CN111748514A - 一种提高膜片钳实验效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高膜片钳实验效率的方法，包括以下步骤：用基质胶包被细胞培养板，得到基质胶包被的细胞培养板，将细胞复苏后进行传代培养，将传代培养的细胞接种至基质胶包被的细胞培养板中培养，然后将DNA或质粒转染至细胞中，将转染后的细胞加入到玻片上培养后用于膜片钳实验。本发明的方法使得上样时细胞平均存活时间增加了200％‑400％，显著地提高了膜片钳实验效率。

Description

一种提高膜片钳实验效率的方法

技术领域：

本发明属于电生理膜片钳技术领域，具体涉及一种提高膜片钳实验效率的方法。

背景技术：

膜片钳技术是一种记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上离子通道分子活动的技术。是用来研究单个离体的活细胞、组织切片或细胞膜片离子流的电生理实验技术。这项技术在可兴奋细胞如神经元、心肌细胞、肌纤维和胰腺细胞的研究中起至关重要的作用，也可用于研究特殊制备的巨型球状体中的细菌离子通道。

传统膜片钳技术对实验人员的技术要求非常高，一般地，实验人员需要经过严格的长期的训练，才能准确且快速的操作。虽然早在2004年，已经发明出了全自动膜片钳，操作简单，易掌握，通量高(是传统膜片钳的数十倍)。但是全自动膜片钳只适用于药物的初筛和二次筛选，且对样本有很高的选择性，而传统的膜片钳技术可适用于各种样本，应用范围广，能够分析检测所有的离子通道类型，同时能够分析离子通道的动力学特征。因此目前，传统膜片钳技术仍然是不可替代的。

在进行膜片钳实验时，玻璃电极尖端给负压并吸住细胞，形成高阻封接，破膜，给药，记录数据的过程，都需要细胞保持最好的活性状态，才能更加高效的获得有效数据。因此细胞的稳定性就成了评估样品好坏的关键。

在传统膜片钳实验中，样品准备是非常关键的步骤，细胞也即样品状态的好坏，直接决定了实验效率。在研究各种离子通道时，实验人员最常使用的工具细胞有HEK293T细胞系。

1973年，最原始的HEK293细胞来源于一个夭折的人类胚胎肾细胞中。将人的胚胎肾细胞中转化入人5型腺病毒DNA片段，得到的细胞即为HEK293细胞。293细胞中转入SV40T-antigen基因形成的高转衍生株，即为293T细胞系。这使得包含SV40ori的质粒能够在该细胞系中显著扩增，从而促进表达载体的扩增，促进蛋白的表达。HEK293T细胞易于转染，且能短时间内快速表达蛋白。

综上所述，传统膜片钳是电生理领域最重要的实验技术，但是因为操作难度极高和实验效率低下的原因，严重影响了传统膜片钳充分发挥其作用。

发明内容：

本发明旨在提供一种提高膜片钳实验效率的方法，从而显著地提高实验效率的目的。该方法可提高2-5倍的实验效率，使获得实验数据更加稳定和高效。

为达到上述目的，本发明采用技术方案为：

一种提高膜片钳实验效率的方法，包括以下步骤：用基质胶包被细胞培养板，得到基质胶包被的细胞培养板，将细胞复苏后进行传代培养，将传代培养的细胞接种至基质胶包被的细胞培养板中培养，然后将DNA或质粒转染至细胞中，将转染后的细胞加入到玻片上培养后用于膜片钳实验。

具体步骤如下：将基质胶加入到预冷的无血清的DMEM/F12培养基中，混匀后加入到细胞培养板中孵育，得到基质胶包被的细胞培养板，将细胞复苏后接种到含有10％胎牛血清的DMEM培养基中进行传代培养，将传代培养的细胞接种至添加有含有10％胎牛血清的DMEM培养基的基质胶包被的细胞培养板中培养，待细胞融合密度达到60％-70％时，将DNA或质粒转染至细胞中，将转染后的细胞用胰酶消化，离心收集细胞，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，将重悬后的细胞加入到玻片上培养后用于膜片钳实验。

进一步地，所述的基质胶与预冷的无血清的DMEM/F12培养基的添加比为1:100～200。

进一步地，所述的细胞为HEK293T细胞。

进一步地，所述的培养的条件为37℃、5％CO₂。

进一步地，所述的细胞培养板为6孔细胞培养板。

进一步地，所述的预冷的无血清的DMEM/F12培养基为4℃预冷的无血清的DMEM/F12培养基。

进一步地，所述的胰酶的浓度为0.05％。

进一步地，所述的用胰酶消化，其消化条件为37℃消化2min。

进一步地，所述加入到玻片上的细胞数量为1-4×10⁴个细胞。

进一步地，所用的玻片的规格是18mm×18mm。

本发明的有益效果是：

(1)加入基质胶能提高和维持细胞状态，增加细胞贴壁强度，避免了细胞在换液和转染过程中的多次加入试剂使细胞脱落，从而影响转染效率和细胞状态。

(2)降低了转染过程中加入的试剂对细胞毒性作用，使得细胞维持在一个更好的状态，提高了转染效率。

(3)加入了按一定比例稀释的基质胶Matrigel之后使得整个过程中，细胞状态得到很好的提高，因而显著提高了用于膜片钳样本(细胞)的稳定性和维持细胞的状态，使得上样时细胞平均存活时间增加了200％-400％，显著提高了膜片钳实验的效率。

附图说明：

图1为6孔细胞培养板中HEK293T细胞；其中，a为常规方法6孔细胞培养板中HEK293T细胞，b为在包被了基质胶的6孔细胞培养板中HEK293T细胞；

图2为常规方法与本发明的方法细胞存活时间对比图。

具体实施方式：

下面根据实验操作过程总结出具体实例，为本发明作进一步解释，但是值得提醒的是，以下实例仅用于解释本发明，而不是用来限制本发明。所有与本方案相同或者相似的技术方案均为本发明的保护范围之内。本实验所用试剂和仪器，均为市售商品。

实施例1一种维持细胞状态从而提高膜片钳实验效率的方法

S1、6孔细胞培养板包被：

6孔细胞培养板包被：将100μL的基质胶(Matrigel)加入到温度为4℃的10mL无血清的DMEM/F12培养基中(稀释100倍)，混匀后得到混合液，用移液枪吸取上述混合液于6孔细胞培养板中，1mL每孔，将6孔细胞培养板静置于CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养1h，得到基质胶包被的6孔细胞培养板，备用。

S2、细胞培养：

细胞复苏：从液氮罐中取出一支含有1mL HEK293T细胞的冻存管，用镊子夹着冻存管并放入37℃水浴锅中，使得细胞快速溶解；接着将细胞加入到8mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，离心90g，5min；弃上清，加入1mL上述培养基(含有10％胎牛血清的DMEM培养基)，重悬；然后接种到100mm细胞培养皿中，补加9mL上述培养基(含有10％胎牛血清的DMEM培养基)并摇晃均匀，放入CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养。

细胞传代：当细胞融合密度达到90％左右时，取2mL 0.05％胰酶消化，消化条件为37℃，2min。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基6mL，终止消化。离心90g，5min，收集细胞，加入3mL新鲜培养基(新鲜培养基为新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基)重悬。取三个新的100mm细胞培养皿分别加入上述重悬的细胞，各1mL，每皿中再加入9mL新鲜培养基(新鲜培养基为新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基)，摇匀后放入CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养。

第三次传代HEK293T细胞时，重悬后，用细胞技术仪计数，取重悬的细胞接入S1中准备好的基质胶包被的6孔细胞培养板中，每孔约4×10⁵个细胞(100μL)，每孔加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基2mL，放入CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养(图1a)。

S3、细胞转染：待6孔细胞培养板中HEK293T细胞融合密度达到60％-70％时，将连接有HERG基因(GenBank登录号NM_000238)的pCMV-3xFLAG-MCS-IRES-puro载体(购买公司：柯雷生物科技有限公司，货号：KL-ZL-0014)转染至HEK293T细胞中，转染按Qiagen提供的试剂盒说明书进行操作。

S4、细胞消化：将转染培养24小时之后的HEK293T细胞，用1mL 0.05％胰酶消化，消化条件为37℃，2min。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基4mL，终止消化。使用离心机将上述消化下来的细胞离心，离心90g，5min，去上清后收集细胞，加入3mL新鲜培养基(新鲜培养基为新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基)重悬。

S5、膜片钳上样样品制备：取18mm×18mm的玻片放入新的100mm细胞培养皿中，取S4中重悬后的细胞100μL均匀加入到18mm×18mm的玻片上，放入CO₂培养箱，37℃、5％CO₂，继续培养30分钟，后用于膜片钳上机实验细胞样品的平均存活时间是35.3min。

实施例2一种维持细胞状态从而提高膜片钳实验效率的方法

S1、6孔细胞培养板包被：

6孔细胞培养板包被：将100μL的基质胶(Matrigel)加入到15mL温度为4℃的无血清的DMEM/F12培养基中(稀释150倍)，混匀后得到混合液，用移液枪吸取上述混合液于6孔细胞培养板中，1mL每孔，将6孔细胞培养板静置于CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养1h，得到基质胶包被的6孔细胞培养板，备用。

S2、细胞培养：

细胞复苏：从液氮罐中取出一支含有1mL HEK293T细胞的冻存管，用镊子夹着冻存管并放入37℃水浴锅中，使得细胞快速溶解；接着将细胞加入到8mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，离心90g，5min；弃上清，加入1mL上述培养基(含有10％胎牛血清的DMEM培养基)，重悬；然后接种到100mm细胞培养皿中，补加9mL上述培养基(含有10％胎牛血清的DMEM培养基)并摇晃均匀，放入CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养。

细胞传代：当细胞融合密度达到90％左右时，取2mL 0.05％胰酶消化，消化条件为37℃，2min。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基6mL，终止消化。离心90g，5min，收集细胞，加入3mL新鲜培养基(新鲜培养基为新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基)重悬。取三个新的100mm细胞培养皿分别加入上述重悬的细胞，各1mL，每皿中再加入9mL新鲜培养基(新鲜培养基为新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基)，摇匀后放入CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养。

第三次传代HEK293T细胞时，重悬后，用细胞技术仪计数，取重悬的细胞接入S1中准备好的基质胶包被的6孔细胞培养板中，每孔约4×10⁵个细胞(100μL)，每孔加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基2mL，放入CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养(图1a)。

S3、细胞转染：待6孔细胞培养板中HEK293T细胞融合密度达到60％-70％时，将连接有HERG基因(GenBank登录号NM_000238)的pCMV-3xFLAG-MCS-IRES-puro载体(购买公司：柯雷生物科技有限公司，货号：KL-ZL-0014)转染至HEK293T细胞中，转染按Qiagen提供的试剂盒说明书进行操作。

S4、细胞消化：将转染培养24小时之后的HEK293T细胞，用1mL 0.05％胰酶消化，消化条件为37℃，2min。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基4mL，终止消化。使用离心机将上述消化下来的细胞离心，离心90g，5min，去上清后收集细胞，加入3mL新鲜培养基(新鲜培养基为新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基)重悬。

S5、膜片钳上样样品制备：取18mm×18mm的玻片放入新的100mm细胞培养皿中，取S4中重悬后的细胞100μL均匀加入到18mm×18mm的玻片上，放入CO₂培养箱，37℃、5％CO₂，继续培养30分钟，后用于膜片钳上机实验细胞样品的平均存活时间是38.6min。

实施例3一种维持细胞状态从而提高膜片钳实验效率的方法

S1、6孔细胞培养板包被：

6孔细胞培养板包被：将100μL的基质胶(Matrigel)加入到20mL温度为4℃的无血清的DMEM/F12培养基中(稀释200倍)，混匀后得到混合液，用移液枪吸取上述混合液于6孔细胞培养板中，1mL每孔，将6孔细胞培养板静置于CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养1h，得到基质胶包被的6孔细胞培养板，备用。

S2、细胞培养：

细胞复苏：从液氮罐中取出一支含有1mLHEK293T细胞的冻存管，用镊子夹着冻存管并放入37℃水浴锅中，使得细胞快速溶解；接着将细胞加入到8mL含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，离心90g，5min；弃上清，加入1mL上述培养基(含有10％胎牛血清的DMEM培养基)，重悬；然后接种到100mm细胞培养皿中，补加9mL上述培养基(含有10％胎牛血清的DMEM培养基)并摇晃均匀，放入CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养。

细胞传代：当细胞融合密度达到90％左右时，取2mL0.05％胰酶消化，消化条件为37℃，2min。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基6mL，终止消化。离心90g，5min，收集细胞，加入3mL新鲜培养基(新鲜培养基为新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基)重悬。取三个新的100mm细胞培养皿分别加入上述重悬的细胞，各1mL，每皿中再加入9mL新鲜培养基(新鲜培养基为新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基)，摇匀后放入CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养。

第三次传代HEK293T细胞时，重悬后，用细胞技术仪计数，取重悬的细胞接入S1中准备好的基质胶包被的6孔细胞培养板中，每孔约4×10⁵个细胞(100μL)，每孔加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基2mL，放入CO₂细胞培养箱中，37℃、5％CO₂，静置培养(图1a)。

S3、细胞转染：待6孔细胞培养板中HEK293T细胞融合密度达到60％-70％时，将连接有HERG基因(GenBank登录号NM_000238)的pCMV-3xFLAG-MCS-IRES-puro载体(购买公司：柯雷生物科技有限公司，货号：KL-ZL-0014)转染至HEK293T细胞中，转染按Qiagen提供的试剂盒说明书进行操作。

S4、细胞消化：将转染培养24小时之后的HEK293T细胞，用1mL0.05％胰酶消化，消化条件为37℃，2min。用含有10％胎牛血清的DMEM培养基4mL，终止消化。使用离心机将上述消化下来的细胞离心，离心90g，5min，去上清后收集细胞，加入3mL新鲜培养基(新鲜培养基为新鲜的含有10％胎牛血清的DMEM培养基)重悬。

S5、膜片钳上样样品制备：取18mm×18mm的玻片放入新的100mm细胞培养皿中，取S4中重悬后的细胞100μL均匀加入到18mm×18mm的玻片上，放入CO₂培养箱，37℃、5％CO₂，继续培养30分钟，后用于膜片钳上机实验细胞样品的平均存活时间是30.2min。

对比例1(也即常规方法)

对比例1的方法与实施例1的方法类似，区别仅在于，不添加基质胶(Matrigel)(图1b)。用于膜片钳上机实验细胞样品的平均存活时间是13.5min。

本发明试验样品膜片钳上机操作细胞平均存活时间对比，具体试验结果见表1：

表1不同的试验，膜片钳上机操作细胞平均存活时间对比

试验方法	平均存活时间/(min)(n＝10)
		实施例1	35.3
实施例2	38.6
		实施例3	30.2
对比例1	13.5

由表1可知，利用本发明的实施例1-3的方法膜片钳上机操作细胞平均存活时间均在30分钟以上，尤其是实施例2效果最佳，平均存活时间长达38.6min，因此将实施例2作为本发明的最佳实例。在对比例1中，未加入基质胶(Matrigel)，膜片钳上机操作细胞平均存活时间远小于加入基质胶(Matrigel)的实施例1-3(图2)。

上述本发明的实施例中，最少有以下技术效果与优点：

(1)一般地，不加基质胶(Matrigel)时的细胞样品在膜片钳实验中的平均存活时间是10min。而本发明使得细胞样品在膜片钳实验中的平均存活时间达到30min以上，能够显著地提高实验效率，获得好的，更完美的数据点。

(2)降低了转染过程中加入的试剂对细胞毒性作用，使得细胞维持在一个更好的状态，提高了转染效率。

(3)在离心时使用低速离心，90g，使离心造成的细胞损伤达到最少。

(4)提高了细胞的贴壁强度，避免了细胞在换液和转染过程中的多次加入试剂使细胞脱落，从而影响转染效果和细胞状态。

最后应当明确说明的是，上文中，已经对本技术及具体实施方案作了详尽的陈述，但是并不代表本发明仅仅局限于上述具体实例。本领域内的任何技术人员在不偏离本发明的精髓之下，在此基础之上做的任何改变、修饰、替换、组合、简化均视为同样的实验方式，都包含在本发明的保护范围内，均属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种提高膜片钳实验效率的方法，其特征在于，包括以下步骤：用基质胶包被细胞培养板，得到基质胶包被的细胞培养板，将细胞复苏后进行传代培养，将传代培养的细胞接种至基质胶包被的细胞培养板中培养，然后将DNA或质粒转染至细胞中，将转染后的细胞加入到玻片上培养后用于膜片钳实验。

2.根据权利要求1所述的提高膜片钳实验效率的方法，其特征在于，具体步骤如下：将基质胶加入到预冷的无血清的DMEM/F12培养基中，混匀后加入到细胞培养板中孵育，得到基质胶包被的细胞培养板，将细胞复苏后接种到含有10％胎牛血清的DMEM培养基中进行传代培养，将传代培养的细胞接种至添加有含有10％胎牛血清的DMEM培养基的基质胶包被的细胞培养板中培养，待细胞融合密度达到60％-70％时，将DNA或质粒转染至细胞中，将转染后的细胞用胰酶消化，离心收集细胞，加入含有10％胎牛血清的DMEM培养基重悬，将重悬后的细胞加入到玻片上培养后用于膜片钳实验。

3.根据权利要求2所述的提高膜片钳实验效率的方法，其特征在于，所述的基质胶与预冷的无血清的DMEM/F12培养基的添加比为1:100～200。

4.根据权利要求1、2或3所述的提高膜片钳实验效率的方法，其特征在于，所述的细胞为HEK293T细胞。

5.根据权利要求1、2或3所述的提高膜片钳实验效率的方法，其特征在于，所述的培养的条件为37℃、5％CO₂。

6.根据权利要求1、2或3所述的提高膜片钳实验效率的方法，其特征在于，所述的细胞培养板为6孔细胞培养板。

7.根据权利要求2所述的提高膜片钳实验效率的方法，其特征在于，所述的预冷的无血清的DMEM/F12培养基为4℃预冷的无血清的DMEM/F12培养基。

8.根据权利要求2所述的提高膜片钳实验效率的方法，其特征在于，所述的胰酶的浓度为0.05％。

9.根据权利要求2所述的提高膜片钳实验效率的方法，其特征在于，所述的用胰酶消化，其消化条件为37℃消化2min。

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