CN111718853A - 一种用于药物筛选的2d和3d一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法及应用，步骤如下：微流体芯片共两层，上层为聚二甲基硅氧烷，下层为PDMS或有机玻璃，一条截面为长方形的流道，深度为0.6‑1mm；微流体芯片中心流道宽度为‑2mm，入口及出口流道宽度为0.4‑1mm；连接中心主腔体与出入口的为蛇形结构流体通道，宽度为0.6‑1.5mm，流道间隔0.6‑1.5mm；在芯片中心流道两侧各均匀分布5‑10个亲水性和疏水性细胞培养腔体，尺寸0.6‑1.5mm；疏水侧腔体培养3D肿瘤球体，亲水侧腔体培养2D细胞；将抗肿瘤药物进行动态循环灌注，在特定时间点观察药物与细胞在芯片中的相互作用，评价药物疗效。该肿瘤器官芯片具有操作简单、成本低、稳定性高和集成度高的特点，可用于高通量抗肿瘤药物筛选。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法。
背景技术
作为严重危害人类健康的一种疾病，癌症现在依旧是世界上许多国家的主要死亡原因之一。部分原因在于肿瘤的复杂环境、开发新的抗癌药物需要高昂的成本以及体外肿瘤模型的欠缺。目前在癌症生物学和抗癌药物筛选方面的研究主要依赖于二维（2D）细胞培养和动物实验模型。二维细胞培养操作简单，成本低廉，可重复性高，但无法良好地重现肿瘤结构和整体微环境的特征。动物实验模型虽然可以提供体内肿瘤生长及药物反应的基本信息，但无法完全替代人类体内肿瘤组织的发生情况，无法对一些游离药物及纳米靶向药物颗粒的生物分布，功效和毒性影响进行动态评估，与人体具有较大种属差异，药物效果评价偏差较大，且存在伦理问题。体外三维（3D）培养系统可以营造出与体内肿瘤生长环境更相近的组织结构，包括肿瘤-基质、细胞-细胞相互作用。其中单细胞或多细胞肿瘤球体模型逐渐成为常见的体外3D肿瘤模型。
但是体外多细胞球体培养难以模拟体内的流体环境，不易仿体内梯度的理化性质。微流控芯片技术作为近年来飞速发展的一门新兴技术，依靠其尺度精确微小、材料制作工艺多样、设计灵活多变和可控性高等特点，可用于概括人体器官的结构和功能的复杂性，如肝脏，心脏，肺，肠，肾，脑和骨的微工程模型。因此，可以创建具有临床意义的体外微环境，引入动态变化的生物力学效应以在生理和病理上重现人体组织，在具有更受控的环境中进行癌症相关研究。如何在芯片上同时构建2D肿瘤细胞培养作为对照以及构建仿人体梯度的流体性质用于抗肿瘤药物筛选，仍然存在挑战。
发明内容
为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，该制备方法的工艺简单、制备成本低；该制备方法步骤清晰，支持重复制备。制备的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片可重现肿瘤微环境的特点，能够更好地应用于肿瘤组织血管腔模拟、肿瘤细胞转移和药物筛选等方面的研究。
本发明实现其发明目的所采用的技术方案是，
一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，包括以下步骤：
（A）微流体芯片流道设计：微流体芯片共有两层，上层为聚二甲基硅氧烷（PDMS），下层为PDMS或有机玻璃，芯片设有一条截面为长方形的流体通道，深度为0.6-1mm；微流体芯片中心为宽度为1-2mm的流体通道，入口及出口的流体通道宽度为0.4-1mm；
（B）微流体芯片蛇形流道设计：连接主腔体与出入口的为蛇形结构流体通道，宽度为0.6-1.5mm，流道间隔0.6-1.5mm；
（C）微流体芯片细胞培养腔体设计：在芯片中心流体通道两侧各均匀分布5-10个细胞培养腔体，尺寸为0.6-1.5mm；
（D）微流体芯片培养腔体表面处理：向微流体芯片一侧细胞培养腔体中灌注浓度为1-4%（w/v）疏水性溶液，孵育2-12h后吸出，自然风干，随后向另一侧细胞培养腔体灌注1-4%（w/v）亲水性溶液，孵育2-12h后吸出，自然风干；
（E）微流体芯片细胞种植：向（D）步制备的疏水性培养腔体中接种密度为(1-5)×106cells/mL的肿瘤细胞悬液，静态培养4-8h，待腔室内多细胞肿瘤球体培养到适宜尺寸后，向另一侧亲水性细胞培养腔体接种细胞密度为1-10×104的肿瘤细胞悬液，待细胞铺展培养腔体，即得2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片；
（F）微流体芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以0.05-5mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，分别在灌注特定时间点后观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
作为优选的，在上述用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法中：步骤（A）中所述上层聚二甲基硅氧烷的厚度为2-5mm。
作为优选的，在上述用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法中：步骤（B）所述的蛇形流体通道宽度尺寸小于出入口流道尺寸及芯片中心腔体流道尺寸。
作为优选的，在上述用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法中：所述步骤（C）步细胞培养腔体的截面为圆形或者U字型。
作为优选的，在上述用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法中：所述步骤（D）步中的疏水性溶液为PlueonicF108、牛血清表蛋白、聚四氟乙烯和聚乙烯醇中的一种，亲水性溶液为庚甲基三硅氧烷或多巴胺。
作为优选的，在上述用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法中：步骤（E）所述静态培养对于3D肿瘤球体培养时，使芯片的培养细胞腔体垂直于放置平面，而2D细胞培养时，使芯片的培养细胞腔体平行于放置平面。
作为优选的，在上述用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法中：3D多细胞肿瘤球体尺寸为0.4-0.8mm，2D细胞要铺满培养腔体底面。
作为优选的，在上述用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法中：步骤（F）所述肿瘤药物为可溶性抗癌药物和载大分子及小分子抗癌药物药纳米颗粒，灌注速度仿照人体血管流速，特定时间点为1h、2h、4h、8h或16h。
一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，包括如下步骤：
（1）以铜板为基材，使用精密数控机械加工制备芯片阳模；
（2）将芯片阳模超声清洗、干燥后，表面浇筑PDMS胶进行固化成型得到PDMS阳模；
（3）将PDMS阳模与有机玻璃或者PDMS平板进行表面等离子处理；
（4）在重物压力作用下，将（3）中两种材料进行键合和封装，即得芯片。
所述精密数控机械加工为铣削加工，数控机械的车床主轴转速为20000-30000rpm，进给速度为100-500mm/min，铣刀直径为0.2-0.6mm。
本发明的用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的使用方法是：
将制备后的肿瘤器官芯片通过UV紫外灭菌后，向其中分别接种3D和2D肿瘤细胞，利用蠕动泵动态灌注培养基进行培养，操作环境为十万级超净实验室和万级超净台，细胞培养条件为37℃，5% CO2培养箱中，经细胞生长、增殖、相关基因和蛋白表达后，最终形成3D和2D肿瘤细胞，然后动态灌注抗肿瘤药物，借助荧光染色，组织学切片和免疫组织化学评价药物的疗效，从而进行药物浓度、种类和组合形式的筛选。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明的制备方法具有易操作、重复性高和成本低等优点；
2、本发明制备的微流体器官芯片蛇形通道可以产生灌注具有梯度变化的流速分布，能够模拟体内不同血管的血液循环；
3、本发明制备的芯片，肿瘤球体生长区域剪切压力的大小呈现均匀分布特点，有利于肿瘤细胞生长条件变量的控制，减少对照实验之间的不必要差异；
4、本发明的肿瘤球体生长区域均分分布芯片中心，每侧有多个腔室，可以同时进行高通量的药物筛选和实验研究；
5、本发明可以将2D和3D培养的过程集成于同一芯片，克服了变量控制不同对于实验结果的影响，减少了未知因素的干扰，能够准确的评价药物的实际效果，具有较高的应用前景。
附图说明
图1是本发明的肿瘤芯片整体结构分布示意图，a为三维实体芯片外观，b为芯片结构透视图，1-上层PDMS芯片，2-下层PDMS或有机玻璃，3-芯片内部结构；
图2是本发明肿瘤芯片内部通道结构示意图，4-入口通道，5-蛇形通道，6-中心腔体通道，7-肿瘤细胞培养腔体，8-出口通道；
图3是本发明用于药物筛选肿瘤芯片的中间培养腔体放大示意图，9-抗肿瘤药物，10-2D肿瘤细胞，11-3D多细胞肿瘤球体。
具体实施方式
实施例1
一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，包括以下步骤：
（A）微流体芯片流道设计：微流体芯片共有两层，上层为厚度4mm聚二甲基硅氧烷（PDMS），下层为PDMS，芯片设有一条截面为长方形的流体通道，深度为0.6mm；微流体芯片中心为宽度为2mm的流体通道，入口及出口的流体通道宽度为0.4mm；
（B）微流体芯片蛇形流道设计：连接主腔体与出入口的为蛇形结构流体通道，宽度为0.8mm，流道间隔0.6mm；
（C）微流体芯片细胞培养腔体设计：在芯片中心流体通道两侧各均匀分布8个截面为圆形的细胞培养腔体，尺寸为0.6mm；
（D）微流体芯片培养腔体表面处理：向微流体芯片一侧细胞培养腔体中灌注浓度4%（w/v）PlueonicF108溶液，孵育12h后吸出，自然风干，随后向另一侧细胞培养腔体灌注4%（w/v）庚甲基三硅氧烷溶液，孵育12h后吸出，自然风干；
（E）微流体芯片细胞种植：向步骤（D）制备的疏水性培养腔体中接种密度为5×106cells/mL的肿瘤细胞悬液，静态培养4h，待腔室内多细胞肿瘤球体培养直径为0.6mm后，向另一侧亲水性细胞培养腔体接种细胞密度为1×104的肿瘤细胞悬液，待细胞铺展培养腔体，即得2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片；
（F）微流体芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以5mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，分别在灌注1h、2h、4h、8h和16h后观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
实施例2
一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，包括以下步骤：
（A）微流体芯片流道设计：微流体芯片共有两层，上层为5mm聚二甲基硅氧烷（PDMS），下层为有机玻璃，芯片设有一条截面为长方形的流体通道，深度为1mm；微流体芯片中心为宽度为1mm的流体通道，入口及出口的流体通道宽度为0.5mm；
（B）微流体芯片蛇形流道设计：连接主腔体与出入口的为蛇形结构流体通道，宽度为0.6mm，流道间隔0.8mm；
（C）微流体芯片细胞培养腔体设计：在芯片中心流体通道两侧各均匀分布10个截面为U型的细胞培养腔体，尺寸为0.8mm；
（D）微流体芯片培养腔体表面处理：向微流体芯片一侧细胞培养腔体中灌注浓度为1%（w/v）聚乙烯醇溶液，孵育4h后吸出，自然风干，随后向另一侧细胞培养腔体灌注1%（w/v）多巴胺溶液，孵育4h后吸出，自然风干；
（E）微流体芯片细胞种植：向步骤（D）制备的疏水性培养腔体中接种密度为1×106cells/mL的肿瘤细胞悬液，静态培养8h，待腔室内多细胞肿瘤球体培养到直径为0.4mm后，向另一侧亲水性细胞培养腔体接种细胞密度为1×105的肿瘤细胞悬液，待细胞铺展培养腔体，即得2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片；
（F）微流体芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以0.05mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，分别在灌注1h、2h、4h、8h和16h后观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
实施例3
一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，包括以下步骤：
（A）微流体芯片流道设计：微流体芯片共有两层，上层为2mm聚二甲基硅氧烷（PDMS），下层为PDMS，芯片设有一条截面为长方形的流体通道，深度为0.8mm；微流体芯片中心为宽度为1.5mm的流体通道，入口及出口的流体通道宽度为0.8mm；
（B）微流体芯片蛇形流道设计：连接主腔体与出入口的为蛇形结构流体通道，宽度为1.5mm，流道间隔1mm；
（C）微流体芯片细胞培养腔体设计：在芯片中心流体通道两侧各均匀分布5个截面为圆形的细胞培养腔体，尺寸为1.5mm；
（D）微流体芯片培养腔体表面处理：向微流体芯片一侧细胞培养腔体中灌注浓度为3%（w/v）牛血清表蛋白溶液，孵育2h后吸出，自然风干，随后向另一侧细胞培养腔体灌注3%（w/v）多巴胺溶液，孵育2h后吸出，自然风干；
（E）微流体芯片细胞种植：向步骤（D）制备的疏水性培养腔体中接种密度为3×106cells/mL的肿瘤细胞悬液，静态培养6h，待腔室内多细胞肿瘤球体培养到适宜尺寸后，向另一侧亲水性细胞培养腔体接种细胞密度为5×104的肿瘤细胞悬液，待细胞铺展培养腔体，即得2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片；
（F）微流体芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以1mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，分别在灌注1h、2h、4h、8h和16h后观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
实施例4
一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，包括以下步骤：
（A）微流体芯片流道设计：微流体芯片共有两层，上层为3mm聚二甲基硅氧烷（PDMS），下层为PDMS，芯片设有一条截面为长方形的流体通道，深度为0.6mm；微流体芯片中心为宽度为1.5mm的流体通道，入口及出口的流体通道宽度为0.4mm；
（B）微流体芯片蛇形流道设计：连接主腔体与出入口的为蛇形结构流体通道，宽度为1mm，流道间隔1mm；
（C）微流体芯片细胞培养腔体设计：在芯片中心流体通道两侧各均匀分布6个截面为圆形的细胞培养腔体，尺寸为1mm；
（D）微流体芯片培养腔体表面处理：向微流体芯片一侧细胞培养腔体中灌注浓度为2%（w/v）牛血清表蛋白溶液，孵育8h后吸出，自然风干，随后向另一侧细胞培养腔体灌注2%（w/v）多巴胺溶液，孵育2h后吸出，自然风干；
（E）微流体芯片细胞种植：向步骤（D）制备的疏水性培养腔体中接种密度为3×106cells/mL的肿瘤细胞悬液，静态培养6h，待腔室内多细胞肿瘤球体培养到适宜尺寸后，向另一侧亲水性细胞培养腔体接种细胞密度为3×104的肿瘤细胞悬液，待细胞铺展培养腔体，即得2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片；
（F）微流体芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以2mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，分别在灌注1h、2h、4h、8h和16h后观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
实施例5
一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，包括以下步骤：
（A）微流体芯片流道设计：微流体芯片共有两层，上层为4mm聚二甲基硅氧烷（PDMS），下层为PDMS，芯片设有一条截面为长方形的流体通道，深度为0.6mm；微流体芯片中心为宽度为1.5mm的流体通道，入口及出口的流体通道宽度为0.4mm；
（B）微流体芯片蛇形流道设计：连接主腔体与出入口的为蛇形结构流体通道，宽度为0.8mm，流道间隔0.8mm；
（C）微流体芯片细胞培养腔体设计：在芯片中心流体通道两侧各均匀分布7个截面为圆形的细胞培养腔体，尺寸为0.7mm；
（D）微流体芯片培养腔体表面处理：向微流体芯片一侧细胞培养腔体中灌注浓度为2%（w/v）聚四氟乙烯溶液，孵育6h后吸出，自然风干，随后向另一侧细胞培养腔体灌注2%（w/v）多巴胺溶液，孵育6h后吸出，自然风干；
（E）微流体芯片细胞种植：向步骤（D）制备的疏水性培养腔体中接种密度为5×106cells/mL的肿瘤细胞悬液，静态培养4h，待腔室内多细胞肿瘤球体培养到适宜尺寸后，向另一侧亲水性细胞培养腔体接种细胞密度为6×104的肿瘤细胞悬液，待细胞铺展培养腔体，即得2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片；
（F）微流体芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以0.1mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，分别在灌注1h、2h、4h、8h和16h后观察肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
Claims (10)
1.一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（A）微流体芯片流道设计：微流体芯片共有两层，上层为聚二甲基硅氧烷，下层为聚二甲基硅氧烷或有机玻璃，芯片设有一条截面为长方形的流体通道，深度为0.6-1 mm；微流体芯片中心为宽度为1-2 mm的流体通道，入口及出口的流体通道宽度为0.4-1 mm；
（B）微流体芯片蛇形流道设计：连接中心主腔体与出入口的为蛇形结构流体通道，宽度为0.6-1.5 mm，流道间隔0.6-1.5 mm；
（C）微流体芯片细胞培养腔体设计：在芯片中心流体通道两侧各均匀分布5-10个细胞培养腔体，尺寸为0.6-1.5 mm；
（D）微流体芯片培养腔体表面处理：向微流体芯片一侧细胞培养腔体中灌注浓度为1-4%的疏水性溶液，孵育2-12 h后吸出，自然风干，随后向另一侧细胞培养腔体灌注1-4%的亲水性溶液，孵育2-12 h后吸出，自然风干；
（E）微流体芯片细胞种植：向步骤（D）制备的疏水性培养腔体中接种密度为1-5×106cells/mL的肿瘤细胞悬液，静态培养4-8 h，待腔室内多细胞肿瘤球体培养到适宜尺寸后，向另一侧亲水性细胞培养腔体接种细胞密度为（1-10）×104的肿瘤细胞悬液，即得2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片；
（F）微流体芯片的抗肿瘤药物灌注：将抗肿瘤药物以0.05-5 mL/h的灌注速度进行动态循环灌注，分别在灌注特定时间点后观察3D和2D肿瘤细胞对药物的摄取含量，以及细胞的活/死情况。
2.根据权利要求1所述的一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，其特征在于：步骤（A）中所述上层聚二甲基硅氧烷的厚度为2-5mm。
3.根据权利要求1所述的一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，其特征在于：步骤（B）所述的蛇形流体通道宽度尺寸小于出入口流道尺寸及芯片中心腔体流道尺寸。
4.根据权利要求1所述的一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，其特征在于：步骤（C）所述细胞培养腔体的截面为圆形或者U字型。
5.根据权利要求1所述的一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，其特征在于：步骤（D）中所述的疏水性溶液为PlueonicF108、牛血清表蛋白、聚四氟乙烯和聚乙烯醇中的一种，亲水性溶液为庚甲基三硅氧烷或多巴胺。
6.根据权利要求1所述的一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，其特征在于：步骤（E）所述静态培养对于3D肿瘤球体培养时，使芯片的培养细胞腔体垂直于放置平面，而2D细胞培养时，使芯片的培养细胞腔体平行于放置平面。
7.根据权利要求1或6所述的一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，其特征在于：3D多细胞肿瘤球体尺寸为0.4-0.8mm，2D细胞铺满培养腔体底面。
8.根据权利要求1所述的一种用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，其特征在于：步骤（F）所述肿瘤药物为可溶性抗癌药物和载大分子及小分子抗癌药物纳米颗粒，灌注速度仿照人体血管流速，特定时间点为1h、2h、4h、8h或16h。
9.根据权利要求1-8所述的用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）以铜板为基材，使用精密数控机械加工制备芯片阳模；
（2）将芯片阳模超声清洗、干燥后，表面浇筑PDMS胶进行固化成型得到PDMS阳模；
（3）将PDMS阳模与有机玻璃或者PDMS平板进行表面等离子处理；
（4）在重物压力作用下，将（3）中两种材料进行键合和封装，即得芯片；
所述精密数控机械加工为铣削加工，数控机械的车床主轴转速为20000-30000rpm，进给速度为100-500mm/min，铣刀直径为0.2-0.6mm。
10.权利要求1所得用于药物筛选的2D和3D一体化肿瘤器官培养芯片的使用方法，其特征在于包括如下步骤：
将制备后的肿瘤器官芯片通过UV紫外灭菌后，向其中分别接种3D和2D肿瘤细胞，利用蠕动泵动态灌注培养基进行培养，操作环境为十万级超净实验室和万级超净台，细胞培养条件为37℃，5% CO2培养箱中，经细胞生长、增殖、相关基因和蛋白表达后，最终形成3D和2D肿瘤细胞，然后动态灌注抗肿瘤药物，借助荧光染色，组织学切片和免疫组织化学评价药物的疗效，从而进行药物浓度、种类和组合形式的筛选。
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