CN111743816A - 具有抗雾霾功效的护肤品添加剂及其工业化制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有抗雾霾功效的护肤品添加剂的工业化制备方法。其中，该护肤品添加剂为香菇多糖提取物，所述香菇多糖提取物在制备前先将原料进行预处理，预处理步骤为：干香菇于50～70℃烘干，粉碎，过0.5～1.5mm孔径筛网后无水状态下高温高压处理0.5～2h。经过实验证明，本发明制备得到的香菇多糖可以有效预防和修复雾霾中苯并芘对皮肤造成的损害。同时本发明制备得到的香菇多糖可以有效阻隔皮肤细胞对苯并芘的吸收。

Description

具有抗雾霾功效的护肤品添加剂及其工业化制备方法

技术领域

本发明涉及一种护肤品添加剂，具体地说是一种具有抗雾霾功效的护肤品添加剂及其制备方法。

背景技术

香菇，又名花菇、香蕈、冬菇，隶属担子菌门、伞菌纲、伞菌目、光茸菌科、香菇属，是世界第二大食用菌，在民间素有“山珍”之称。

香菇多糖提取自香菇子实体，是一种以β-D(1→3)葡聚糖残基为主链，侧链为(1→6)葡聚糖残基的葡聚糖。香菇多糖能使荷瘤式或感染后的机体的免疫应答得以提高。其制剂在动物体内筛选试验中未见直接抗癌效果，却明显促进体外淋巴细胞培养物的转化作用。目前已有动物实验表明，香菇多糖经皮下注射可以显著促进淋巴细胞增殖，提高淋巴细胞的吞噬作用，还可以通过促进内质网扩张加强细胞代谢。

目前，香菇多糖的制备的主要提取方法有：热水浸提法、微波提取法、超声波提取法、酶提取法、超临界提取、发酵提取、动态超高压微射流预处理法以及多种提取方法协助提取等方法。为了提高多糖的提取率，需要对香菇原料进行粉碎，粉碎后颗粒越小提取率越高，但颗粒越小造成提取物粘度越大越难以实现提取后的固液分离，实验室常用离心分离的方法实现固液分离，料液的得率也非常高，但扩大到工业化生产中，离心过滤的方式具有耗能大、料液得率低、操作危险、噪音大等诸多缺陷，不太适用于工业化大生产中。此外，在现有技术中用乙醇醇沉多糖进行固液分离也是必不可少的步骤，同样此方法在工业生产中具有较大的安全风险，由于需用到大量的乙醇，放大生产需配备特定的防爆车间，并严格管理。如利用滤板过滤，可以避免上述固液分离方式扩大生产后存在的风险问题，但由于香菇多糖提取物粘度较大，即使使用抽滤、压滤等方法，过滤效率仍然很低，提取物损失较大，严重影响生产效率。提取温度也能明显影响香菇多糖的提取率，提取温度越高，提取率越大。本领域技术人员提出采用灭菌锅高温高压浸提香菇多糖，该法同样只适用于实验室小试制备，放大生产具有特制的耐高温高压的设备昂贵、能耗大、生产过程危险、提取液难以固液分离，提取物性质不稳定等缺陷。综上，由于上述香菇多糖提取物制备中存在的问题造成香菇提取物的应用及大生产存在局限，如何寻找一种适用于工业化大生产的香菇多糖的制备方法是本领域技术人员研究热点。

另外，现有技术制备香菇多糖直接应用于护肤品化妆品领域还存在一个重要问题，即稳定性并不能满足护肤品长期存放和高低温环境中的高稳定性要求的问题，香菇多糖提取物添加进化妆品中易出现沉淀、浑浊、变色、有异味等情况，由于化妆品较食品有更高的产品性状要求，使得香菇多糖在化妆品中的应用受限。香菇多糖提取物电导率也会随浓缩倍数增大而增高，添加到护肤品中会影响产品品质和应用范围，如高电导率溶液不适用于乳液中添加，本领域技术人员为了降低浓缩液电导率，常在浓缩之前对提取液进行阴阳离子树脂脱盐法处理，降低溶液电导率，该法具有极好的降电导率作用，但此方法提取液会经历酸性和碱性过程，对香菇多糖分子有一定的破坏，树脂也会吸附部分多糖分子，导致香菇多糖的损失率很大(损失率在30％以上)，放大生产后香菇多糖得率过低，生产成本上升。香菇多糖提取物还存在具有特殊气味的问题，如果简单应用在护肤品中，部分消费者可能并不喜欢该味道。

综上，香菇多糖提取物在食品中的功效较为公知，但其作为护肤品添加剂的新功效研究及如何得到新功效的香菇多糖，以及如何将香菇多糖的生产工艺扩大到工业化阶段仍然是本领域技术人员研发的热点。

发明内容

本发明的首要目的在于提出一种具有抗雾霾功效的护肤品添加剂的工业化制备方法。

本发明的另一目的在于提出一种利用上述方法制备得到的护肤品添加剂。

本发明的第三目的在于提出一种含有上述护肤品添加剂的护肤品。

为了实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：

一种具有抗雾霾功效的护肤品添加剂的工业化制备方法，其中，所述护肤品添加剂为香菇多糖提取物，所述香菇多糖提取物由水提得到，在提取前先将原料进行预处理，所述预处理步骤为：干香菇于50～70℃烘干，粉碎，过0.5～1.5mm孔径筛网后无水状态下高温高压处理0.5～2h。

优选地，上述预处理中高温高压的条件参数是120～125℃，0.10～0.14Mpa，处理时间为1h。

优选地，在预处理后，所述香菇多糖由下述方法提取得到，所述方法步骤如下：

(1)提取：预处理后的原料进行水提，料液比m/m为1:20～100，70～100℃提取1～5h；

(2)粗滤：采用装有15～25μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集得到粗滤液；

(3)脱色：向粗滤液中加入质量百分比为0.5％～3.0％的活性炭，70～95℃脱色0.5～1h，采用装有0.3～0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到脱色滤液；

(4)膜浓缩：将脱色滤液经过装有超滤膜的膜分离装置，所用超滤膜截留分子量1000Da～10000Da，浓缩终点为固含量≥3.0％，收集浓缩液；

(5)精滤：采用装有0.3～0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，收集过滤液，即得。

一种具有抗雾霾功效的护肤品添加剂，其中，所述护肤品添加剂为香菇多糖提取物，所述香菇多糖提取物由上述制备方法得到的。

优选地，上述抗雾霾功效为香菇多糖提取物阻隔皮肤细胞吸附或吸收苯并芘的功效。

优选地，上述抗雾霾功效为香菇多糖提取物预防和修复苯并芘对皮肤损伤的功效。

优选地，上述香菇多糖提取物中香菇多糖的浓度为6～60ug/ml。

一种具有抗雾霾功效的护肤组合物，其中所述护肤组合物含有上述的护肤品添加剂。

一种具有抗雾霾功效的护肤组合物，其中所述护肤组合物由A、B、C、D、E和F相制成，所述各相由下述重量百分比原料组成：

A相 水 余量

丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1～0.3wt％

EDTA二钠 0.02～0.10wt％

B相 水10.00～20.00wt％

甘油1.00～5.00wt％

双丙甘醇1.00～4.00wt％

黄原胶0.05～0.10wt％

C相 甘油硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯 1.00～5.00wt％

辛酸/癸酸甘油三酯1.00～5.00wt％

甘油三(乙基己酸)酯1.00～5.00wt％

棕榈酸乙基己酯2.00～5.00wt％

D相10％氢氧化钠0.40～0.60wt％

E相权利要求4所述的香菇多糖提取物2.00～8.00wt％

F相苯氧乙醇/乙基己基甘油0.50～0.80wt％。

上述的护肤组合物的制备方法，所述制备方法步骤如下：

(1)B相：按所述用量将黄原胶用甘油和双丙甘醇分散，随后加入水，搅拌均匀得B相，备用；

(2)A相：按所述用量，称好A相的水，随后将丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物均匀撒在水面上，自然膨胀30～60min，待丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物全溶胀后再加入EDTA二钠，搅拌均匀得A相，备用；

(3)C相：按所述用量，将C相各原料混合于油相锅中，加热至80～85℃，搅拌混合均匀得C相，备用；

(4)将A相加入乳化锅中，开启搅拌，搅拌速度30～90rpm，然后加入B相，搅拌均匀，升温至80～85℃；

(5)开启乳化锅均质泵，转速为1500～3000rpm，将C相缓慢加入，保持均质10～15min；

(6)保持搅拌，降温至50～60℃，加入D相调节pH值5～7；

(7)继续搅拌降温至40～45℃，加入E相，搅拌3～5min后加入F相，搅拌10～20min；

(8)继续搅拌降温至38℃以下，出料。

本发明的有益效果：

(1)本发明制备得到的香菇多糖具有新的功效，即具有抗雾霾功效，经过实验证明，本发明制备得到的香菇多糖可以有效预防和修复雾霾中苯并芘对皮肤造成的损害。同时本发明制备得到的香菇多糖可以有效的阻隔皮肤细胞对苯并芘的吸收。

(2)本发明制备得到的香菇多糖提取物的产品性极佳，具有高稳定性，可以作为护肤品添加剂使用，尤其在对添加剂品质要求高的油剂型产品中尤其可以保持长期稳定效果，由于本发明香菇多糖提取物稳定性好，可适应护肤品运输中高温、低温、日晒及其他恶劣环境，可以长期储存不变性。

(3)本发明对香菇多糖提取物的制备工艺进行了优化和改进，改进后的工艺克服了现有技术中框板过滤不能适用于工业化生产的问题。使香菇多糖的工业化大生产提取中可以使用框板过滤的方法，过滤效果佳，多糖得率高，且生产效率大幅提升。并且框板过滤经济、环保、安全。本发明为香菇多糖的工业化生产提供了有利的支持。

附图说明

图1为香菇多糖对苯并芘的阻隔作用示意图；

图2为香菇多糖修复1uM苯并芘致HaCaT细胞3h后CYP1A1的检测示意图；

图3为香菇多糖修复1uM苯并芘致HaCaT细胞3h后HO-1的检测示意图；

图4为香菇多糖修复1uM苯并芘致HaCaT细胞12h后周期因子CDK2、CDK1的检测示意图；

图5为香菇多糖修复1uM苯并芘致HaCaT细胞24h后ROS的检测示意图；

图6为香菇多糖修复1uM BaP致HaCaT细胞4h后MDA、GSH-PX、SOD的检测示意图；

图7为香菇多糖修复1uM BaP致HaCaT细胞在m RNA水平和蛋白水平IL-8、CCL-2、IL-6的检测示意图。

具体实施方式

为了使本领域技术人员更加详细的了解本发明所述提取方法，发明人提供如下具体实施例，所涉及到的试剂均为本领域内公知且可市售购买获得的，所述涉及到的仪器设备也是本领域的技术人员公知且能够掌握和运用的设备。

本案具体实施方式中使用原料及设备购买厂家见表1和表2。

表1本发明使用原料及来源

表2本发明使用仪器及试剂盒

实施例1香菇多糖提取物制备

(1)预处理：干香菇于50℃烘干，粉碎机粉碎，过1.5mm孔径筛网后无水状态下120℃，0.10Mpa高温高压处理0.5h；

(2)提取：预处理后的原料加水进行水提，料液比m/m为1：60，70℃提取3h；

(3)粗滤：采用装有15μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到粗滤液；

(4)脱色：向粗滤液中加入质量百分比为1.0％的活性炭，80℃脱色1h，采用装有0.3μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到脱色滤液；

(5)膜浓缩：将脱色液经过装有超滤膜的膜浓缩装置，所用超滤膜截留分子量1000Da，收集浓缩液，浓缩终点为固含量≥3.0wt％；

(6)精滤：采用装有0.3μm孔径滤纸板的板框过滤，收集过滤液，即得；

(7)在工业化生产中还可增加灭菌防腐步骤：90℃灭菌30min，冷却至85℃以下，加入总质量0.8％PEHG，搅拌20min以上。

实施例2香菇多糖提取物制备

(1)预处理：干香菇于60℃烘干，粉碎机粉碎，过1mm孔径筛网后无水状态下125℃，0.14Mpa，高温高压处理1h；

(2)提取：预处理后的原料加水进行水提，料液比m/m为1:100，95℃提取1h；

(3)粗滤：采用装有20μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到粗滤液；

(4)脱色：向粗滤液中加入质量百分比为0.5％的活性炭，95℃脱色0.5h，采用装有0.4μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到脱色滤液；

(5)膜浓缩：将脱色液经过装有超滤膜的膜浓缩装置，所用超滤膜截留分子量5000Da，收集浓缩液，浓缩终点为固含量≥3.0wt％；

(6)精滤：采用装有0.4μm孔径滤纸板的板框过滤，收集过滤液；

(7)灭菌防腐：95℃灭菌30min，冷却至85℃以下，加入总质量0.8％PEHG，搅拌20min以上。

实施例3香菇多糖提取物制备

(1)预处理：干香菇于70℃烘干，粉碎机粉碎，过0.5mm孔径筛网后无水状态下121℃，0.10MPa，高温高压处理2h；

(2)提取：预处理后的原料加水进行水提，料液比m/m为1:20，100℃提取5h；

(3)粗滤：采用装有25μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到粗滤液；

(4)脱色：向粗滤液中加入质量百分比为3.0％的活性炭，70℃脱色0.5h，采用装有0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到脱色滤液；

(5)膜浓缩：将脱色液经过装有超滤膜的膜浓缩装置，所用超滤膜截留分子量10000Da，收集浓缩液，浓缩终点为固含量≥3.0wt％；

(6)精滤：采用装有0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，收集过滤液；

(7)灭菌防腐：95℃灭菌30min，冷却至85℃以下，加入总质量0.8％PEHG，搅拌20min以上。

实施例4本发明香菇多糖提取物的制备

(1)预处理：干香菇于70℃烘干，粉碎机粉碎，过0.85mm孔径筛网后无水状态下121℃，0.10MPa，高温高压预处理1h；

(2)提取：预处理后的原料加水进行水提，料液比m/m为1:30，95℃提取4h；

(3)粗滤：采用装有25μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到粗滤液；

(4)脱色：向粗滤液中加入质量百分比为1.0％的活性炭，80℃脱色1h，采用装有0.3μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到脱色滤液；

(5)膜浓缩：将脱色液经过装有超滤膜的膜浓缩装置，所用超滤膜截留分子量2000Da，收集浓缩液，浓缩终点为固含量≥3.0wt％；

(6)精滤：采用装有0.3μm孔径滤纸板的板框过滤，收集过滤液；

(7)灭菌防腐：95℃灭菌30min，冷却至85℃以下，加入总质量0.8％PEHG，搅拌20min以上。

实施例5本发明香菇多糖乳液的制备

原料及用量，见表3：

表3

制备方法：

(1)B相：按所述用量将黄原胶用甘油和双丙甘醇分散，随后加入水，搅拌均匀得B相，备用；

(2)A相：按所述用量，称好A相的水，随后将丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物均匀撒在水面上，自然膨胀30min，待丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物全溶胀后再加入EDTA二钠，搅拌均匀得A相，备用；

(3)C相：按所述用量，将C相各原料混合于油相锅中，加热至85℃，搅拌混合均匀得C相，备用；

(4)将A相加入乳化锅中，开启搅拌，搅拌速度60rpm，然后加入B相，搅拌均匀，升温至80℃；

(5)开启乳化锅均质泵，转速为1500rpm，将C相缓慢加入，保持均质12min；

(6)保持搅拌，降温至55℃，加入D相调节pH值5；

(7)继续搅拌降温至42℃，加入E相，搅拌3min后加入F相，搅拌10min；

(8)继续搅拌降温至38℃以下，出料。

实施例6本发明香菇多糖乳液的制备

原料及用量，见表4：

表4

制备方法：

(1)B相：按所述用量将黄原胶用甘油和双丙甘醇分散，随后加入水，搅拌均匀得B相，备用；

(2)A相：按所述用量，称好A相的水，随后将丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物均匀撒在水面上，自然膨胀50min，待丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物全溶胀后再加入EDTA二钠，搅拌均匀得A相，备用；

(3)C相：按所述用量，将C相各原料混合于油相锅中，加热至80℃，搅拌混合均匀得C相，备用；

(4)将A相加入乳化锅中，开启搅拌，搅拌速度30rpm，然后加入B相，搅拌均匀，升温至80℃；

(5)开启乳化锅均质泵，转速为2000rpm，将C相缓慢加入，保持均质15min；

(6)保持搅拌，降温至60℃，加入D相调节pH值6；

(7)继续搅拌降温至40℃，加入E相，搅拌3min后加入F相，搅拌10min；

(8)继续搅拌降温至38℃以下，出料。

实施例7本发明香菇多糖乳液的制备

原料及用量，见表5：

表5

制备方法：

(1)B相：按所述用量将黄原胶用甘油和双丙甘醇分散，随后加入水，搅拌均匀得B相，备用；

(2)A相：按所述用量，称好A相的水，随后将丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物均匀撒在水面上，自然膨胀60min，待丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物全溶胀后再加入EDTA二钠，搅拌均匀得A相，备用；

(3)C相：按所述用量，将C相各原料混合于油相锅中，加热至80℃，搅拌混合均匀得C相，备用；

(4)将A相加入乳化锅中，开启搅拌，搅拌速度90rpm，然后加入B相，搅拌均匀，升温至85℃；

(5)开启乳化锅均质泵，转速为3000rpm，将C相缓慢加入，保持均质10min；

(6)保持搅拌，降温至50℃，加入D相调节pH值7；

(7)继续搅拌降温至45℃，加入E相，搅拌4min后加入F相，搅拌20min；

(8)继续搅拌降温至38℃以下，出料。

实施例8本发明香菇多糖乳液的制备

原料及用量，见表6：

表6

制备方法：

(1)B相：按所述用量将黄原胶用甘油和双丙甘醇分散，随后加入水，搅拌均匀得B相，备用；

(2)A相：按所述用量，称好A相的水，随后将丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物均匀撒在水面上，自然膨胀40min，待丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物全溶胀后再加入EDTA二钠，搅拌均匀得A相，备用；

(3)C相：按所述用量，将C相各原料混合于油相锅中，加热至85℃，搅拌混合均匀得C相，备用；

(4)将A相加入乳化锅中，开启搅拌，搅拌速度60rpm，然后加入B相，搅拌均匀，升温至85℃；

(5)开启乳化锅均质泵，转速为2000rpm，将C相缓慢加入，保持均质13min；

(6)保持搅拌，降温至55℃，加入D相调节pH值6；

(7)继续搅拌降温至40℃，加入E相，搅拌3min后加入F相，搅拌15min；

(8)继续搅拌降温至38℃以下，出料。

本发明的实验过程及新功效实验

研发初衷：为响应国家政策，壮大农业科技力量，加快一二三产业融合，提高科技对于农业质量效益与竞争力提升的需求，本研究以期将香菇由食品领域扩展到护肤品领域，提高其产值，为农民和企业带来更高的经济效益。如何开发出香菇多糖在护肤品中的新用途是本案研究的重点内容。同时，护肤品对添加剂品质有较高的要求，且必须适于工业化生产，对香菇多糖的制备方法进行优化，使提取工艺适于工业化生产的同时，多糖提取物具有满足护肤品要求的高品质也是本发明研发的另一重点内容。

1.对香菇多糖提取预处理的研究

将干香菇原料50～70℃干燥恒重后，粉碎机粉碎，过0.85mm孔径筛网，备用，分别对香菇原料进行高温高压预处理、酶处理、超声处理，并以无预处理、有水高温高压预处理为对照，主要以香菇多糖后期框板过滤效果及提取率为考察指标。

多糖检测方法：将提取液用乙醇提取以除去单糖、低聚糖、苷类及生物碱等干扰成分，然后用水提取其中所含的多糖类成分。多糖在硫酸的作用下，水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，与苯酚缩合成有色化合物，用分光光度法测定其多糖含量。

香菇多糖提取率计算公式：

注：c为从标准曲线上查得样品测定液中含糖量，mg/mL；V为样品溶液体积，mL；m为干燥恒重后的香菇质量g。

下述组别中如无特殊说明，预处理后的提取步骤均为：水提，料液比1:40(m/m)，80～95℃提取3h。

本发明高温高压预处理组：将上述粉碎的香菇粉末，置于高压灭菌锅中无水状态下120～125℃，0.1Mpa处理1h，60℃烘干(为了保证实验品的存放，此处设有烘干环节，在工业化生产中可以无烘干步骤直接进行下一步的提取)；

对照组1无预处理：将上述粉碎的香菇粉末，直接进行水提。

对照组2水浸高温高压预处理：将上述粉碎的香菇粉末，按料液比1:40(m/m)加入香菇粉末和纯水，120～125℃，0.1Mpa提取1h。

对照组3酶处理(中性蛋白酶)：将上述粉碎的香菇粉末，按料液比1:40(m/m)加入香菇粉末和纯水，调节pH，分别加入0.1％(以加入的纯水的量计)中性蛋白酶55℃处理1h，再升温至90℃提取1h。

对照组4酶处理(复合植物水解酶)：将上述粉碎的香菇粉末，按料液比1:40(m/m)加入香菇粉末和纯水，调节pH，分别加入0.1％(以加入的纯水的量计)复合植物水解酶55℃处理1h，再升温至90℃提取1h。

对照组5酶处理(中性蛋白酶+纤维素酶)：将上述粉碎的香菇粉末，按料液比1:40(m/m)加入香菇粉末和纯水，调节pH，分别加入0.1％(以加入的纯水的量计)中性蛋白酶+纤维素酶55℃处理1h，再升温至90℃提取1h。

对照组6酶处理(果胶酶)：将上述粉碎的香菇粉末，按料液比1:40(m/m)加入香菇粉末和纯水，调节pH，分别加入0.1％(以加入的纯水的量计)果胶酶55℃处理1h，再升温至90℃提取1h。

对照组7超声处理：将上述粉碎的香菇粉末，按料液比1:40(m/m)加入香菇粉末和纯水，超声提取1h，提取温度为55℃，再升温至90℃提取1h。

香菇原料中多糖含量行业标准测定：按照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》中方法对香菇原料进行多糖含量测定，结果显示所用香菇原料多糖含量为4.9％。

(1)对香菇多糖得率的测定

不同处理方式香菇多糖含量比较见表7。

表7不同处理方式香菇多糖含量比较

从表7可知，酶法提取的提取液具有较高的电导率和固含量，可能是酶法提取破坏了细胞壁，使得更多的物质被提取出来，但多糖含量不佳，可见所选用的酶法提取可能得到了更多的杂质，不能显著提高多糖含量，如多糖含量不达标对于后期工艺中损失更为不利。超声提取液中各项指标均为最小，可能是超声提取不能达到很好的破壁效果。原料高温高压处理后提取液多糖含量为1.105mg/mL，提取率为3.82％为所有处理组中最高。本发明高温高压预处理组相对于对照组2的提取率提高了0.62％，对照组2有水高温高压预处理的问题是在高温条件下，溶剂蒸发较多，实际料液比增大，最终所得提取液固液分离较难且需要更多的活性炭脱色，导致香菇多糖损失率增大。

高温高压预处理原材料相比整个过程均采用高温高压提取，规模小，提取时间短，耗能低，容易实现工业化生产。因此，相比较之下，预处理方法优选本发明高温高压预处理的方式。

2.对香菇多糖提取工艺固液分离的考察

现有技术为了提高多糖的提取率，需要对香菇原料进行粉碎，粉碎后颗粒越小，提取率越高，但是这样也越难以实现提取后的固液分离。本发明实验过程中发现高温高压预处理后的香菇材料，在提取完成后框板过滤效果有大幅度提升，改进了框板过滤慢的弊端，分析原因可能是在高温高压处理环境下使得原材料中大部分蛋白质、鞣质等杂质变性，提高了提取液的澄清度稳定性，同时降低了提取液的粘度。本次实验所用纸板孔径为15～25μm，过滤压力为-0.08Mpa。

本实验采用减压抽真空的方法考察了固液分离的速率，保证过滤条件完全一致，如相同的滤纸板，同一过滤设备，相同的抽滤压力，从表8中数据可知，相同的提取过滤过滤条件下，高温高压预处理原料后料液平均得率是84.8％，是对照组(不高温高压处理)的1.3倍，香菇多糖平均提取率为3.2％，是对照组的1.7倍，平均过滤速度20.9g/min，是对照组的4.7倍，本发明通过对原料的高温高压预处理提高了多糖提取率并且使得框板过滤速率大幅提升，这可以大大缩短生产时间，提高生产效率，使得框架过滤得以在工业生产中应用，安全节能，成本大幅降低。

表8高温高压处理原料后提取液过滤速度比较

3.对香菇多糖提取方法的研究

在选定了预处理方式后，发明人对后续提取工艺及条件进行优化改进以获得最佳的工业化生产方案及最佳多糖得率。下述考察参数均是基于高温高压预处理后的原料进行的。

(1)对香菇多糖提取工艺条件参数的考察

选取预处理时间(A)、提取时间(B)、料液质量比(C)、提取pH(D)作为考察因素进行条件筛选，设计3个水平，以所得香菇多糖的提取率作为考察指标，设计L₉(3⁴)正交试验,水平显示见表9，从表里中结果表明，各因素对香菇多糖提取率影响的大小次序依次为:预处理时间＞提取时间＞料液质量比＞提取pH值。由表10方差结果分析数据可知，预处理时间(A)对香菇多糖提取效果有显著性意义(p＜0.05)，提取时间(B)、提取料液比和提取pH值影响不明显(p＞0.05)。

表9正交试验因素水平

水平	A(h)	B(h)	C	D
					1	0	2	1:30	3.0
2	1	3	1:40	6.0
					3	1.5	4	1:50	9.0

表10香菇多糖提取正交试验结果

表11香菇多糖提取正交试验方差分析

正交实验验证以香菇多糖提取率为指标，按照正交优选实验选出的工艺条件：香菇多糖提取率最高的优水平组合是A₂B₃C₁D₂，即预处理时间为1h，提取时间4h，提取料液比1:30，提取pH6.0。进行三次重复实验，提取率分为5.50％，5.26％和5.53％，均值为5.43％。相对标准偏差为2.70％。参照最佳的提取工艺条件进行了中试生产，投料量为310kg，提取后提取液多糖含量为1.954mg/mL，提取率为5.20％，按照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》中方法对香菇原料进行多糖含量测定，结果为4.90％，优化后的工艺所得香菇多糖含量高于行标法。说明工艺能够高效的提取香菇多糖，且工艺稳定可靠，能放大生产。

(2)对香菇多糖提取工艺脱色的考察

提取所得的香菇多糖提取液有特殊的气味，通过人群调查，如应用于护肤品中不同人群对其态度不一，约60％人认为其气味可以接受，约40％的人认为该气味不可接受。高温高压预处理后香菇所得提取液颜色较深，应用于水剂等澄清度要求高的护肤剂型中易影响产品品质。为了降低其色度和气味，同时不影响其功效，并且维持较低的多糖损失率，发明人优选出了活性炭脱色脱味处理，提取液中添加0.5～3％的活性炭80～95℃脱色0.5～1h，能够去掉大部分香菇的气味，提取液颜色大大降低，从表12中数据可知，脱色前后，提取液pH、电导率、固含量略有降低，色度值下降了约80.2％，多糖损失率为16.2％，此损失率是可以接受的，发明人分析一方面活性炭本身可能吸附一定量的多糖，另外一方面增加了脱色工序，料液也会损失或者被稀释，但脱色后的提取物稳定性和产品性能大幅提升，因此脱色工艺必不可少。具体数据见表12。

表12活性炭脱色效果比较

(3)对香菇多糖提取工艺脱盐浓缩的考察：

为了提高香菇多糖含量，需对提取液进行浓缩，传统的浓缩方法是真空减压浓缩，耗能较大，浓缩液的电导率也会随浓缩倍数增大而增高，一方面溶液电导率越高，提取液稳定性差，容易产生沉淀，不适于护肤品长期保存及高低温保存的要求，另一方面电导率太高在化妆品后期配方过程中不易破乳，因此必须降低溶液中电导率，常在浓缩之前对提取液进行阴阳离子树脂脱盐法处理，该法具有极好的降电导率作用，但同时对香菇多糖的损失率也很大。从表13中数据可知，将提取液不进行脱盐处理，真空减压浓缩方法和膜浓缩方法多糖得率分别为96.8％和95.0％，得率均很高，但真空减压浓缩方法浓缩液电导率从1955μs/cm上升到了11000μs/cm，该电导率条件下产品稳定性差，提取液在保存过程中极易产生沉淀，也不利于后期化护肤品配方过程。采用膜浓缩方法所得浓缩液电导率无明显升高，该电导率条件下，提取液能稳定保存，也利于后期化妆品配方过程。将提取液采用阴阳树脂脱盐后所得脱盐液电导率明显降低，电导率去除率可达94.7％，但该过程香菇多糖损失率较大，损失了30.4％，真空减压浓缩后多糖总得率仅为66.8％，远低于膜过滤方法的95.0％。另外膜浓缩方法与真空减压浓缩方法相比还具有节能，高效的优势。

本发明人经过对浓缩方式的比较，采用膜浓缩的方法对香菇多糖提取液进行浓缩。

表13不同浓缩方式提取液理化指标比较

(4)对香菇多糖提取液稳定性考察

护肤制剂中对所添加的提取物稳定性有非常高的要求，尤其是产品外观性能如澄清度、颜色、气味等在不同环境下始终要求长期保持高稳定性，现有技术制备得到的香菇多糖多应用与药品食品领域，对上述特征要求标准较低，制备出的香菇多糖无法满足护肤品领域的要求。本发明人经过对提取工艺的研究及优化，得到的香菇多糖提取物稳定性极佳，完全符合本领域产品要求。

稳定性考察方法：

将实施例4制备的香菇提取物样品用100mL样品瓶盛装，盛装量不少于80mL，贴好样品信息标签。考察条件分别为：

日常环境：把样品瓶放入室温未避光环境下。

暗环境：把样品瓶放入室温避光环境中。

冷藏环境：把样品瓶放入4±1℃冰箱中。

光照环境：把样品瓶放入28±1℃光照培养箱。

热环境为：样品瓶放入45±1℃不透光烘箱中。

稳定性数据见表14，稳定性数据显示，日常环境、暗条件、冷条件样品样品感官观测显示，18个月内均为澄清透亮，无沉淀产生，颜色无明显变化，浊度均小于5FNU，色度值显示，一年内暗条件、日常条件色度值略有增加，冷条件略有降低。其他理化指标变化均不明显，多糖含量变化小于0.2mg/mL，变化率±5％。热条件下，颜色在3个月后加深较明显，样品澄清透亮无沉淀，6个月内颜色变化在可以接受范围内(内控指标范围内)，光条件下，样品澄清透亮无沉淀，颜色肉眼观测无明显变化，色度计显示，色度值略有降低。

本发明制备得到的香菇多糖提取物稳定性好，暗、冷、光、日常条件下18个月内各项指标无明显变化，可以在室温条件下长时间保存，热条件下颜色会加深，但半年内在可接受范围内，运输过程中可能面临的高温天气，也能保证产品质量。相比现有技术超声提取的提取物放置几个月后会有大量沉淀析出。纯水热提取的香菇多糖电导率较高也会有沉淀。

表14香菇多糖提取液稳定性考察

(5)香菇多糖分子量实验报告

1.实验目的

本试验的目的是测试香菇多糖分子量。

2.试剂与仪器

2.1主要仪器

Shodex多糖凝胶柱、十八角度激光散射仪、示差检测器、HPLC Pump单元泵。

2.2主要试剂

实施例4制备香菇多糖提取物、硝酸钠(北京化工厂)、叠氮化钠(上海一基实业有限公司)、超纯水、Sephadex G-200(美国Pharmacia公司)。

2.3其它材料

移液枪1mL、天平、Waters进样瓶、EP管、一次性注射器、水系滤头(0.22μm)。

3.试验过程

香菇多糖提取液1L旋蒸至浸膏状，四倍体积无水乙醇4℃过夜，离心5000rmp分离，用水复溶200ml；再次用四倍无水乙醇醇沉4℃过夜，离心得醇沉多糖；醇沉多糖冻干，得香菇多糖冻干粉；苯酚氯仿异戊醇(25：24：1)去粗多糖蛋白，得到未纯化多糖，将粗多糖配置为4％溶液，加入无水乙醇至体积分数10％，4℃醇析12h，5000rmp离心5min，沉淀冷冻干燥成粉，命名为LNT-1；上清液合并，继续加入无水乙醇至终体积分数分别为20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％和90％，每次操作同前，将其分别命名为香菇多糖组分LNT-2、3、4、5、6、7、8、9；选取未纯化多糖含量较大的组分LNT-5和LNT-6。

将经过分级醇沉的多糖进行柱层析，所得多糖溶液进行冷冻干燥，得到分离纯化的多糖。采用凝胶渗透色谱—十八角度激光散射联用系统(GPC-MALS系统)检测经过分离纯化所得到香菇多糖，将所得多糖配成2mg/ml的溶液后经0.22μm的水系滤头，经GPC-MALS法测定。实验条件如下：

输液系统：Waters e2695系统

凝胶色谱柱：Shodex SUGER KS-805/KS-803串联

检测器：十八角度激光光散射仪与示差检测器联用

进样体积：0.1mL

流速：0.8mL/min

柱温：60℃

示差折光检测器温度：50℃

流动相：0.1mL硝酸钠溶液与0.02％叠氮化钠溶液的混合溶液(流动相经0.22μm水系过滤膜低真空过滤)。

4.实验记录

50％乙醇含量的醇沉组分为LNT-5；60％乙醇含量的醇沉组分为LNT-6；LNT-5质量为1.732g，LNT-6质量为1.249g，所得所有醇沉香菇多糖质量为4.681g，LNT-5含量为37％，LNT-6含量为26.7％。

LNT-5Mw 6.560×10⁵(±0.417％)

LNT-6Mw 5.363×10⁴(±0.522％)。

对本发明制备香菇多糖在护肤品领域新功效的开发

皮肤是人体和外部环境之间存在的边境界膜，是保护身体对付外界各种变化的重要器官。皮肤细胞在紫外线、雾霾、粉尘等外界刺激下，会出现代谢异常，影响皮肤稳态。苯并芘是一种环境污染物，由于脂溶性的特性能够通过皮肤细胞膜进入细胞质与芳香烃受体形成复合物，复合物进入细胞核进一步与芳香烃受体核转运子结合形成三复合物，上调细胞色素P4501A1(CYP1A1)的表达，最终影响细胞的正常运行。本发明开发以香菇多糖为功效原料的抗雾霾护肤制剂添加剂。通过雾霾损伤细胞模型得出香菇多糖可以修复雾霾致皮肤细胞的转录因子表达异常，为抗雾霾化妆品提供新原料。

本实验采用的香菇多糖为实施例4制备，其他实施例制备的香菇多糖测试结果同实施例4，在此不赘述。

1.香菇多糖提取物对苯并芘的阻隔作用研究

(1)实验方法：在皮肤角质形成细胞细胞培养体系中分别添加1μM苯并芘以及1μM苯并芘和60ug/ml香菇多糖，处理之后24h，利用酶联免疫吸附试验检测培养液上清中的苯并芘浓度。

(2)实验结果：如图1所示，在HaCaT细胞培养液中分别添加1μM苯并芘、1μM苯并芘和3ug/ml、6ug/ml、15ug/ml、30ug/ml和60ug/ml香菇多糖，培养24h后，利用酶联免疫吸附试验检测培养液上清中的苯并芘浓度，结果显示同时添加香菇多糖的细胞培养液中苯并芘浓度显著高于未添加多糖的实验组，分别是苯并芘处理组的1.56倍、4.02倍、4.94倍、7.10倍和9.06倍。其中，浓度为6ug/ml及以上处理组差异显著。检测结果显示同时添加香菇多糖的细胞培养液中苯并芘浓度相比较于未添加实验组增加了(85.53±10.16)％，可见，香菇多糖提取物可以有效的阻隔皮肤细胞吸附或吸收苯并芘，达到抵抗污染的功效。

2.香菇多糖对BaP致HaCaT细胞CYP1A1的影响

(1)实验方法：利用TRizol法提取细胞中总RNA，反转录获得cDNA。利用实时荧光定量PCR法检测多糖处理后细胞色素P450(CYP1A1)表达量变化。所用试剂盒见表2，方法按照试剂盒说明书进行。

(2)实验结果：苯并芘处理会导致皮肤细胞内CYP1A1含量显著增加，香菇多糖可以修复该损伤。HaCat细胞培养液中加入1μM苯并芘后，细胞内CYP1A1含量增加至(5.497±0.2002)倍；在细胞培养液中加入1μM苯并芘的同时加入6、15、30和60ug/ml香菇多糖提取液时，细胞内CYP1A1水平分别降低了(25.08±3.64)％，(36.15±4.21)％，(41.53±3.94)％和(59.56±3.74)％。这表明香菇多糖提取液可以降低由苯并芘诱导的HaCaT细胞内的CYP1A1水平，从而起到修复苯并芘造成的损伤的作用，具体见图2。

3.香菇多糖对BaP致HaCaT细胞HO-1的影响

(1)实验方法：利用TRizol法提取细胞中总RNA，反转录获得cDNA。利用实时荧光定量PCR法检测多糖处理后血红素氧合酶(HO-1)的表达量变化。所用试剂盒见表2，方法按照试剂盒说明书进行。

(2)实验结果：如图3所示，当HaCat细胞培养液中加入3、6、15和30ug/ml的香菇多糖提取液时，相比对照组细胞内CYP1A1水平分别增加了9.32±0.7921倍、16.16±1.695倍、33.04±4.970倍、68.59±5.049倍。结果显示香菇多糖提取液可以显著增加细胞内HO-1含量，表明香菇多糖可能会激活NRF-2信号通路，上调NRF-2下游基因HO-1的表达从而修复BaP对HaCaT细胞的损伤。

4.香菇多糖抑制BaP致HaCaT细胞周期的影响

(1)实验方法：利用TRizol法提取细胞中总RNA，反转录获得cDNA。利用实时荧光定量PCR法检测香菇多糖修复1uM苯并芘致HaCaT细胞12h后周期因子CDK2、CDK1的表达量变化。

(2)实验结果：如图4所示，当HaCat细胞培养液中加入苯并芘时，细胞内周期因子CDK2含量降低至(0.2481±0.02211)倍、周期因子CDK1表达量增加至(3.781±0.6316)倍。同时加入60ug/ml香菇多糖提取液时，细胞内CDK2含量比损伤细胞升高了(83.05±5.404)％、CDK1表达量比损伤细胞降低了(56.49±7.436)％，更加接近正常水平。这表明香菇多糖提取液可上调S期调控蛋白CDK2的表达，下调M期调控蛋白CDK1的表达。

图4中A图为周期因子CDK2的检测；B图为周期因子CDK1的检测；当HaCat细胞培养液中加入苯并芘时，细胞内CDK2表达量降低了75.19％(A图)、CDK1含量则升高为正常水平的278.1％(B图)。

5.香菇多糖修复苯并芘损伤皮肤细胞ROS的检测

(1)实验方法：利用荧光探针DCFH-DA进行活性氧检测，细胞内的活性氧可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF，利用流式细胞仪和荧光显微镜检测DCF的荧光即可反应细胞内活性氧的水平。荧光强度越大，表明细胞内产生的ROS越多；

(2)实验结果：

(a)图5左图所示，流式细胞仪检测不同浓度香菇多糖修复苯并芘致HaCaT细胞24h后ROS的含量；(b)图5右图所示，荧光显微镜检测香菇多糖修复苯并芘致HaCaT细胞24h后ROS的含量。

HaCat细胞培养液中加入1μM苯并芘后，细胞内ROS含量增加至(2.735±0.07498)倍；在细胞培养液中加入1μM苯并芘的同时加入3、6、15ug/ml的香菇多糖提取液时，细胞内ROS水平分别降低了(14.0±4.88)％、(37.6±1.22)％、(55.9±1.07)％，细胞内ROS水平分别是损伤对照组的0.860倍、0.624倍、0.441倍。其中加入0.5％的香菇多糖提取液后细胞内ROS含量是正常水平的1.21倍。这表明香菇多糖提取液可以降低由苯并芘诱导的HaCaT细胞内的ROS。

6.香菇多糖修复苯并芘损伤皮肤细胞MDA、SOD、GSH-PX的检测

(1)实验方法：利用MDA、SOD和GSH-Px试剂盒(南京建成提供)来检测细胞内MDA、SOD和GSH-PX的含量。

(2)实验结果：如图6所示，香菇多糖修复1uM BaP致HaCaT细胞4h后MDA、GSH-PX、SOD的检测。(A)MDA含量的检测；(B)GSH-PX含量的检测；(C)SOD酶抑制率的检测。当HaCat细胞培养液中加入苯并芘时，细胞内MDA含量升高至(297.2±18.87)％(A图)、SOD和GSH-PX活力则降低为正常水平的(8.03±0.37)％(B图)、(49.43±1.89)％(C图)。在损伤细胞中加入7.5μg/ml和60μg/ml的香菇多糖提取液时，细胞内的MDA含量比未加入时显著降低，其中60μg/ml香菇多糖可使其降低(53.01±2.12)％，较接近正常水平。而细胞中的SOD和GSH-PX活力在加入60μg/ml香菇多糖后，则分别比损伤细胞中的SOD和GSH-PX活力高(18.50±0.21)倍和(2.70±0.11)倍。这表明香菇多糖提取液可以降低由苯并芘诱导的MDA含量，升高GSH-PX含量以及SOD酶抑制率。香菇多糖提取液可以降低细胞内的脂质过氧化，增加耐受力，对损伤细胞具有修复效果。

7.香菇多糖修复苯并芘损伤皮肤细胞细胞因子IL-8、IL-6、CCL-2的检测

(1)实验方法：利用q RT-PCR和ELISA试剂盒(thermo Fisher提供)分别检测细胞内IL-8、IL-6和CCL-2在RNA和蛋白水平的含量。

(2)实验结果：如图7所示，香菇多糖修复1μM BaP致HaCaT细胞在m RNA水平和蛋白水平IL-8(图A、B)、IL-6(图C、D)、CCL-2(图E、F)的检测。当HaCat细胞培养液中加入苯并芘时，细胞内IL-8、IL-6和CCL-2的mRNA含量分别增加了2.12倍、15.72倍和2.24倍；蛋白含量也相应增加了2.44倍、3.27倍和2.59倍。在损伤细胞中加入60ug/ml香菇多糖提取液时，细胞内IL-8、IL-6和CCL-2的RNA和蛋白水平明显降低，其中蛋白含量可比损伤细胞降低了(36.23±0.0378)％、(34.80±0.017)％和(65.23±0.036)％。这表明本发明香菇多糖提取物可以降低细胞内的炎症因子表达量，对损伤细胞炎症反应具有修复效果。

Claims (10)

1.一种具有抗雾霾功效的护肤品添加剂的工业化制备方法，其特征在于：所述护肤品添加剂为香菇多糖提取物，所述香菇多糖提取物由水提得到，在提取前先将原料进行预处理，所述预处理步骤为：干香菇于50～70℃烘干，粉碎，过0.5～1.5mm孔径筛网后无水状态下高温高压处理0.5～2h。

2.如权利要求1所述的工业化制备方法，其特征在于：所述预处理中高温高压的条件参数是120～125℃，0.10～0.14Mpa，处理时间为1h。

3.如权利要求1所述的工业化制备方法，其特征在于：在预处理后，所述香菇多糖提取物由下述方法提取得到：

(1)提取：预处理后的原料进行水提，料液比m/m为1:20～100，70～100℃提取1～5h；

(2)粗滤：采用装有15～25μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集得到粗滤液；

(3)脱色：向粗滤液中加入质量百分比为0.5％～3.0％的活性炭，70～95℃脱色0.5～1h，采用装有0.3～0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，实现固液分离，收集过滤液，得到脱色滤液；

(4)膜浓缩：将脱色滤液经过装有超滤膜的膜分离装置，所用超滤膜截留分子量1000Da～10000Da，浓缩终点为固含量≥3.0％，收集浓缩液；

(5)精滤：采用装有0.3～0.5μm孔径滤纸板的板框过滤，收集过滤液，即得。

4.一种具有抗雾霾功效的护肤品添加剂，其特征在于：所述护肤品添加剂为香菇多糖提取物，所述香菇多糖提取物由权利要求1至3中任意一项所述的方法制备所得。

5.如权利要求4所述的护肤品添加剂，其特征在于：所述抗雾霾功效为香菇多糖提取物阻隔皮肤细胞吸附或吸收苯并芘的功效。

6.如权利要求4所述的护肤品添加剂，其特征在于：所述抗雾霾功效为香菇多糖提取物预防和修复苯并芘对皮肤损伤的功效。

7.如权利要求4所述的护肤品添加剂，其特征在于：所述香菇多糖提取物中香菇多糖的浓度为6～60ug/ml。

8.一种具有抗雾霾功效的护肤组合物，其特征在于：所述护肤组合物含有权利要求4所述的护肤品添加剂。

9.一种具有抗雾霾功效的护肤组合物，其特征在于：所述护肤组合物由A、B、C、D、E和F相制成，所述各相由下述重量百分比原料组成：

A相 水 余量

丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物 0.1～0.3wt％

EDTA 二钠 0.02～0.10wt％

B相 水 10.00～20.00wt％

甘油 1.00～5.00wt％

双丙甘醇 1.00～4.00wt％

黄原胶 0.05～0.10wt％

C相 甘油硬脂酸酯/PEG-100硬脂酸酯 1.00～5.00wt％

辛酸/癸酸甘油三酯 1.00～5.00wt％

甘油三(乙基己酸)酯 1.00～5.00wt％

棕榈酸乙基己酯 2.00～5.00wt％

D相 10％氢氧化钠 0.40～0.60wt％

E相 权利要求4所述的香菇多糖提取物 2.00～8.00wt％

F相 苯氧乙醇/乙基己基甘油 0.50～0.80wt％。

10.权利要求9所述的护肤组合物的制备方法，其特征在于：所述制备方法的步骤如下：

(1)B相：按所述用量将黄原胶用甘油和双丙甘醇分散，随后加入水，搅拌均匀得B相，备用；

(2)A相：按所述用量，称好A相的水，随后将丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物均匀撒在水面上，自然膨胀30～60min，待丙烯酸酯类/C10-C30烷醇丙烯酸酯交联聚合物全溶胀后再加入EDTA二钠，搅拌均匀得A相，备用；

(3)C相：按所述用量，将C相各原料混合于油相锅中，加热至80～85℃，搅拌混合均匀得C相，备用；

(4)将A相加入乳化锅中，开启搅拌，搅拌速度30～90rpm，然后加入B相，搅拌均匀，升温至80～85℃；

(5)开启乳化锅均质泵，转速为1500～3000rpm，将C相缓慢加入，保持均质10～15min；

(6)保持搅拌，降温至50～60℃，加入D相调节pH值5～7；

(7)继续搅拌降温至40～45℃，加入E相，搅拌3～5min后加入F相，搅拌10～20min；

(8)继续搅拌降温至38℃以下，出料。

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