CN111699011A - 注入器 - Google Patents

Abstract

本发明的课题在于提供以高效率向大范围的注入对象的细胞核内直接注入包含生物分子的溶液的注入器，该课题可以通过以下注入器来解决，所述注入器是不进行在注入对象内插入有给定的结构物的状态下的经由上述给定的结构物的注入、而从注入器主体向所述注入对象注入包含生物分子的溶液的注入器，所述注入器具备：容纳包含生物分子的溶液的容纳部、以及具有使通过点火装置中的点火药的燃烧而被加压了的所述包含生物分子的溶液流过并向所述注入对象射出的射出口的喷嘴部，在从所述包含生物分子的溶液的射出开始时刻起至0.20毫秒时刻之间，所述包含生物分子的溶液的最大射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下，并以所述包含生物分子的溶液的射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下持续0.11毫秒以上。

Description

注入器

技术领域

本发明涉及注入器。具体而言，本发明涉及注入器、使用了该注入器向注入对象的细胞核内注入包含生物分子的溶液的方法、以及在注入对象中使基因表达的方法。

背景技术

作为向生物体等注入药液的注入器，除了借助注射针进行注射的有针注射器、不借助注射针进行注射的无针注射器以外，还存在为了将药液输送至注入对象而具备注射针、驱动源的导液管等。

其中，无针注射器有时采用利用加压气体、弹簧、电磁力对容纳有注射液的容纳室施加压力而将注射成分射出的构成。例如，已采用在注射器主体的内部形成有多个喷嘴孔、并且与各喷嘴孔相对应地配置有在射出时被驱动的活塞的构成(专利文献1)。通过该构成，能够使注射液从多个喷嘴孔同时喷射从而实现向对象的均匀注射。进而，将包含荧光素酶基因的质粒注射于大鼠，实现了高效的细胞移入。

另外，作为无针注射器中的注射液的射出动力源，包括利用加压气体的形式。例如，已示例出了在射出初期瞬间地进行大的加压之后花费40～50毫秒使加压力逐渐降低的加压方式(专利文献2)。

但是，还没有关于可以利用注入器以高效率向大范围的注入对象的细胞核内直接注入包含生物分子的溶液的报道。并且，也没有着眼于从注入器射出包含生物分子的溶液的条件的报道，而从注入器射出包含生物分子的溶液的条件，对于实现以高效率向大范围的注入对象的细胞核内直接注入包含生物分子的溶液而言是必要的。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2004-358234号公报

专利文献2：美国专利申请公开第2005/0010168号说明书

发明内容

发明要解决的课题

本发明是在这样的背景下完成的，课题在于提供以高效率向大范围的注入对象的细胞核内直接注入包含生物分子的溶液的注入器。

解决课题的方法

本发明人等对于使用基于点火药的点火装置且容纳有包含生物分子的溶液的注入器，着眼于从该注入器射出的包含生物分子的溶液从射出开始时刻起至给定时间内的该包含生物分子的溶液的射出速度进行了深入研究，结果发现，下述的注入器可以解决上述课题，进而完成了本发明。本发明如下所示。

[1]一种注入器，其是不进行在注入对象内插入有给定的结构物的状态下的经由上述给定的结构物的注入、而从注入器主体向上述注入对象注入包含生物分子的溶液的注入器，该注入器具备：容纳包含生物分子的溶液的容纳部、以及具有使通过点火装置中的点火药的燃烧而被加压了的上述包含生物分子的溶液流过并向上述注入对象射出的射出口的喷嘴部，在从上述包含生物分子的溶液的射出开始时刻起至0.20毫秒时刻之间，上述包含生物分子的溶液的最大射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下，并以上述包含生物分子的溶液的射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下持续0.11毫秒以上。

[2]使用[1]所述的注入器向注入对象的细胞核内注入包含生物分子的溶液的方法。

[3]在注入对象中使基因表达的方法，该方法包括：使用[1]所述的注入器向注入对象的细胞核内注入包含DNA的溶液的工序，所述DNA包含基因。

发明的效果

根据本发明，可以提供以高效率向大范围的注入对象的细胞核内直接注入包含生物分子的溶液的注入器。

另外，本发明可以提供使用上述注入器以高效率向大范围的注入对象的细胞核内直接注入包含生物分子的溶液的方法、以及使用上述注入器在大范围的注入对象中以高效率使基因表达的方法。

附图说明

图1是示出本发明的第一发明的一个实施方式中的注入器的示意结构的图。

图2是示出本发明的第一发明的一个实施方式中，所填充的水的射出速度随时间经过的坐标图。

图3是示出本发明的第二发明的一个实施方式中，导入至哺乳动物个体(生物体)内的细胞核和哺乳动物个体(生物体)内的DNA的分布的图(代替附图的照片)。

图4是示出在本发明的第三发明的一个实施方式中，向大鼠给药包含荧光素酶基因的质粒DNA溶液后的、用外侧样品的发光强度(RLU)除以中心样品的发光强度(RLU)并以百分率表示的数值的坐标图。

符号说明

1····注射器

2····外壳

3····针筒部

4····柱塞

5····活塞

6····注射器主体

7····驱动部

8····按钮

9····电池

10····注射器装配体

31····喷嘴部

31a····射出口

32····填充室

71····点火器

具体实施方式

本发明包括：注入器的发明(第一发明)、使用上述注入器向注入对象的细胞核内注入包含生物分子的溶液的方法的发明(第二发明)、以及使用上述注入器在注入对象中使基因表达的方法的发明(第三发明)。

＜第一发明＞

本发明的第一发明是一种注入器，其是不进行在注入对象内插入有给定的结构物的状态下的经由上述给定的结构物的注入、而从注入器主体向上述注入对象注入包含生物分子的溶液的注入器，所述注入器具备：容纳包含生物分子的溶液的容纳部、以及具有使通过点火装置中的点火药的燃烧而被加压了的上述包含生物分子的溶液流过并向上述注入对象射出的射出口的喷嘴部，在从上述包含生物分子的溶液的射出开始时刻起至0.20毫秒时刻之间，上述包含生物分子的溶液的最大射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下，并以上述包含生物分子的溶液的射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下持续0.11毫秒以上。

在本发明的第一发明的注入器中，利用上述火药的燃烧能量作为射出能量。对于本发明的第一发明的注入器而言，在从包含生物分子的溶液的射出开始时刻起至0.20毫秒时刻之间，上述包含生物分子的溶液的最大射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下，并以上述包含生物分子的溶液的射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下持续0.11毫秒以上，由此能够以高效率向大范围的注入对象的细胞核内直接注入包含生物分子的溶液。

具体而言，例如，在注入对象为哺乳动物个体(生物体)内的细胞的情况下，通过使从包含生物分子的溶液的射出开始时刻起至0.20毫秒时刻之间的上述包含生物分子的溶液的最大射出速度为75m/秒以上，可以期待在包含生物分子的溶液在贯穿哺乳动物个体(生物体)的表皮而注入真皮时，通过剪切力而使细胞变形，其结果是，包含生物分子的溶液被以高效率直接注入至哺乳动物个体(生物体)内的细胞的细胞核内。该最大射出速度优选为90m/秒以上。

另外，通过使从包含生物分子的溶液的射出开始时刻起至0.20毫秒时刻之间的上述包含生物分子的溶液的最大射出速度为150m/秒以下，可以期待不会在注入方向(深度方向)上过度射出，例如，在注入对象为哺乳动物个体(生物体)且该哺乳动物为雌性大鼠(10周龄)等的情况下，可以期待包含生物分子的溶液不会贯穿该大鼠的筋膜。该最大射出速度优选为130m/秒以下。

另外，通过以上述包含生物分子的溶液的射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下持续0.11毫秒以上，可以期待包含生物分子的溶液不在注入方向(深度方向)上、而是向其周边区域扩散，从而可以向大范围的注入对象的细胞核内以高效率直接注入包含生物分子的溶液。例如，在注入对象为哺乳动物个体(生物体)内的细胞的情况下，可以期待贯穿哺乳动物个体(生物体)的表皮而注入真皮的上述包含生物分子的溶液不在注入方向(深度方向)上、而是向其周边区域扩散，从而可以向哺乳动物个体(生物体)内的大范围的细胞的细胞核内以高效率直接注入包含生物分子的溶液。

本发明的第一发明中被注入至注入对象的细胞核内的生物分子，只要是在注入至注入对象的细胞核内时在该注入对象的细胞核内或细胞内发挥出功能的物质即可，没有特别限制。另外，该生物分子可以是天然物，也可以是人工合成的物质。可以列举例如：核酸或其衍生物；核苷、核苷酸、或它们的衍生物；氨基酸、肽、蛋白质、或它们的衍生物；脂质或其衍生物；金属离子；低分子化合物、或其衍生物；抗生素；维生素或其衍生物等。如果是核酸，则可以为DNA，也可以为RNA，它们也可以包含基因。在后述的实施例中，作为生物分子，使用了游离的Cy3标记质粒DNA。

对于被注入至注入对象的细胞核内的生物分子而言，只要生物分子稳定地存在、而且没有对被注入的注入对象、注入对象的细胞核造成破坏等不良影响，则可以是游离的形态，也可以是固定于纳米粒子等载体的形态，还任选经过了修饰，包括溶剂在内，其实施方式没有特别限定。

在DNA包含基因的情况下，可以举出以表达盒、表达载体中包含该基因的形态进行设计等。另外，例如也可以在适于注入DNA的注入对象的种类及注入部位的启动子的控制下配置基因。即，可以在任意方式中使用公知的基因工程方法。

在本发明的第一发明的注入器中，“前端侧”是指配置有从注入器射出包含生物分子的溶液的射出口的一侧，“基端侧”是指注入器中与前端侧相反的一侧，这些表述并不限定地指特定的部位、位置。

本发明的第一发明的注入器是不进行在注入对象内插入有给定的结构物的状态下的经由上述给定的结构物的注入、而从注入器主体向上述注入对象注入包含生物分子的溶液的注入器。对于本发明的第一发明的注入器而言，例如，在从注入器主体至注入对象的距离大的情况等下，可以包括将包含生物分子的溶液从注入器主体引导至注入对象的结构，例如，可以包含导液管等给定的结构物。因此，本发明的第一发明的注入器任选包含或不包含这样的给定的结构物，但在包含给定的结构物的情况下，并不是以该给定的结构物插入注入对象内的状态将包含生物分子的溶液注入该注入对象的注入器。

在本发明的第一发明的注入器中，驱动部采用通过点火装置点火的火药的燃烧能量作为射出能量。即，加压为通过点火装置中的点火药的燃烧而产生的加压。需要说明的是，在利用火药的燃烧能量作为射出能量的情况下，作为火药，例如可以是包含锆和高氯酸钾的火药(ZPP)、包含氢化钛和高氯酸钾的火药(THPP)、包含钛和高氯酸钾的火药(TiPP)、包含铝和高氯酸钾的火药(APP)、包含铝和氧化铋的火药(ABO)、包含铝和氧化钼的火药(AMO)、包含铝和氧化铜的火药(ACO)、包含铝和氧化铁的火药(AFO)中的任一种火药、或者包含其中多种的组合的火药。作为这些火药的特征，其燃烧产物即使在高温状态下为气体，在常温下也不含气体成分，因此点火后燃烧产物立即凝结。

另外，在将气体发生剂的发生能量作为射出能量而利用的情况下，作为气体发生剂，也可以使用在单基无烟火药、或气囊用气体发生器、安全带预紧器用气体发生器中使用的各种气体发生剂。

对于本发明的第一发明的注入器而言，填充室中并非从最初就容纳有包含生物分子的溶液，而是通过经由具有射出口的喷嘴将包含生物分子的溶液抽吸至填充室内而容纳。这样，通过采用需要向填充室进行填充操作的构成，可以注入所需要的任意的包含生物分子的溶液。因此，在本发明的第一发明的注入器中，针筒部是以可装卸的方式构成的。

以下，作为本发明的第一发明中的一个实施方式的注入器的例子，参照附图对注射器1(无针注射器)进行说明。需要说明的是，以下的实施方式的构成为示例，本发明的第一发明并不限定于该实施方式的构成。需要说明的是，作为表示注射器1的长度方向上的相对位置关系的用语，使用“前端侧”及“基端侧”。该“前端侧”表示靠近后述的注射器1的前端、即靠近射出口31a的位置，该“基端侧”表示在注射器1的长度方向上与“前端侧”相反侧的方向、即驱动部7侧的方向。另外，本示例是使用DNA溶液作为包含生物分子的溶液的示例，但本发明的第一发明并不限定于此。

(注射器1的结构)

图1是示出注射器1的示意结构的图，也是注射器1沿其长度方向的剖面图。注射器1是通过将注射器装配体10安装于外壳(注射器外壳)2而构成的，所述注射器装配体10是将由针筒部3和柱塞4构成的子装配体、以及由注射器主体6、活塞5及驱动部7构成的子装配体装配成一体而得到的。

如上所述，注射器装配体10以相对于外壳2可自由装卸的方式构成。注射器装配体10中包含的针筒部3与柱塞4之间形成的填充室32中填充有DNA溶液，并且，该注射器装配体10是在每次进行DNA溶液的射出时用完即抛弃的单元。另一方面，外壳2侧包含电池9，所述电池9对注射器装配体10的驱动部7中包含的点火器71供给电力。通过使用者进行按下设于外壳2的按钮8的操作，经由布线在外壳2侧的电极与注射器装配体10的驱动部7侧的电极之间进行从电池9的电力供给。需要说明的是，外壳2侧的电极和注射器装配体10的驱动部7侧的电极以将注射器装配体10安装于外壳2时会自动地接触的方式设计了两个电极的形状及位置。另外，外壳2是只要电池9残留有能够供给至驱动部7的电力就可重复使用的单元。需要说明的是，在外壳2中，在电池9没电的情况下，可以仅更换电池9而继续使用外壳2。

另外，图1所示的注射器主体6内虽然没有特别配置追加的火药成分，但为了调整通过活塞5施加于DNA溶液的压力变化，也可以将利用点火器71中的火药燃烧所产生的燃烧产物而发生燃烧并产生气体的气体发生剂等配置在点火器71内、注射器主体6的通孔内。在点火器71内配置气体发生剂的结构如国际公开公报01-031282号、日本特开2003-25950号公报等公开的那样是已经公知的技术。另外，作为气体发生剂的一例，可以举出包含硝化纤维素98质量％、二苯胺0.8质量％、硫酸钾1.2质量％的单基无烟火药。另外，也可以使用在气囊用气体发生器、安全带预紧器用气体发生器中使用的各种气体发生剂。通过调整配置于通孔内时的气体发生剂的尺寸、大小、形状、特别是表面形状，可以使该气体发生剂的燃烧结束时间发生变化，由此可使施加于DNA溶液的压力变化发生希望的变化，即发生能够适宜地向注入对象注入DNA溶液的变化。在本发明的第一发明中，根据需要而使用的气体发生剂等也包含于驱动部7。

(注入对象)

本发明的第一发明中的注入对象可以是细胞、细胞片内的细胞、组织内的细胞、器官(脏器)内的细胞、器官系统内的细胞、个体(生物体)内的细胞中的任意对象，没有限制。作为优选的注入对象，可以举出哺乳动物来源的上述注入对象。更优选为哺乳动物个体(生物体)内的细胞，进一步优选为皮肤内的细胞，更进一步优选为选自皮内、皮下及皮肌中的一种以上的组织内的细胞。在该情况下，可以采用从注入器向哺乳动物个体(生物体)的皮肤表面射出包含生物分子的溶液、并从该皮肤表面注入至选自该皮肤内的皮内、皮下及皮肌中的一种以上组织内的细胞的方法。

另外，作为从注入器向注入对象注入包含生物分子的溶液时的系统，以体外系统、体内系统、离体系统为首，可以是任意系统。

另外，作为哺乳动物，没有特别限制，可以列举：人、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、牛、山羊、绵羊、猪、猴、犬、猫等。另外，根据注入对象，还可以举出除人类以外的作为哺乳动物的方式。

(确认已向大范围的注入对象的细胞核内直接注入了包含生物分子的溶液的方法)

确认已向大范围的注入对象的细胞核内直接注入了包含生物分子的溶液的方法没有特别限制，可以使用公知的生物学方法。可以举出例如预先对生物分子进行荧光标记，并在注入至注入对象的细胞核内之后进行荧光显微观察的方法等。在后述的实施例中，作为直接注入至哺乳动物个体(生物体)内的细胞的细胞核的DNA，使用了Cy3标记质粒V7905(Mirus公司制)，作为核染色色素，使用了DAPI。样品例如可以在注入DNA后立即获取组织并进行切片来制备。此时，可以同时进行DAPI染色。由于在注入了Cy3标记质粒V7905的位置会发出红色的荧光，在细胞核的位置会因DAPI而发出蓝色的荧光，因此，通过荧光显微观察可以鉴定出，发蓝紫色的荧光的位置是直接注入至细胞核内的Cy3标记质粒V7905的位置。

＜第二发明＞

本发明的第二发明是使用第一发明的注入器向注入对象的细胞核内注入包含生物分子的溶液的方法。

对于本发明的第二发明中的注入器、注入对象、包含生物分子的溶液，援引上述本发明的第一发明的说明。

＜第三发明＞

本发明的第三发明是在注入对象中使基因表达的方法，该方法包括：使用第一发明的注入器向注入对象的细胞核内注入包含DNA的溶液的工序，所述DNA包含基因。

对于本发明的第三发明中的注入器、注入对象、包含含有基因的DNA的溶液，援引上述的本发明的第一发明的说明。

实施例

以下，通过实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明只要不脱离其主旨，就并不限定于下述的实施例。

(注入器的射出速度的评价)

[实施例1]

向图1所示的注入器(喷嘴径：直径0.1mm)填充100μL的水，对于由点火药的燃烧所引起的水的射出开始时刻起的上述水的射出速度进行了评价。作为火药，使用了35mg包含锆和高氯酸钾的火药(ZPP)，未使用气体发生剂。水的射出速度是使用高速照相机(Photoron公司制、FASTCAM SA-X2)拍摄注入器的前端，并根据射出的水的位移和时间而算出的。

图2和表1分别示出了实施例1中的水的射出速度随时间经过的图和需要说明的是，在表1中，某个时刻的射出速度是将其前一个记载的时刻的水的位移与其后一个记载的时刻的水的位移之差除以其时间而得到的。例如，0.013毫秒时刻一栏的射出速度是将0.000毫秒时刻的水的位移与0.020毫秒时刻的水的位移之差除以其时间0.020毫秒而得到的。

[表1]

(向哺乳动物个体(生物体)内的细胞的细胞核内注入DNA溶液的试验)

[实施例2]

向上述实施例1中使用的注入器中使用作为火药的包含锆和高氯酸钾的火药(ZPP)35mg、作为气体发生剂的单基无烟火药40mg，填充包含Cy3标记质粒V7905的溶液30μL(溶剂：无内毒素的TE缓冲液、最终浓度：0.1mg/mL)，注入至雌性SD大鼠(10周龄)的腰背部的皮肤。需要说明的是，如上所述，在实施例1中没有使用气体发生剂，但在本实施例中使用了气体发生剂。可以认为，这是由于气体发生剂的有无不会对本发明中限定的初期的射出速度造成影响。

在注入后立即采集皮肤，利用干冰在OCT化合物(冷冻组织切片制备用包埋剂(TissueTech O.C.T.Compound)、Sakura Fine Tech Japan公司制)中进行冷冻。使用低温恒温器(Leica公司制)以6μm的厚度将注入部截面切成薄片，用加入了DAPI的封片剂封片。用多功能荧光显微镜(Z-X700、KEYENCE公司制)对制成的试样进行荧光观察，以0.1～0.4μm厚度获得了Cy3的红色荧光图像和DAPI的蓝色荧光图像。为了获得注入区域的注入分布，获得了多个视场的图像。将其结果示于图3。比例尺表示0.73mm。

使用混合细胞计数功能如下所述地计算出了直接注入了DNA的细胞数的比例。即，对于各分析对象区域(图3中的由白框包围的各区域)内的各细胞，将蓝色荧光和红色荧光重合而成的紫色荧光的面积相对于细胞的面积为50％以上的细胞定义为直接注入了DNA的细胞，对其细胞数进行计数(将其作为细胞数A)。另一方面，以细胞核的个数作为指标对各分析对象区域内的总细胞数进行计数(将其作为细胞数B)。图3的各分析对象区域中记载的比例是细胞数A相对于细胞数B的比例。需要说明的是，从分析对象中排除了基本上未观察到Cy3的红色荧光的表皮和毛囊。

根据图3，在实施例2中，不是在注入口正下方的狭窄范围、而是在以注入口为中心的大范围的细胞的细胞核内以高比例直接注入了DNA。

(使用大鼠的基因表达评价)

[实施例3]

向上述实施例1中使用的注入器填充包含荧光素酶基因的质粒pGL3-controlvector(Promega公司制)溶液30μL(溶剂：无内毒素的TE缓冲液、最终浓度：1.0mg/mL)，注入雌性SD大鼠(10周龄)的腰背部的皮肤。

需要说明的是，如上所述，在实施例1中没有使用气体发生剂，但在本实施例中使用了气体发生剂。这是由于可以认为有无气体发生剂不会对本发明中限定的初期的射出速度造成影响。

将注入后的该大鼠返回饲养环境24小时后，使其安乐死，然后将以注入口为中心的直径1mmφ的圆形的从皮内至皮肌(即，皮内、皮下及皮肌)的组织取出，将其作为“中心样品”。另外，将以距离注入口1.5～2mm左右的位置为中心的直径1mmφ的圆形的从皮内至皮肌(即，皮内、皮下及皮肌)的组织取出，将其作为“外侧样品”。外侧样品在以注入口为中心成点对称的位置采集了2个部位。

准备了将Luciferase assay system(Promega公司)的“Cell Culture Lysis×5”稀释5倍并加入至2mL微量管0.1mL的溶解液，将中心样品添加于该溶解液。接下来，将该微量管在干冰环境中放入约15分钟将其冷冻。确认已被冷冻，在室温下放置约20分钟将其解冻。共计重复3次该冷冻和解冻，促进细胞的破坏。然后，将样品静置5分钟，得到了上清。

另外，对于2个部位的外侧样品分别实施。

荧光素酶测定使用Lumitester C100(Kikkoman Biochemifa公司制)进行。首先，将Luciferase assey system的Luciferase Assay Substrate恢复室温并开封，向其中加入10mL的恢复至室温的Luciferase Assay Buffer。以不起泡的方式轻轻地振荡混合，确认已溶解。将其100μL添加于Lumitube，添加待测定的上清样品20μL，进行多次移液使其均匀。在约20秒钟以内将样品放入Lumitester的测定室进行测定，获得发光强度。对于外侧样品，取2个部位的外侧样品的发光强度的平均值作为外侧样品的发光强度。该发光强度(RLU)与荧光素酶基因的表达量相关。其中，排除了由于对该大鼠注入DNA溶液的范围狭窄而被判断为不足以获得外侧样品的情况而进行了分析。

对于实施例3中得到的发光强度(RLU)，将外侧样品的RLU除以中心样品的RLU而得到的数值以百分率表示的结果示于图4。在图4中，菱形的图标表示各数值，横条表示平均值。

根据图4，在实施例3中，在外侧样品中也观测到了较高的基因表达，不仅在以注入口为中心的狭窄范围、在以注入口为中心的大范围的组织中也得到了高效率的基因表达。

Claims (3)

1.注入器，其是不进行在注入对象内插入有给定的结构物的状态下的经由所述给定的结构物的注入、而从注入器主体向所述注入对象注入包含生物分子的溶液的注入器，

该注入器具备：

容纳包含生物分子的溶液的容纳部、以及

具有使通过点火装置中的点火药的燃烧而被加压了的所述包含生物分子的溶液流过并向所述注入对象射出的射出口的喷嘴部，

在从所述包含生物分子的溶液的射出开始时刻起至0.20毫秒时刻之间，所述包含生物分子的溶液的最大射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下，并以所述包含生物分子的溶液的射出速度为75m/秒以上且150m/秒以下持续0.11毫秒以上。

2.使用权利要求1所述的注入器向注入对象的细胞核内注入包含生物分子的溶液的方法。

3.在注入对象中使基因表达的方法，该方法包括：

使用权利要求1所述的注入器向注入对象的细胞核内注入包含DNA的溶液的工序，所述DNA包含基因。

Images