CN111705162A

CN111705162A - 一种检测新型冠状病毒2019-nCOV的RNA探针及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN111705162A
Application number: CN202010461050.5A
Authority: CN
Inventors: 谢华平; 谢缤灵; 龙胜文; 付贵芳; 曾婷; 向双林; 胡翔; 邓慧玲
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Huanyu New Material Technology Co ltd
Priority date: 2020-05-27
Filing date: 2020-05-27
Publication date: 2020-09-25
Anticipated expiration: 2040-05-27
Also published as: CN111705162B

Abstract

一种检测新型冠状病毒2019‑nCOV的RNA探针及其制备方法与应用，属于核酸杂交技术领域。为了提高新型冠状病毒检测的准确性和特异性，本发明提供了一种检测新型冠状病毒2019‑nCOV的RNA探针，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，制备过程包括：设计引物、构建重组质粒、PCR扩增、产物纯化、体外转录的过程；将制备得到的探针应用于检测2019‑nCOV中，能够在单细胞水平检测2019‑nCOV病毒核酸，提高了检测的灵敏度。

Description

一种检测新型冠状病毒2019-nCOV的RNA探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及核酸杂交技术领域，具体涉及一种检测新型冠状病毒2019-nCOV的RNA探针及其制备方法与应用。

背景技术

2019新型冠状病毒(2019-nCoV)，潜伏期长、侵染力强，主要攻击动物体的肺部，引起肺部感染。

目前鉴定新型冠状病毒有荧光定量PCR法和抗体检测方法，其中核酸检测方法为检验病毒方法的金标准，但是现有方法中仍存在诸多问题，诸如：

(1)荧光定量PCR能够鉴定疑似患者体内的核酸，该方法需要提取细胞中的RNA，随后进行反转录，然后进行PCR鉴定，在这些实验操作中RNA的损失比较多，如果疑似患者处于感染早期或者体内本身含有病毒量比较少，很容易导致RNA在提取过程中丢失，导致假阴性结果出现。

(2)由于新型冠状病毒是RNA病毒，RNA病毒变异速度快，并且该变异能够不断进行累积，荧光定量PCR实验对核酸序列要求比较高，尤其是在PCR引物覆盖的区域要求比较苛刻，如果该区域核酸发生突变，导致PCR扩增效率降低甚至不能扩增出来，从而产生假阴性结果。

(3)荧光定量PCR实验未经过测序鉴定，有可能扩增出非目的片段，出现假阳性现象，造成了检测结果的不准确。

RNA探针是指带有标记的能与组织内相对应的核苷酸序列互补结合的一段单链cDNA或 cRNA分子，其是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高，可以检测到单个细胞中是否含有目的RNA，因此，可以有效检测出待测目的片段。

因此，如何提供一种可以有效检测2019-nCoV的探针，并将其应用于检测2019-nCoV中是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

为了提高新型冠状病毒检测的准确性和特异性，本发明提供了一种检测新型冠状病毒 2019-nCOV的RNA探针，所述RNA探针核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了上述RNA探针的制备方法，步骤如下：

1)引物设计：根据2019-nCOV待测区域碱基序列设计上游引物和下游引物，所述下游引物的5’端含有T7 RNA聚合酶启动子序列；

2)构建重组质粒：将所述2019-nCOV待测区域的碱基序列插入至克隆载体中，得到带有2019-nCOV待测区域碱基序列的质粒；

3)PCR扩增：利用步骤1)所述的上游引物和下游引物扩增步骤2)得到的质粒，得到2019-nCOV待测区DNA；

4)体外转录：以所述2019-nCOV待测区DNA为模板进行体外转录，合成带有地高辛标记的反义RNA探针。

在本发明的一个实施例中，步骤1)所述上游引物为COVID-19-F1，序列如SEQ IDNO.2 所示，所述下游引物为COVID-19-R2，序列如SEQ ID NO.4所示；所述2019-nCOV待测区域碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

在本发明的一个实施例中，步骤2)所述克隆载体为pGEM-T Easy载体。

在本发明的一个实施例中，步骤2)所述2019-nCOV待测区域经PCR扩增后，利用T-A克隆的方法插入到克隆载体中；PCR扩增所用的上游引物为COVID-19-F1，序列如SEQ IDNO.2所示，下游引物为COVID-19-R1，序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了上述RNA探针在制备检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒或试剂中的应用。

本发明还提供了一种非诊断目的的检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，步骤如下：

(1)杂交预处理：取待测样本进行预处理；

(2)预杂交：向预处理后的样本中滴加预杂交液，进行孵育；

(3)杂交：将预杂交液吸干，向待测样本中滴加上述制备的RNA探针，进行孵育；

(4)杂交后处理：将孵育后的RNA探针回收，依次以50％甲酰胺/2×SSCT缓冲液、2×SSCT 缓冲液和0.2×SSCT缓冲液漂洗待测样本；再向样本中加入阻断溶液，室温孵育；最后，加入用阻断溶液3000倍稀释的地高辛抗体，得到杂交样本；

(5)显色、照相：将杂交样本加入到含有终体积分数为1％的羔羊血清的MABT溶液中，清洗后再以MABT清洗，然后以检测缓冲液清洗；最后向其中加入AP底物染色缓冲液进行室温孵育，包裹避光，当待测样本着色出现后，用PBS清洗，显微镜观察，照相。

在本发明的一个实施例中，步骤1)所述杂交预处理是指将待测样品经蛋白酶K消化后，经PBST溶液漂洗后经多聚甲醛固定，再用PBST溶液漂洗。

在本发明的一个实施例中，步骤2)所述预杂交液包括：50％甲酰胺、5×SSCT、50ug/mL 肝素、5mM EDTA，PH8.0、50ug/mL核糖体RNA、1.84％V/V 1M柠檬酸和0.1％V/VTween。

在本发明的一个实施例中，步骤5)所述检测缓冲液，每50mL溶液中含有100mMNaCl、 50mM MgCl₂、100mM三羟甲基氨基甲烷、0.1％V/V Tween-20和1mM左旋咪唑；所述AP底物染色缓冲液，每1mL由3.5uL NBT、3.5uL BCIP、4uL左旋咪唑和水配制而成。

有益效果

1.已有的报道中，2019-nCOV含有多种突变，并且变异还在不停的加速积累中，本发明开发了可以特异性与2019-nCOV杂交的RNA探针，该探针的长度为813bp，即使在目标序列中有1个甚至多个核酸发生突变，也可以与RNA的大部分碱基序列杂交，不会影响整体的杂交效果，因此该探针可以有效避免由于RNA病毒快速变异导致荧光定量PCR检测产生假阴性结果越来越多的问题,提高了检测结果的准确性。

2.关于RNA探针的制备，在传统探针合成过程中，要对重组质粒进行酶切线性化，再纯化回收后进行大量扩增。本发明对构建的重组质粒pGEMT(easy)-COVID-19-2直接进行PCR扩增，从而得到大量目的片段，与传统技术相比，省去了细菌培养、质粒提取及鉴定、酶切线性化的过程，最大程度的节约了时间成本。并且通过PCR扩增得到目的基因，其技术成熟、不易出错、产量高、快速且高效。

3.本发明利用原位杂交技术对待测样本检测，无需提取细胞中的RNA，只需提取患者组织或血液，直接对其进行检测，所需样本小无需提取细胞中的RNA，避免了RNA的损失，可以有效避免荧光定量PCR检测中RNA损失而导致假阴性结果的问题。灵敏度高，提高了检测结果的准确性。

附图说明

图1为pGEMT(easy)-COVID-19-2重组质粒、pGEMT(easy)载体和病毒基因片段的电泳图，其中，1为重组质粒，2为pGEMT(easy)载体和病毒基因片段，M为marker；

图2为重组质粒pGEMT(easy)-COVID-19-2酶切位点图；

图3为以pGEMT(easy)-COVID-19-2为模板，以COVID-19-F1和COVID-19-R2为引物进行扩增的产物的电泳图；1为扩增产物，M为marker；

图4为以pGEMT(easy)-COVID-19-2为模板，以COVID-19-F1和COVID-19-R2为引物进行PCR扩增后，胶回收纯化后电泳图；1为胶回收产物，M为marker；

图5为反义RNA探针的电泳图；1为扩增产物，M为marker；

图6为重组质粒pCDNA3.1 myc His A-COVID-19酶切位点图；

图7为重组质粒pCDNA3.1 myc His A-COVID-19重组质粒、pCDNA3.1 myc His A载体和病毒基因片段的电泳图，其中，1为重组质粒，2为pCDNA3.1 myc His A载体和病毒基因片段，M为marker；

图8为RNA探针检测结果图；左图为对照组，细胞转染pCDNA3.1 myc HisA空载体质粒4小时后原位杂交结果，右图为细胞转染pCDNA3.1 myc His A-COVID-19质粒4小时后原位杂交结果。

具体实施方式

缩写及定义或成分：

HYB：预杂交液，50％甲酰胺；5×SSCT；50ug/mL肝素；5mM EDTA；0.05mg/mL核糖体RNA；920uL 1M柠檬酸(citric acid)；0.1％Tween。

MABT：顺丁烯二酸(马来酸)100mM；NaCl 150mM；pH至7.4。

EDTA：乙二胺四乙酸。

PBST溶液：磷酸盐吐温缓冲液，在PBS溶液基础上加上Tween-20。

NBT：氯化硝基四氮唑蓝。

BCIP：5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐。

Tween：吐温，本领域常用的一种表面活性剂。

阻断溶液：1％羊血清，2％阻断剂，溶解于MABT中。

50％甲酰胺/2×SSCT缓冲液：50％甲酰胺，0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween20。

2×SSCT缓冲液：0.3M NaCl，0.03M柠檬酸钠和0.1％Tween20，溶解于dH₂O中，调节pH为7.0。

5×SSCT缓冲液：0.75M NaCl；0.075M柠檬酸钠，溶解到dH₂O，调节pH为7.0。

0.2×SSCT缓冲液：0.03M NaCl，0.003M柠檬酸钠和0.1％Tween20，溶解于dH₂O中，调节pH为7.0。

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中所使用的其他试剂或克隆载体等材料如无特殊说明，均为本领域常用试剂，可通过商业化途径购买获得。

实施例1.检测2019-nCOV的RNA探针的制备方法。

步骤如下：

1)设计引物：根据2019-nCOV待测区域碱基序列，并利用Premier 5.0软件以及NCBI 的BLAST分析设计引物，得到引物COVID-19-F1和COVID-19-R1；

COVID-19-F1：TTGTATTGACTGTAGTGCGCG，如SEQ ID NO.2所示；

COVID-19-R1：ATAGAGCCATCCATGAGCACA，如SEQ ID NO.3所示；

在COVID-19-R1引物的5’端，添加T7 RNA聚合酶启动子，得到引物COVID-19-R2；

COVID-19-R2：GCGTAATACGACTCACTATAGGGATAGAGCCATCCATGAGCACA，如SEQ IDNO.4所示；其中TAATACGACTCACTATA为T7 RNA聚合酶启动子序列。

所述2019-nCOV待测区域碱基序列为(序列由基因公司合成)：

TTGTATTGACTGTAGTGCGCGTCATATTAATGCGCAGGTAGCAAAAAGTCACAACA TTGCTTTGATATGGAACGTTAAAGATTTCATGTCATTGTCTGAACAACTACGAAAAC AAATACGTAGTGCTGCTAAAAAGAATAACTTACCTTTTAAGTTGACATGTGCAACTA CTAGACAAGTTGTTAATGTTGTAACAACAAAGATAGCACTTAAGGGTGGTAAAATTG TTAATAATTGGTTGAAGCAGTTAATTAAAGTTACACTTGTGTTCCTTTTTGTTGCTGCT ATTTTCTATTTAATAACACCTGTTCATGTCATGTCTAAACATACTGACTTTTCAAGTGA AATCATAGGATACAAGGCTATTGATGGTGGTGTCACTCGTGACATAGCATCTACAGAT ACTTGTTTTGCTAACAAACATGCTGATTTTGACACATGGTTTAGCCAGCGTGGTGGT AGTTATACTAATGACAAAGCTTGCCCATTGATTGCTGCAGTCATAACAAGAGAAGTGGGTTTTGTCGTGCCTGGTTTGCCTGGCACGATATTACGCACAACTAATGGTGACTTTT TGCATTTCTTACCTAGAGTTTTTAGTGCAGTTGGTAACATCTGTTACACACCATCAAA ACTTATAGAGTACACTGACTTTGCAACATCAGCTTGTGTTTTGGCTGCTGAATGTACA ATTTTTAAAGATGCTTCTGGTAAGCCAGTACCATATTGTTATGATACCAATGTACTAGA AGGTTCTGTTGCTTATGAAAGTTTACGCCCTGACACACGTTATGTGCTCATGGATG GCTCTAT，如SEQ ID NO.5所示，加粗碱基为引物序列。

2)构建重组质粒pGEMT(easy)-COVID-19-2：将所述2019-nCOV待测区域经 COVID-19-F1和COVID-19-R1进行PCR扩增(对应于载体图中序列2)后，回收PCR产物，利用T-A克隆的方法(参照产品试剂盒说明书)插入到至克隆载体pGEM-T Easy载体上，得到重组质粒pGEMT(easy)-COVID-19-2，对重组质粒pGEMT(easy)-COVID-19-2进行酶切，酶切结果如图1所示，泳道1为重组质粒电泳图；泳道2为MdeⅠ和SphⅠ双酶切结果图，载体使用pGEM-T Easy，pGEM-T Easy的片段大小在3000bp左右，外源片段大小在800bp左右，重组质粒总长如图1所示为3828bp；回收酶切产物，对其进行测序，结果表明重组质粒构建成功。

3)PCR扩增：利用步骤1)所述的上游引物COVID-19-F1和下游引物COVID-19-R2扩增步骤2)得到的质粒pGEMT(easy)-COVID-19-2，得到2019-nCOV待测区DNA。具体方法如下：

PCR扩增的反应体系为：

PCR扩增的反应程序为：

以pGEMT(easy)-COVID-19-2为模板，以COVID-19-F1和COVID-19-R2按照上述体系和程序对其进行扩增，并将扩增产物进行2％琼脂糖电泳，结果如图3所示，参照DNA marker切取位置回收纯化扩增产物，参照DNA marker切取位置在凝胶产物上820bp处的条带，即为所需目的产物条带；将切取的目的产物条带，用胶回收试剂盒进行回收，得到纯化的PCR 扩增产物，对其进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图4所示，并测量其浓度(30ng/μL)，得到DNA 模板；

4)体外转录：利用上述DNA模板进行体外转录，合成带有地高辛标记的反义RNA探针；所述体外转录的体系为：

转录过程为：

1)将所述体外转录体系加入到1.5mL EP管中，混匀后，于37℃水浴2h；

2)水浴结束后，加入DNase消化15min，然后以琼脂糖电泳检测，如图5所示，由于图中使用的为DNA marker，DNA为双链，由于RNA为单链结构，在部分U碱基中掺入地高辛标记物，所以电泳结果中RNA大小仅为其大小的一半多一点；

3)用RNeasy Mini kit试剂盒纯化转录成功的RNA，最终得到带有地高辛标记的反义RNA 探针，保存于-80℃环境中，所述反义RNA探针核苷酸序列为：

AUAGAGCCAUCCAUGAGCACAUAACGUGUGUCAGGGCGUAAACUUUCAUAAGCAAC AGAACCUUCUAGUACAUUGGUAUCAUAACAAUAUGGUACUGGCUUACCAGAAGCAU CUUUAAAAAUUGUACAUUCAGCAGCCAAAACACAAGCUGAUGUUGCAAAGUCAGUG UACUCUAUAAGUUUUGAUGGUGUGUAACAGAUGUUACCAACUGCACUAAAAACUCU AGGUAAGAAAUGCAAAAAGUCACCAUUAGUUGUGCGUAAUAUCGUGCCAGGCAAAC CAGGCACGACAAAACCCACUUCUCUUGUUAUGACUGCAGCAAUCAAUGGGCAAGCU UUGUCAUUAGUAUAACUACCACCACGCUGGCUAAACCAUGUGUCAAAAUCAGCAUG UUUGUUAGCAAAACAAGUAUCUGUAGAUGCUAUGUCACGAGUGACACCACCAUCAA UAGCCUUGUAUCCUAUGAUUUCACUUGAAAAGUCAGUAUGUUUAGACAUGACAUGA ACAGGUGUUAUUAAAUAGAAAAUAGCAGCAACAAAAAGGAACACAAGUGUAACUUU AAUUAACUGCUUCAACCAAUUAUUAACAAUUUUACCACCCUUAAGUGCUAUCUUUG UUGUUACAACAUUAACAACUUGUCUAGUAGUUGCACAUGUCAACUUAAAAGGUAAG UUAUUCUUUUUAGCAGCACUACGUAUUUGUUUUCGUAGUUGUUCAGACAAUGACAU GAAAUCUUUAACGUUCCAUAUCAAAGCAAUGUUGUGACUUUUUGCUACCUGCGCAU UAAUAUGACGCGCACUACAGUCAAUACAA(如SEQ ID NO.1所示)。

实施列2.利用实施例1制备的反义RNA探针检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法。

为了展示本发明所述的反义RNA探针检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，本实施例首先制备了携带新型冠状病毒2019-nCoV病毒部分核酸序列的待测样本，然后利用所述的反义RNA探针进行检测，具体方法如下：

一、过表达载体(pCMV myc His 3.1A-2019-nCOV质粒)的构建。

1)设计引物：根据上述的2019-nCOV待测区域的碱基序列(SEQ ID NO.5所示)设计引物，得到引物COVID-19-F2和COVID-19-R3；

COVID-19-F2：

TCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCATGGCTTGTATTGACTGTAGTGCGCGTCATATTA，如SEQ IDNO.6所示；

COVID-19-R3：

GAGATGAGTTTTTGTTCGAAGGGCCCGGTAGAGCCATCCATGAGCACATAACGTG，如 SEQ IDNO.7所示；

2)构建重组质粒pCDNA3.1 myc His A-COVID-19：将2019-nCOV待测区域碱基序列进行PCR扩增，所用引物为COVID-19-F2 COVID-19-R3，得到的PCR产物(对应载体图中序列3)以及原有的pCDNA3.1 myc His A载体进行EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切，酶切方法参照产品说明书进行，利用T-A克隆技术，将所述2019-nCOV的待测区域碱基序列连接到pCDNA3.1 mycHis A载体上，得到如图6所示重组质粒pCDNA3.1 myc His A-COVID-19，对重组质粒pCDNA3.1 myc His A-COVID-19进行酶切及测序验证，酶切结果如图7所示，其中泳道1为重组质粒电泳图，泳道2为EcoRⅠ和ApaⅠ双酶切结果图，载体使用pCDNA3.1 myc His A，pCDNA3.1 myc His A片段大小为5500bp左右，外源片段大小在800bp左右，重组质粒如图7所示为6274bp，回收酶切产物，对其进行测序，结果表明重组载体构建成功；

二、Hek293细胞的复苏和传代。

1.Hek293细胞(商业化购买的人胚胎肾细胞293)的复苏：

(1)从液氮中取出冻存的Hek293细胞，放入37℃恒温水浴锅中解冻1min，并不停摇晃冻存管；

(2)将融化的细胞悬液移入预热好的新鲜DMEM完全培养液中，轻轻吹打2次；

(3)1000rpm离心3min，弃上清；

(4)加入5ml新鲜DMEM完全培养基，并移入新的培养瓶，放入37℃，5％CO₂的培养箱中培养；

(5)24小时后更换新的培养液，继续传代。

2.Hek293细胞的传代：

(1)当细胞生长汇合度达到95％～100％时，吸去旧的培养基，加入PBS洗一次；

(2)加入胰蛋白酶，消化30s，并吸去；

(3)加入预热的新鲜DMEM终止消化，反复吹打至其为单细胞悬液；

(4)取培养瓶，加入3ml新鲜DMEM培养基，再加入1ml细胞悬液，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

三、用pCDNA3.1 myc His A-COVID-19质粒转染Hek293细胞。

1)取对数生长期的Hek293细胞，用胰蛋白酶消化后，加入无双抗的DMEM培养基稀释细胞，并移入24孔板中，每孔1ml，培养24h后，更换新的培养基；

2)按照Lipofectamine 2000Reagent试剂盒进行转染，取两支1.5ml的离心管，分别加入 250μL Opti-MEM培养基，其中一支再加入pCDNA3.1 myc His A-COVID-19质粒(2～4μg)；另一支加入6μL Lipofectamine 2000室温孵育5min；

3)将上述两支离心管进行混合，室温孵育20min，得到质粒-脂质体混合物，再加入1ml 无双抗的DMEM培养基；

4)将上述混合液滴入24孔板中，混匀，于37℃，5％CO₂的培养箱中培养。

四、检测。

1.杂交预处理：

(1)将培养好的Hek293细胞中滴加200ul蛋白酶K(10ng/μL)，于37℃孵育30min；

(2)用DEPC水配制的PBST溶液漂洗3次，每次5min；

(3)用DEPC水配制的4％多聚甲醛固定20min；

(4)用DEPC水配制的PBST溶液漂洗3次，每次5min；

2.预杂交：

在1×10⁵个Hek293细胞中滴加200μL预杂交液(50％甲酰胺；2×SSCT；50ug/mL肝素； 5mM EDTA,PH8.0；50ug/mL核糖体RNA；1.84％V/V 1M柠檬酸(citric acid)；0.1％Tween。)，将24孔培养皿放入68℃水浴锅中水浴60min。

3.杂交：

吸掉预杂交液，滴加200μL杂交液(含有2ng/uL实施例1制备的地高辛标记物的反义 RNA的预杂交液)，将24孔培养皿放入68℃水浴锅中孵育过夜。

4.杂交后处理：

(1)吸出杂交液，加入200ul 68℃预热的50％甲酰胺/2×SSCT缓冲液中洗2次，每次 30min；

(2)68℃预热的2×SSCT缓冲液中洗1次，30min；

(3)68℃预热的0.2×SSCT缓冲液中洗2次，每次30min；

(4)吸出液体，滴加阻断溶液，室温孵育60min。

(5)加入新用阻断溶液3000倍稀释的地高辛抗体(Anti-Digoxigenin-AP,Fabfragments)， 4℃过夜。

5.显色、照相：

(1)加入到1％热处理羔羊血清(heat treated lamb serum)的MABT溶液中，室温洗25min；

(2)MABT洗3次，每次25min；

(3)检测缓冲液(每50mL溶液：100mM NaCl(1mL 5M)；50mM MgCl2(2.5mL 1M)；100mM 三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCl(5mL 1M，pH9.5)；0.1％Tween-20；1mM左旋咪唑(50uL1M)) 洗2次，每次5min；

(4)加入200uL AP底物染色缓冲液(每1mL检测缓冲液加入：4.5uL NBT,3.5uLBCIP 又称X-磷酸盐,加入4uL左旋咪唑)，室温温育，金属箔片包裹避光；

(5)当目标着色出现后，用PBS洗2次，每次5min，以停止反应；

(6)显微镜观察、照相。

6.结果

如图8，其中左图为转染了pCNDA3.1myc His A空载体质粒的对照，没有信号，只有非常弱的背景；右图为细胞转染4小时后原位杂交结果，有颜色的均为阳性信号，颜色深说明 RNA拷贝数多，信号浅说明RNA拷贝数少，即使很少的RNA拷贝数也能够检测出来。无色为阴性信号。两张图片均为40×放大，可见，本发明能够在单细胞水平检测2019-nCOV病毒核酸，提高了检测的灵敏度。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南师范大学

<120> 一种检测新型冠状病毒2019-nCOV的RNA探针及其制备方法与应用

<130>

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 813

<212> RNA

<213> RNA探针

<400> 1

auagagccau ccaugagcac auaacgugug ucagggcgua aacuuucaua agcaacagaa 60

ccuucuagua cauugguauc auaacaauau gguacuggcu uaccagaagc aucuuuaaaa 120

auuguacauu cagcagccaa aacacaagcu gauguugcaa agucagugua cucuauaagu 180

uuugauggug uguaacagau guuaccaacu gcacuaaaaa cucuagguaa gaaaugcaaa 240

aagucaccau uaguugugcg uaauaucgug ccaggcaaac caggcacgac aaaacccacu 300

ucucuuguua ugacugcagc aaucaauggg caagcuuugu cauuaguaua acuaccacca 360

cgcuggcuaa accauguguc aaaaucagca uguuuguuag caaaacaagu aucuguagau 420

gcuaugucac gagugacacc accaucaaua gccuuguauc cuaugauuuc acuugaaaag 480

ucaguauguu uagacaugac augaacaggu guuauuaaau agaaaauagc agcaacaaaa 540

aggaacacaa guguaacuuu aauuaacugc uucaaccaau uauuaacaau uuuaccaccc 600

uuaagugcua ucuuuguugu uacaacauua acaacuuguc uaguaguugc acaugucaac 660

uuaaaaggua aguuauucuu uuuagcagca cuacguauuu guuuucguag uuguucagac 720

aaugacauga aaucuuuaac guuccauauc aaagcaaugu ugugacuuuu ugcuaccugc 780

gcauuaauau gacgcgcacu acagucaaua caa 813

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> COVID-19-F1

<400> 2

ttgtattgac tgtagtgcgc g 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> COVID-19-R1

<400> 3

atagagccat ccatgagcac a 21

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> COVID-19-R2

<400> 4

gcgtaatacg actcactata gggatagagc catccatgag caca 44

<210> 5

<211> 813

<212> DNA

<213> 2019-nCOV待测区域

<400> 5

ttgtattgac tgtagtgcgc gtcatattaa tgcgcaggta gcaaaaagtc acaacattgc 60

tttgatatgg aacgttaaag atttcatgtc attgtctgaa caactacgaa aacaaatacg 120

tagtgctgct aaaaagaata acttaccttt taagttgaca tgtgcaacta ctagacaagt 180

tgttaatgtt gtaacaacaa agatagcact taagggtggt aaaattgtta ataattggtt 240

gaagcagtta attaaagtta cacttgtgtt cctttttgtt gctgctattt tctatttaat 300

aacacctgtt catgtcatgt ctaaacatac tgacttttca agtgaaatca taggatacaa 360

ggctattgat ggtggtgtca ctcgtgacat agcatctaca gatacttgtt ttgctaacaa 420

acatgctgat tttgacacat ggtttagcca gcgtggtggt agttatacta atgacaaagc 480

ttgcccattg attgctgcag tcataacaag agaagtgggt tttgtcgtgc ctggtttgcc 540

tggcacgata ttacgcacaa ctaatggtga ctttttgcat ttcttaccta gagtttttag 600

tgcagttggt aacatctgtt acacaccatc aaaacttata gagtacactg actttgcaac 660

atcagcttgt gttttggctg ctgaatgtac aatttttaaa gatgcttctg gtaagccagt 720

accatattgt tatgatacca atgtactaga aggttctgtt gcttatgaaa gtttacgccc 780

tgacacacgt tatgtgctca tggatggctc tat 813

<210> 6

<211> 60

<212> DNA

<213> COVID-19-F2

<400> 6

tccactagtc cagtgtggtg gaattcatgg cttgtattga ctgtagtgcg cgtcatatta 60

<210> 7

<211> 55

<212> DNA

<213> COVID-19-R3

<400> 7

gagatgagtt tttgttcgaa gggcccggta gagccatcca tgagcacata acgtg 55

Claims

1.一种检测新型冠状病毒2019-nCOV的RNA探针，其特征在于，所述RNA探针核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述的RNA探针的制备方法，其特征在于，步骤如下：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)所述上游引物为COVID-19-F1，序列如SEQ ID NO.2所示，所述下游引物为COVID-19-R2，序列如SEQ ID NO.4所示；所述2019-nCOV待测区域碱基序列如SEQ ID NO.5所示。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述克隆载体为pGEM-T Easy载体。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述2019-nCOV待测区域经PCR扩增后，利用T-A克隆的方法插入到克隆载体中；PCR扩增所用的上游引物为COVID-19-F1，序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物为COVID-19-R1，序列如SEQ ID NO.3所示。

6.权利要求1所述的RNA探针在制备检测新型冠状病毒2019-nCoV的试剂盒或试剂中的应用。

7.一种非诊断目的的检测新型冠状病毒2019-nCoV的方法，其特征在于，步骤如下：

(1)杂交预处理：取待测样本进行预处理；

(2)预杂交：向预处理后的样本中滴加预杂交液，进行孵育；

(3)杂交：将预杂交液吸干，向待测样本中滴加权利要求1所述的RNA探针，进行孵育；

(4)杂交后处理：将孵育后的RNA探针回收，依次以50％甲酰胺/2×SSCT缓冲液、2×SSCT缓冲液和0.2×SSCT缓冲液漂洗待测样本；再向样本中加入阻断溶液，室温孵育；最后，加入用阻断溶液3000倍稀释的地高辛抗体，得到杂交样本；

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤1)所述杂交预处理是指将待测样品经蛋白酶K消化后，经PBST溶液漂洗后经多聚甲醛固定，再用PBST溶液漂洗。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤2)所述预杂交液包括：50％甲酰胺、5×SSCT、50ug/mL肝素、5mM EDTA，PH8.0、50ug/mL核糖体RNA、1.84％V/V 1M柠檬酸和0.1％V/V Tween。

10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤5)所述检测缓冲液，每50mL溶液中含有100mM NaCl、50mM MgCl₂、100mM三羟甲基氨基甲烷、0.1％V/V Tween-20和1mM左旋咪唑；所述AP底物染色缓冲液，每1mL由3.5uL NBT、3.5uL BCIP、4uL左旋咪唑和水配制而成。