高糖培养基按1000:1的比例稀释EdU溶液，制备适量50μM EdU培养基。

(2)每孔加入150μL 50μM的EdU培养基，孵育2h，弃培养基。

(3)1×PBS清洗细胞2次，每次5min。

(4)每孔加入150μL细胞固定液(含4％多聚甲醛的1×PBS)，室温孵育30min，弃固定液。

(5)每孔加入150μL 2mg/mL的甘氨酸，脱色摇床孵育5min，弃甘氨酸溶液。

(6)每孔加入150μL 1×PBS，脱色摇床清洗2次，每次5min，弃PBS。

(7)每孔加入150μL的1×Apollo染色反应液，室温下避光孵育30min，弃染色反应液。

(8)加入150μL渗透剂(含0.5％Triton X的1×PBS)，脱色摇床清洗3次，每次5min，弃渗透剂。

(9)用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst3342反应液，避光保存。

(10)每孔加入150μL 1×Hoechst3342反应液，室温下避光孵育30min，弃反应液。

(11)每孔加入150μL 1×PBS清洗5次，每次5min。

(12)每孔加入150μL 1×PBS保存待用。

(13)染色完成后，用荧光显微镜进行照片采集。

检测结果显示，超表达CTNNB1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，颗粒细胞的增殖率极显著升高(P<0.01)(图4)。抑制CTNNB1基因表达后，与对照组(NC)相比，颗粒细胞的增殖率极显著降低(P<0.01)(图5)。

实施例7颗粒细胞凋亡检测

本发明于转染48h后采用Annexin V-FITC/PI技术检测实施例5获得的细胞凋亡情况，实验参照广州科易达生物科技有限公司FITC Annexin V Apoptosis Detection Kitwith PI试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下：

(1)将细胞培养板放置在室温，用1×PBS轻轻润洗培养板内细胞，弃PBS。

(2)加入0.25％(m/v)胰蛋白酶消化约5min，显微镜下观察到大部分细胞漂起，立即加入等量完全培养基(配置方法同实施例4步骤(5))终止消化。

(3)1000rpm离心5min收集细胞，弃上清，用预冷1×PBS清洗细胞2次。

(4)调整每管细胞数为(0.2～1.0)×10⁶个，加入500μL 1×Binding Buffer重悬细胞。

(4)加入5μL Annexin V-FITC，室温下避光反应15min。

(5)加入5μL PI(碘化丙啶染色液)，轻轻混匀，4℃避光反应5min。

(6)立即用流式细胞仪检测分析(每组三个重复)。

检测结果显示，超表达CTNNB1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，颗粒细胞的凋亡率显著降低(P<0.05)(图6)。抑制CTNNB1基因表达后，与对照组(NC)相比，颗粒细胞的凋亡率显著升高(P<0.05)(图7)。

实施例8颗粒细胞类固醇激素分泌检测

本发明于转染48h后采用ELISA法检测实施例5获得的颗粒细胞的类固醇激素分泌，实验参照上海江莱生物科技有限公司的酶联免疫吸附测定试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下：

(1)设置标准品孔和样本孔，加入50μL不同浓度的标准品至标准品孔。

(2)收集细胞培养液上清，3000rpm离心20min，吸取上清。

(3)样本孔分别设待测样品孔和空白孔，吸取10μL上清加到含40μL样品稀释液的待测样品孔中，空白孔除外。

(4)用封板膜封住反应孔，于37℃孵育30min，弃液体。

(5)每孔加350μL洗涤液，静置30s，弃洗涤液，洗涤5次。

(6)每孔加入50μL酶标试剂，空白孔除外。

(7)重复步骤(4)和(5)。

(8)每孔加入显色剂A和B各50μL，37℃避光孵育15min。

(9)每孔加入50μL终止液，于15min内测定450nm波长处的OD值。

结果显示，超表达CTNNB1基因后，与对照组(pcDNA3.1)相比，细胞上清中雌二醇浓度显著增加(p<0.05)，睾酮浓度极显著减少(p<0.01)，孕酮浓度显著减少(p<0.05)(图8)。抑制CTNNB1基因表达后，与对照组NC相比，细胞上清中雌二醇浓度极显著减少(p<0.01)，睾酮浓度极显著增加(p<0.01)，孕酮浓度极显著增加(p<0.01)(图9)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> si-CTNNB1

<400> 1

ataccattcc attgtttgt 19

<210> 2

<211> 2346

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CTNNB1基因的CDS区序列

<400> 2

atggctaccc aagctgattt gatggagctg gacatggcta tggagccaga cagaaaagcg 60

gctgttagtc actggcagca acagtcttac ctggactctg gaatccattc tggtgccacg 120

accacagctc cttctctaag tggtaaaggc aatcctgaag aagaggatgt ggataccacc 180

caagtcctat atgagtggga gcagggattt tctcagtcct tcactcaaga acaagtggct 240

gatattgatg gacagtatgc aatgactcgc gctcagaggg tacgagctgc tatgttccct 300

gagacattag atgagggcat gcagatccca tctacacagt ttgacgctgc tcatcccact 360

aatgtccagc gtctggctga accatcacag atgctgaaac atgcagttgt aaatttgatt 420

aactatcaag atgatgcaga acttgccaca cgtgcaatcc ccgaattgac aaaattgcta 480

aatgatgaag accaggtagt ggtgaataag gctgcagtta tggtccatca gctttccaaa 540

aaggaagctt ccagacatgc catcatgcgt tctcctcaga tggtgtctgc aattgtacgt 600

accatgcaga atacaaatga tgtagaaacg gctcgctgta ctgctgggac cttgcacaat 660

ctttcccatc atcgtgaggg cttgctggcc atctttaaat ctgggggcat tcctgcccta 720

gtgaagatgc ttggttcacc agtggattct gtattgtttt atgccattac aactcttcac 780

aaccttttat tgcatcagga aggagctaaa atggcagtgc gtttagctgg cgggctgcag 840

aaaatggttg ccttgctcaa caaaacaaat gttaaattct tggctattac aacagactgc 900

cttcagattt tagcttacgg caatcaagaa agcaagctga tcattctggc tagtggtgga 960

cctcaagctt tagtgaatat aatgaggacc tacacttatg agaaactact gtggaccaca 1020

agccgagtac tgaaggtgct ctctgtctgc tctagtaata agccagctat tgtagaagct 1080

ggtggaatgc aagctttagg acttcatctg acagatccaa gtcaacgtct tgttcagaac 1140

tgtctttgga ctcttaggaa tctttcagat gctgcaacta aacaggaagg gatggaaggt 1200

cttcttggga cccttgttca gcttctgggc tcggatgata taaatgtggt tacctgtgca 1260

gctggaattc tttctaatct cacttgcaat aattataaaa acaagatgat ggtgtgccaa 1320

gtgggtggta tagaggctct tgtgcgtact gtccttcgtg ctggtgacag ggaggacatc 1380

actgaacctg ccatctgtgc tctccgtcat ctgaccagcc gacaccagga agctgagatg 1440

gcccagaatg ctgttcgcct tcactacgga ctaccagttg tggttaaact cctacatcca 1500

ccatcccatt ggcctctcat caaggctacc gttggattga ttcgaaatct tgccctttgt 1560

ccagcaaatc atgcaccttt gcgagagcag ggtgccattc cacgactagt tcagttgctg 1620

gttcgtgctc atcaggatac ccagcgccgt acgtccatgg gtggaacaca gcaacagttt 1680

gtggaggggg tccgcatgga agaaatagtt gaaggttgta ctggagccct tcatatccta 1740

gctcgggatg ttcacaaccg aattgttatc agaggactaa ataccattcc attgtttgtg 1800

cagctgcttt attctcccat cgaaaatatc caaagagtag ctgcaggggt cctctgtgaa 1860

cttgctcagg acaaggaggc tgcagaagct attgaagctg agggagccac agcacctctg 1920

acagaattac tccactctag gaatgaaggt gtggcaacat acgcagctgc tgttttgttc 1980

cgaatgtctg aggacaagcc ccaggattat aagaaacggc tttcggttga gctgaccagt 2040

tctcttttca gaacagagcc aatggcttgg aatgagactg ctgatcttgg acttgatatt 2100

ggtgcccagg gagaacccct tggatatcgc caggatgatc ccagctatcg ttcttttcac 2160

tctggtggat acggccagga tgccttgggt atggacccca tgatggagca tgagatgggt 2220

ggccaccacc ccggtgctga ctatccagtt gatgggctgc cagatctggg gcatgcccag 2280

gacctcatgg atgggctgcc tccaggtgac agcaatcagc tggcctggtt tgatactgac 2340

ctgtaa 2346

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CTNNB1-F

<400> 3

ggggtaccat ggctacccaa gctgatttg 29

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> CTNNB1-R

<400> 4

ccgctcgagt tacaggtcag tatcaaacca ggc 33

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-CTNNB1上游引物

<400> 5

gctgttcgcc ttcactac 18

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-CTNNB1下游引物

<400> 6

ctgatgagca cgaaccag 18

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-GAPDH上游引物

<400> 7

tcggagtgaa cggatttg 18

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> qRT-PCR-GAPDH下游引物

<400> 8

tcaccccatt tgatgttgg 19

Claims (10)

1.CTNNB1基因在猪卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于：

体外环境下，CTNNB1基因促进猪卵巢颗粒细胞的增殖，抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡；

体外环境下，CTNNB1基因促进猪卵巢颗粒细胞雌二醇的分泌，抑制猪卵巢颗粒细胞睾酮和孕酮的分泌。

2.CTNNB1基因在制备调节猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的调节猪卵巢颗粒细胞增殖、凋亡和类固醇激素分泌的方式为：

增加CTNNB1基因的表达，促进猪卵巢颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌、抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡和睾酮和孕酮分泌；

抑制CTNNB1基因的表达，抑制猪卵巢颗粒细胞的增殖和雌二醇分泌、促进猪卵巢颗粒细胞的凋亡和睾酮和孕酮分泌。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的增加CTNNB1基因的表达通过如下方法实现：构建含有CTNNB1基因的超表达载体，将超表达载体转染猪卵巢颗粒细胞。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述的抑制CTNNB1基因的表达通过如下方法实现：将抑制CTNNB1基因表达的siRNA转染猪卵巢颗粒细胞。

6.CTNNB1基因作为猪卵巢卵泡的生长发育标志物的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

体外环境下，卵泡期卵巢组织中所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量极显著高于排卵期卵巢组织，排卵期卵巢组织中所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量极显著高于黄体期卵巢组织。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

体外环境下，在不同大小卵泡组织中，所述的CTNNB1基因的mRNA相对表达量随卵泡的发育逐渐上调，且3mm-6mm的中卵泡和>6mm的大卵泡中颗粒细胞CTNNB1基因的mRNA相对表达量显著高于<3mm的小卵泡；

体外环境下，在不同大小卵巢颗粒细胞中，3mm-6mm的中卵泡和>6mm的大卵泡中颗粒细胞CTNNB1基因的mRNA相对表达量显著高于<3mm的小卵泡。

9.一种抑制CTNNB1基因表达的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列如下：5′-ATACCATTCCATTGTTTGT-3′。

10.根据权利要求9所述的抑制CTNNB1基因表达的siRNA，其特征在于：所述的抑制CTNNB1基因表达的siRNA的应用环境为体外环境。

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