CN111724857A - 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法 - Google Patents

一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111724857A
CN111724857A CN202010648589.1A CN202010648589A CN111724857A CN 111724857 A CN111724857 A CN 111724857A CN 202010648589 A CN202010648589 A CN 202010648589A CN 111724857 A CN111724857 A CN 111724857A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
traceability
immunoassay
interchangeability
validity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010648589.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111724857B (zh
Inventor
武利庆
胡婷婷
刘亚辉
金有训
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Metrology
Original Assignee
National Institute of Metrology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Metrology filed Critical National Institute of Metrology
Priority to CN202010648589.1A priority Critical patent/CN111724857B/zh
Publication of CN111724857A publication Critical patent/CN111724857A/zh
Priority to PCT/CN2021/082977 priority patent/WO2022007436A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111724857B publication Critical patent/CN111724857B/zh
Priority to ZA2023/01214A priority patent/ZA202301214B/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明涉及一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，包括步骤：(1)采用理化分析方法对蛋白质进行定量；(2)采用基于表面等离子共振的无标蛋白定量方法对蛋白质进行定量；(3)对理化分析方法的测量结果与无标蛋白定量方法的测量结果进行统计检验。本发明主要针对目前蛋白质免疫分析中溯源有效性评价方法缺乏、蛋白质互换性评价方法中“被测量”是否一致无法评价的问题，提供一种可以评价蛋白质在理化分析方法及免疫分析方法之间、不同蛋白质免疫分析方法之间“被测量”是否一致的方法，从而用于蛋白质免疫分析结果溯源有效性评价及蛋白质标准物质互换性的评价。

Description

一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法
技术领域
本发明涉及计量化学分析检测技术领域，特别是涉及一种蛋白质在免疫分析中溯源有效性及互换性的评价方法。
背景技术
计量是实现单位统一、量值准确可靠的活动，测量结果准确可比是依靠标准物质通过量值溯源传递实现的。根据JJF1001-2011《通用计量术语及定义》，溯源性指的是通过一条具有规定不确定度的不间断的比较链，使测量结果或测量标准的值能够与规定的参考标准，通常是与国家测量标准或国际测量标准联系起来的特性。ISO17511-2003《体外诊断医疗器械——生物样品中量的测量——校准品和控制物质赋值的计量学溯源性》将溯源分成5种情况：溯源到SI单位、溯源到国际约定的参考测量程序和国际约定的校准品、溯源到国际约定的参考测量程序但是没有国际约定的校准品、溯源到国际约定的校准品但是没有国际约定的参考测量程序、厂家自行建立的溯源途径。其中，溯源到SI单位是计量学研究追求的终极目标，ISO17511-2003中给出了溯源到SI单位的完整框架，如图1所示。由图1可见，溯源的实现是依靠标准物质，通过一级一级的传递来实现的。要保证最终分析结果的准确可比，必要条件是量值传递上下两级方法的“被测量”是同一个，才能保证溯源链的完整有效；一旦上下两级方法的“被测量”不一致，溯源链将在此“中断”，相应的溯源也是无效的。因此，要评价溯源是否有效，关键在于判断上下两级方法的“被测量”是否一致。
与溯源有效性类似的是互换性，根据JJF1001-2011《通用计量术语与定义》，“互换性”是指对于给定标准物质的规定量，由两个给定测量程序所的测量结果之间关系与另一个指定物质所的测量结果之间关系一致程度表示的标准物质的特性。互换性的核心也是两种测量方法测定的“被测量”是否一致，与溯源性不同的是，被评价的两种方法不一定是量值溯源传递链上下两级的方法，有可能是处于同一等级的两种不同的方法。
对于蛋白质的定量，常用的手段包括理化分析和免疫分析，理化分析是指通过高效液相色谱、光谱或质谱的手段对蛋白质进行定量，在分析过程中不涉及蛋白质与抗体之间的分子相互作用；免疫分析则是利用蛋白质与对应抗体之间的特异性相互作用实现定量分析，在分析过程中，蛋白质与其抗体之间的特异性相互作用对最终定量结果的准确性有重要影响。由于不同抗体识别蛋白质的表位并不一样，造成同一蛋白免疫分析时的“被测量”实际上与理化分析时的“被测量”并不相同，也会造成使用不同抗体的免疫分析时的“被测量”也不相同，从而带来溯源有效性和互换性的问题。
当前对于溯源有效性，国际国内尚未公布评价方法；互换性的评价方法主要依据NCCLS的EP14、EP31等规则进行，这些方法不能对“被测量”是否一致进行评价。因此，亟待建立一种能够对蛋白质免疫分析中的溯源有效性以及蛋白质互换性进行评价的技术手段。
发明内容
本发明针对目前蛋白质免疫分析中溯源有效性评价方法缺乏、蛋白质互换性评价方法中“被测量”是否一致无法评价的问题，提供一种可以评价蛋白质在理化分析方法及免疫分析方法之间、不同蛋白质免疫分析方法之间“被测量”是否一致的方法，从而用于蛋白质免疫分析结果溯源有效性评价及蛋白质标准物质互换性的评价。
为了完成本发明的发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，其特征在于，包括步骤：
(1)采用理化分析方法对蛋白质进行定量；
(2)采用基于表面等离子共振的无标蛋白定量方法对蛋白质进行定量；
(3)对理化分析方法的测量结果与无标蛋白定量方法的测量结果进行统计检验。
本发明的免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，主要是针对不同定量方法测定得到的蛋白质进行溯源有效性评价及蛋白质标准物质互换性的评价，其中的统计检验所采用的方法优选的是：
所述步骤(1)中蛋白质样品重复测定至少20次，取算术平均值作为理化分析结果的测量值x1，同时计算20次重复测量结果的扩展不确定度U1(k＝2)；
所述步骤(2)中蛋白免疫活性浓度重复测定至少20次，计算测定结果的平均值x2和相应的扩展不确定度U2(k＝2)；
所述步骤(3)中计算20个理化分析的测量结果与20个无标蛋白定量结果的En值进行统计检验：
Figure BDA0002574070420000021
本发明的免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，所述步骤(1)中当被评价的蛋白质是纯度≥98.5％的纯品时，通过质量平衡法、同位素稀释质谱法、定量核磁法、单分子计数法、高效液相色谱-圆二色光谱等理化分析方法中的一种或多种方法进行定量；当被评价的蛋白质是基体中的蛋白质、或蛋白质的纯度<98.5％时，按照基体中的蛋白质进行处理，通过同位素稀释质谱方法进行定量。
所述步骤(2)基于表面等离子共振的无标蛋白定量方法的具体步骤是：
a)将免疫分析中使用的抗体用pH分别为4.0、4.5、5.0和5.5的乙酸钠溶液配制成浓度为20-60μg/mL的溶液，分别通过葡聚糖修饰的金膜表面，采用表面等离子共振光谱仪测定各个pH溶液的响应值，确定合适的偶联pH；
b)选择a)中确定的pH，用该pH的乙酸钠缓冲溶液配制浓度为20-60μg/mL的抗体溶液，并用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛等偶联剂将抗体偶联到金膜表面；通过手动偶联方式，不断增加抗体溶液进行偶联，直至偶联信号响应达到饱和；偶联完成后，采用乙醇胺对残余的结合位点进行封闭；
c)将待测蛋白质稀释到0.01-10μg/mL，同时配制10-50mmol/L的NaOH溶液、0.1mol/L的磷酸、pH＝2.0的甘氨酸溶液作为待考察的再生溶液，分别用不同的再生溶液洗脱结合有蛋白质的金膜，通过SPR测定信号响应值，观察再生重复性好、洗脱完全的条件作为再生条件；
d)将待测蛋白质稀释到0.01-10μg/mL，在b)的再生条件下分别用表面等离子共振光谱仪测定高低流速下蛋白质的结合速率，计算出针对特定抗体的蛋白免疫活性浓度。
本发明的免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，还可以用于评价两种不同的蛋白质免疫分析方法的“被测量”是否一致，此时，在步骤(2)中，采用第二种免疫分析方法时用的抗体，重复步骤a)～d)的过程，计算测定结果的平均值x3和相应的扩展不确定度U3(k＝2)；计算两种不同抗体的20个无标蛋白定量结果进行统计检验：
Figure BDA0002574070420000031
本发明的免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，在得到上述En值后，可采用下述评价方式：
当En≤1时，说明结果之间没有系统误差，两种分析方法的“被测量”是一致的，蛋白质在这两种方法间具有互换性，基于这两种方法建立的溯源链是有效的；反之，说明两种分析方法识别的“被测量”是不一致的，溯源不具有有效性，标准物质在两种方法间可能不具有互换性。
本发明针对了目前蛋白质免疫分析中溯源有效性评价方法缺乏、蛋白质互换性评价方法中“被测量”是否一致无法评价的问题，提供了一种可以评价蛋白质在理化分析方法及免疫分析方法之间、不同蛋白质免疫分析方法之间“被测量”是否一致的方法，从而用于蛋白质免疫分析结果溯源有效性评价及蛋白质标准物质互换性的评价。
附图说明
图1是溯源到SI单位的完整框架；
图2是肌红蛋白氨基酸色谱离子流图；
图3是抗体预富集试验结果图抗体v50051(a),v50052(b)和Abcam19607(c)；
图4是芯片上抗体固定过程；
图5是再生试剂优化(v50051抗体)；
图6是三种抗体的结合效果图(a)v50051,(b)v50052and(c)Abcam19076。
具体实施方式
为进一步说明本发明，结合以下实施例具体说明：
本发明提供了一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，具体包括以下步骤：
1、采用理化分析方法对蛋白质进行定量。当被评价的蛋白质是纯品时(纯度≥98.5％)，通过质量平衡法、同位素稀释质谱法、定量核磁法、单分子计数法、高效液相色谱-圆二色光谱等理化分析方法中的一种或多种方法进行定量；当被评价的蛋白质是基体中的蛋白质时，或蛋白质的纯度<98.5％时，按照基体中的蛋白质进行处理，通过同位素稀释质谱方法进行定量。蛋白质样品重复测定至少20次，取算术平均值作为理化分析结果的测量值x1，同时计算20次重复测量结果的扩展不确定度U1(k＝2)。
2、采用基于表面等离子共振的无标蛋白定量方法对蛋白质进行定量。
(1)将免疫分析中使用的抗体用pH分别为4.0、4.5、5.0和5.5的乙酸钠溶液配制成浓度为(20-60)μg/mL的溶液，分别通过葡聚糖修饰的金膜表面，采用表面等离子共振光谱仪测定各个pH溶液的响应值，确定合适的偶联pH；
(2)选择(1)中确定的pH，用该pH的乙酸钠缓冲溶液配制浓度为(20-60)μg/mL的抗体溶液，并用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、戊二醛等偶联剂将抗体偶联到金膜表面。通过手动偶联方式，不断增加抗体溶液进行偶联，直至偶联信号响应达到饱和。偶联完成后，采用乙醇胺对残余的结合位点进行封闭。
(3)将待测蛋白质稀释到(0.01-10)μg/mL，同时配制(10-50)mmol/L的NaOH溶液、0.1mol/L的磷酸、pH＝2.0的甘氨酸溶液作为待考察的再生溶液，分别用不同的再生溶液洗脱结合有蛋白质的金膜，通过SPR测定信号响应值，观察再生重复性好、洗脱完全的条件作为再生条件。
(4)将待测蛋白质稀释到(0.01-10)μg/mL，在(2)的再生条件下分别用表面等离子共振光谱仪测定高低流速下蛋白质的结合速率，计算出针对特定抗体的蛋白免疫活性浓度。重复测定20次，计算测定结果的平均值x2和相应的扩展不确定度U2(k＝2)。
(5)当评价两种蛋白质免疫分析方法的“被测量”是否一致时，采用第二种免疫分析方法时用的抗体，重复(1)～(4)的过程，计算测定结果的平均值x3和相应的扩展不确定度U3(k＝2)。
3、对理化分析方法的测量结果与无标蛋白定量方法的测量结果进行统计，通过计算20个理化分析的测量结果与20个无标蛋白定量结果的En值进行统计检验，或者计算两种不同抗体的20个无标蛋白定量结果进行统计检验：
Figure BDA0002574070420000051
或
Figure BDA0002574070420000052
当En≤1时，说明结果之间没有系统误差，两种分析方法的“被测量”是一致的，蛋白质在这两种方法间具有互换性，基于这两种方法建立的溯源链是有效的；反之，说明两种分析方法识别的“被测量”是不一致的，溯源不具有有效性，标准物质在两种方法间可能不具有互换性。
利用上述评价方法对一种实际应用的实施例进行分析评价，详述如下：
实施例1：
1、采用同位素稀释质谱法对人心肌红蛋白进行定量。
同位素稀释质谱法是基于目标蛋白质的一级结构，如氨基酸或肽段，来进行蛋白质定量的经典方法，通过与CFCA法的测定值对比可以得出肌红蛋白的“活性”浓度比例。Swissprot库中人型肌红蛋白的氨基酸序列如下所示：
GLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISECIIQVLQSKHPGDFGADAQGAMNKALELFRKDMASNYKELGFQG
序列中含有5个脯氨酸、7个缬氨酸、7个苯丙氨酸。
实验过程如下：用0.1mol/LHCl溶液稀释得适合浓度的肌红蛋白溶液，并配制与其氨基酸浓度相同的同位素氨基酸混合液，两种溶液均取100μL称量加入2mL安瓿瓶中，配制八个平行样品，用离心浓缩机旋转加热至干燥后，加入500μL6mol/LHCl溶液，并通入2分钟的氮气后密封。随后在(110.0±0.5)℃的烘箱中水解24h。水解后，氮气吹干，并用0.1mol/LHCl溶液复溶，0.22μm滤膜过滤，随后上机进行仪器分析。
采用超高效液相色谱串联三重四级杆质谱对水解后的氨基酸进行分离检测。
液相及质谱条件如下：
液相条件：进样量10μL；色谱柱PhenomenexKINETEXC18(150mm×2.1mm，2.6μm)；流动相为9％乙腈+91％纯水+0.1％三氟乙酸；流速为200μL/min，时间为10min。
质谱条件：采用多反应监测(MRM)模式，离子对质荷比：脯氨酸：116->70(proline)和121->74(13C5-proline)；缬氨酸：118->72(Val)和123->76(13C5-Val)；苯丙氨酸：166->120(Phe)和174->128(13C9-Phe)。进行样品分析前，需要采用手动进样，通过EPI，Q1，Q3模式对各氨基酸母离子及子离子进行信号优化。优化后的质谱条件如下表1：
表1质谱参数设置
Figure BDA0002574070420000061
将水解后的肌红蛋白样品重复进样进行分析。
如图2所示，图2中a，b，c分别为脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸和对应的同位素标记物。
根据公式：
Figure BDA0002574070420000062
式中：msample——样品中氨基酸含量；
A1——样品与其标记混合物丰度比；
A1——标准混合物与其标记混合物丰度比；
m1/m2——标准混合物与其标记混合物的质量比；
mstd——样品对应标记混合物的质量；
由氨基酸浓度计算出对应肌红蛋白的浓度，通过IDMS测得的肌红蛋白浓度为2.851mg/mL，扩展不确定度为(2.851±0.072)mg/mL；
2、采用无标定量方法对人心肌红蛋白进行定量。
(1)本实施例采用的三种抗体分别为Abcam19607，GenScriptV50051，V50052。Abcam19607的免疫原为纯化后的人肌红蛋白，GenScriptV50051，V50052是免疫原同为人心肌红蛋白的不同克隆号抗体。
本实施例所用的CM5传感芯片是一种在50nm厚度金膜表面固定了羧甲基葡聚糖的玻璃基底芯片，经过NHS/EDC活化并催化羧甲基葡聚糖发生酯化反应后，可以与配体物质的氨基发生共价结合，将配体富集在CM5芯片上。为了保证偶联效果，配体溶液的pH通常处于芯片表面pKa(3.5)和配体等电点之间，因为芯片羧甲基化的表面在pH大于3.5时带净负电荷，此时带净正电的配体可以通过静电作用逐渐靠近芯片表面，使配体更容易与活化后的芯片结合。
10mmol/L醋酸钠溶液是较适合的低离子强度缓冲液，因此本实施例选择pH值为4.0，4.5，5.0和5.5的醋酸钠溶液进行筛选。
配体通过静电作用预富集在芯片表面，为了提高配体的偶联效率以及降低抗体的消耗量，需要对配体的缓冲液pH进行筛选。所获得的传感图如图3所示，可以看出不同抗体最优的缓冲液pH值不同，对于v50051，pH为4.0或4.5时，响应值均较高；对于v50052抗体，当pH为4.0时，得到的响应值最高，则此时抗体的偶联效率最好；对于abcam19607，pH为4.5时响应值最高，最终v50052，v50052均选择pH＝4.0，abcam19607选择pH＝4.5的缓冲液。
(2)抗体偶联实验中，三种抗体溶液均被稀释至40μg/mL。实验过程如下：采用Manual Run程序进行手动进样，流速为10μL/min，取EDC和NHS各100μL用枪头混匀，对芯片的2号通道活化12min，得到信号响应RU值，当RU值大于200时认为芯片得到充分活化。然后继续在2号通道进样抗体溶液，为了得到合适的抗体偶联水平，采用多次进样，每次进样时间为2～5min，实时计算偶联水平，最终得到合适偶联容量的芯片后，取100μL1M乙醇胺盐酸盐-NaOH溶液，进样7min，封闭芯片表面上剩余的活性羧甲基。图4示出了芯片上抗体固定过程。
(3)合适的再生条件可以有效去除与芯片表面结合的分析物。经过多次重复进样，抗体与分析物的结合水平仍可以基本保持稳定，结合水平的变化的在10％以内。
选择16mM，17mM，18mM，19mM，20mM的NaOH溶液的再生效果如图5所示，对于偶联v50051抗体的芯片，当再生溶液为20mMNaOH溶液时，在5个循环内，其结合水平逐渐降低，表明对抗体来说条件过于苛刻；当再生溶液为17～19mMNaOH溶液时，其结合水平相对稳定，但是可以看出抗体活性有所下降，不是最适合的条件；当选择16mM NaOH溶液时，结合信号和抗体活性相对稳定，从图中可以看出其重复性良好，RSD为0.48％，基线和结合水平均能保持稳定，因此16mMNaOH溶液是合适的再生溶液。偶联其他两种抗体的芯片，根据此结果进行优化，最终均选择16mMNaOH溶液为再生溶液。
(4)使用上述实验得到的最佳条件采用CFCA法对肌红蛋白进行定量。均对三个浓度水平的肌红蛋白样本进行了检测。抗体与蛋白的结合效果如图6，不同抗体与蛋白的最佳结合浓度不同，结合响应值及结合效果均有所不同，v50051抗体芯片的蛋白进样浓度约为2-10μg/mL，结合响应值最高达到600RU左右，需要采用较高的样品浓度才能获得最佳的结合效果，v50052和19607则采用0.0625～0.25μg/mL进样浓度就能取得较好的效果，二者虽然进样同样浓度的样品，其结合相应值有明显的不同，v50052抗体芯片最高相应值为100RU左右，而19607抗体芯片的最高相应值不到20RU。可以看出三种抗体与蛋白亲和力强弱不同，结合位点有所不用，导致结合效果有所差异。采用v50051，v50052和Abcam19607抗体测定的平均浓度和扩展不确定度分别为(2.98±0.28)mg/mL，(2.91±0.32)mg/mL，(3.03±0.51)mg/mL。
(5)分别计算同位素稀释质谱方法、以及三种免疫分析方法之间的En值，如表2所示。
表2同位素稀释质谱方法及免疫分析方法测量结果的En值
Figure BDA0002574070420000091
从表2可以看出，所有的En值都小于1，因此同位素稀释质谱方法和三种使用不同抗体的免疫分析方法识别的“被测量”都是一致的，采用这些方法建立的针对肌红蛋白的量值溯源传递链都是有效的，肌红蛋白在这些方法之间也具有互换性。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，其特征在于，包括步骤：
(1)采用理化分析方法对蛋白质进行定量；
(2)采用基于表面等离子共振的无标蛋白定量方法对蛋白质进行定量；
(3)对理化分析方法的测量结果与无标蛋白定量方法的测量结果进行统计检验。
2.根据权利要求1所述的免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，其特征在于，所述步骤(1)中蛋白质样品重复测定至少20次，取算术平均值作为理化分析结果的测量值x1，同时计算20次重复测量结果的扩展不确定度U1(k＝2)；
所述步骤(2)中蛋白免疫活性浓度重复测定至少20次，计算测定结果的平均值x2和相应的扩展不确定度U2(k＝2)；
所述步骤(3)中计算20个理化分析的测量结果与20个无标蛋白定量结果的En值进行统计检验：
Figure FDA0002574070410000011
3.根据权利要求1或2所述的免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，其特征在于，所述步骤(1)中当被评价的蛋白质是纯度≥98.5％的纯品时，通过质量平衡法、同位素稀释质谱法、定量核磁法、单分子计数法、高效液相色谱-圆二色光谱等理化分析方法中的一种或多种方法进行定量；当被评价的蛋白质是基体中的蛋白质、或蛋白质的纯度<98.5％时，按照基体中的蛋白质进行处理，通过同位素稀释质谱方法进行定量。
4.根据权利要求1或2所述的免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，其特征在于，所述步骤(2)基于表面等离子共振的无标蛋白定量方法的具体步骤是：
a)将免疫分析中使用的抗体用pH分别为4.0、4.5、5.0和5.5的乙酸钠溶液配制成浓度为20-60μg/mL的溶液，分别通过葡聚糖修饰的金膜表面，采用表面等离子共振光谱仪测定各个pH溶液的响应值，确定合适的偶联pH；
b)选择a)中确定的pH，用该pH的乙酸钠缓冲溶液配制浓度为20-60μg/mL的抗体溶液，并用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、N-羟基琥珀酰亚胺、或戊二醛等偶联剂将抗体偶联到金膜表面；通过手动偶联方式，不断增加抗体溶液进行偶联，直至偶联信号响应达到饱和；偶联完成后，采用乙醇胺对残余的结合位点进行封闭；
c)将待测蛋白质稀释到0.01-10μg/mL，同时配制10-50mmol/L的NaOH溶液、0.1mol/L的磷酸、pH＝2.0的甘氨酸溶液作为待考察的再生溶液，分别用不同的再生溶液洗脱结合有蛋白质的金膜，通过SPR测定信号响应值，观察再生重复性好、洗脱完全的条件作为再生条件；
d)将待测蛋白质稀释到0.01-10μg/mL，在b)的再生条件下分别用表面等离子共振光谱仪测定高低流速下蛋白质的结合速率，计算出针对特定抗体的蛋白免疫活性浓度。
5.根据权利要求4所述的免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，其特征在于，当用于评价两种蛋白质免疫分析方法的“被测量”是否一致时，采用第二种免疫分析方法时用的抗体，重复步骤a)～d)的过程，计算测定结果的平均值x3和相应的扩展不确定度U3(k＝2)；计算两种不同抗体的20个无标蛋白定量结果进行统计检验：
Figure FDA0002574070410000021
6.根据权利要求2-5任一项所述的免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法，其特征在于，当En≤1时，说明结果之间没有系统误差，两种分析方法的“被测量”是一致的，蛋白质在这两种方法间具有互换性，基于这两种方法建立的溯源链是有效的；反之，说明两种分析方法识别的“被测量”是不一致的，溯源不具有有效性，标准物质在两种方法间可能不具有互换性。
CN202010648589.1A 2020-07-07 2020-07-07 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法 Active CN111724857B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010648589.1A CN111724857B (zh) 2020-07-07 2020-07-07 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法
PCT/CN2021/082977 WO2022007436A1 (zh) 2020-07-07 2021-03-25 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法
ZA2023/01214A ZA202301214B (en) 2020-07-07 2023-01-30 Method for evaluating traceability validity and interchangeability of protein in immunoassay

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010648589.1A CN111724857B (zh) 2020-07-07 2020-07-07 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111724857A true CN111724857A (zh) 2020-09-29
CN111724857B CN111724857B (zh) 2021-06-15

Family

ID=72573850

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010648589.1A Active CN111724857B (zh) 2020-07-07 2020-07-07 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN111724857B (zh)
WO (1) WO2022007436A1 (zh)
ZA (1) ZA202301214B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022007436A1 (zh) * 2020-07-07 2022-01-13 中国计量科学研究院 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109166604A (zh) * 2018-08-22 2019-01-08 华东交通大学 一种融合多数据特征预测关键蛋白质的计算方法
CN111289425A (zh) * 2020-03-12 2020-06-16 中国计量科学研究院 基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量计量基准方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101434651B (zh) * 2008-12-11 2012-06-06 中国人民解放军第四军医大学 一种重组胸腺素β4二串体蛋白的制备方法
JP6482577B2 (ja) * 2014-12-29 2019-03-13 株式会社日立ハイテクノロジーズ 分析方法、及び分析装置
CN108333021B (zh) * 2018-02-08 2021-01-26 北京市临床检验中心 一种基于量值溯源的c反应蛋白多系统定值方法
CN109799337A (zh) * 2019-02-20 2019-05-24 广东工业大学 一种快速检测甘胆酸的表面等离子共振分析方法
CN111724857B (zh) * 2020-07-07 2021-06-15 中国计量科学研究院 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109166604A (zh) * 2018-08-22 2019-01-08 华东交通大学 一种融合多数据特征预测关键蛋白质的计算方法
CN111289425A (zh) * 2020-03-12 2020-06-16 中国计量科学研究院 基于荧光标记流式单分子计数的蛋白质含量计量基准方法

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022007436A1 (zh) * 2020-07-07 2022-01-13 中国计量科学研究院 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022007436A1 (zh) 2022-01-13
ZA202301214B (en) 2023-04-26
CN111724857B (zh) 2021-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Krone et al. BIA/MS: interfacing biomolecular interaction analysis with mass spectrometry
Safina et al. Surface plasmon resonance for real-time study of lectin–carbohydrate interactions for the differentiation and identification of glycoproteins
Nelson et al. Peer Reviewed: Biomolecular Interaction Analysis Mass Spectrometry.
CN111724857B (zh) 一种免疫分析中蛋白质溯源有效性及互换性评价方法
Ke et al. Detection of morphine in urine based on a surface plasmon resonance imaging immunoassay
Nedelkov et al. Design and use of multi‐affinity surfaces in biomolecular interaction analysis–mass spectrometry (BIA/MS): a step toward the design of SPR/MS arrays
CN112961237B (zh) 人源化IgM单克隆抗体标准物质及制备方法
Schneck et al. Current trends in magnetic particle enrichment for mass spectrometry-based analysis of cardiovascular protein biomarkers
CN111239404B (zh) 一种可以同时检测尿样本和血清样本中的视黄醇结合蛋白的检测试剂盒
KR20000048833A (ko) ｐ53에 대한 항체의 검출을 위한 검정법
US20210333290A1 (en) High speed sample workflow for lc-ms based hba1c measurement
US20210333291A1 (en) AUTOMATIC SAMPLE WORKFLOW FOR LC-MS BASED HbA1c MEASUREMENT ON INTACT PROTEIN LEVEL
CN115128272A (zh) 一种与肺癌相关的生物标志物组合、含其的试剂盒及其用途
CN110498838B (zh) 用于fpgs和ggh蛋白表达量检测的特征性肽段及其应用
Wu et al. Immunosensing system for α-fetoprotein through boronate immunoaffinity column in combination with flow injection chemiluminescence
KR20180103961A (ko) 인슐린 유사체에 대한 생물학적 분석 방법
WO2002046772A1 (en) Detection of compounds such as thyroxine
CN113004398B (zh) 人源化IgG单克隆抗体标准物质及制备方法
CN116559333B (zh) 一种外泌体表面蛋白绝对定量的方法及其应用
CN113984863B (zh) 一种基于核酸适配体生物传感器的糖化血红蛋白检测方法
CN113447654B (zh) 质谱技术检测尿液中psm-e分子水平在制备用于早期诊断前列腺癌产品中的应用
US20230305019A1 (en) Microprobe-capture in-emitter elution-electrospray ionization
AU2021295441A1 (en) New method and kit
CN115902007A (zh) 测定虾与蟹中原肌球蛋白的相色谱串联质谱法
CN114113278A (zh) 一种基于质谱的体外诊断试剂抗体的表位定位方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant