CN111698998A - 生殖道感染的联合治疗和预防 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种用于治疗生殖道感染如淋球菌感染和减少其复发的方法。该方法包括局部使用掺入聚合物微球中的IL‑12。还提供一种通过给予来自淋病奈瑟菌的外膜囊泡制剂和掺入聚合物微球中的IL‑12，来减少由淋病奈瑟菌引起的生殖道感染的发生的方法。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2018年9月21日提交的美国专利申请号16/138,526的优先权，该专利申请是2017年11月28日提交的美国专利申请号15/824,700的部分延续申请，其各自的公开内容通过引用纳入本文。
关于联邦资助研究的声明
本发明是在国立卫生研究院授予的基金AI074791的政府支持下完成的。政府对本发明拥有一定的权利。
技术领域
本发明涉及包含IL-12和来自淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)的外膜囊泡的组合物，以及用该组合物治疗生殖道感染的方法。
背景技术
由淋病奈瑟菌引起的生殖道感染会导致淋病，淋病是美国第二大最常报道的传染病，每年影响多于300,000例，尽管实际发病率被认为至少是该数字的两倍。据估计，全世界的淋病发病率每年超过1亿例。女性首当其冲遭遇感染，因为未经治疗的淋病可上升至上生殖道，并引起盆腔炎疾病和输卵管结疤，导致不孕症和异位妊娠的风险，这可危及生命。然而，有很大比例(往往高达50％甚至更多)的受感染女性可以是无症状感染，从而增加了在其性接触中传播感染的风险。相比之下，男性通常会在几天内意识到自己的感染，因此被迫寻求治疗。初生婴儿可因通过受感染的产道分娩而导致眼睛受到感染，如果不及时治疗，这可导致失明。还已知未经治疗的淋病使感染和传播HIV的风险增加最多达5倍。治疗依赖于抗生素，但淋病奈瑟菌已迅速对于针对其所使用的各类抗生素产生耐药性，包括最近的氟喹诺酮类(环丙沙星)，目前推荐的抗生素为头孢菌素类。然而，对这些的耐药性开始出现，使淋病奈瑟菌具有多重耐药性。尽管作出了种种努力，目前尚无针对淋病奈瑟菌的疫苗。淋病奈瑟菌广泛的抗原变异性使疫苗工作变得复杂，其中大部分主要表面抗原、包括脂寡糖(LOS)、孔蛋白、菌毛蛋白和不透明蛋白(Opa)都经历相变表达(LOS、Opa、菌毛)、等位基因变异(孔蛋白、Opa)或重组表达(菌毛蛋白)。因此，治疗和控制该疾病的选择正变得有限。淋病的一个令人费解但众所周知的特征是，从感染中恢复不会导致针对再感染的保护性免疫，并且反复感染是常见的。
发明内容
本公开提供一种通过向个体给予淋病奈瑟菌抗原和掺入聚合物微球中的IL-12来降低发生淋病奈瑟菌感染的风险的方法。淋病奈瑟菌抗原可以是外膜囊泡或微囊泡的形式。也可以使用其他形式的抗原(例如经纯化或半纯化)。淋病奈瑟菌抗原制剂(例如OMV)和IL-12微球可以在单一组合物或不同组合物中，通过相同途径或不同途径，在同一时间或不同时间，在同一时间段内以相同递送方案，或者在不同时间段内以不同递送方案进行递送。例如，淋病奈瑟菌OMV和IL-12微球可以阴道内给药，也可以鼻内给药。
在一个方面，本公开提供一种通过局部施用掺入聚合物微球中的IL-12来治疗宫颈阴道感染的方法。不希望受任何特定理论的束缚，认为将掺入聚合物微球中的IL-12局部施用到粘膜表面可增强人体自身对现有感染的免疫反应，从而减少或消除该感染和/或产生针对反复感染的免疫力。在一个实施方式中，量足以促进Th1驱动的针对引起感染的微生物的反应。IL-12的量可足以提供针对病原微生物的治疗效果、预防效果或两者。可通过本方法治疗的感染包括但不限于由淋病奈瑟菌、沙眼衣原体(C.trachomatis)或两者引起的感染。可以用于IL-12的微包封的聚合物的例子是聚乳酸。
在一个方面，本公开提供一种组合物，其包含由淋病奈瑟菌制备的OMV和含IL-12的微球(ms)，适合于阴道内递送。
在一个方面，本公开提供一种试剂盒，其用于阴道内递送由淋病奈瑟菌制备的OMV和含IL-12的微球。OMV和IL-12微球可以存在于不同组合物或相同组合物中。试剂盒可包含多剂量的OMV组合物和IL-12组合物以及给药说明书，其可包括关于频率、给药方案的长度、给药方式等的说明。
附图说明
为了更好地理解本发明的本质和目的，参考以下与附图结合的详细说明，其中：
图1是显示用包封在聚乳酸(PLA)微球中的1μg IL-12进行的阴道内治疗对小鼠中淋病奈瑟菌阴道感染过程的影响的图；
图2是显示在淋病奈瑟菌的初次感染期间用IL-12微球进行的阴道内治疗(图1)对小鼠中淋病奈瑟菌继发性阴道感染过程的影响的图。
图3是显示用1μg的可溶性IL-12和微包封IL-12进行的阴道内治疗对小鼠中淋病奈瑟菌阴道感染过程的影响之间的对比的图。
图4是显示阴道内IL-12微球(ms)治疗对BALB/c小鼠中原发性淋球菌感染的影响的图。(A)IL-12ms剂量优化实验。在第0、2、4、6、8天给予含有规定剂量的IL-12的微球；每组n＝8只小鼠。每天通过阴道拭子培养监测淋病奈瑟菌(Ngo)的负荷。发现用2.0μg(p<0.01)，1.0μg(p<0.01)或0.5μg(p<0.05)的微包封IL-12进行治疗的小鼠与对照之间的感染负荷有显著差异(ANOVA)。(B)用IL-12ms、可溶性IL-12、IL-17ms或对照ms进行治疗的小鼠或未经治疗的小鼠的感染时程；在第-1、1、3、5、7天给予细胞因子剂量＝1.0μg；每组n＝8只小鼠。发现用IL-12ms(p<0.01)或
进行治疗的小鼠与对照之间的感染负荷有显著差异(ANOVA)。(C)将来自B中所示实验的数据绘制成在指定的细胞因子治疗下仍保持感染的小鼠的百分比。与对照(Kaplan-Meier)相比，用IL-12ms(p<0.0001)或IL-17ms(p<0.001)进行治疗的小鼠明显更快地清除了感染。(D)从用IL-12ms、IL-17ms或对照ms进行治疗的假感染或受感染的小鼠中分离的ILN细胞中的细胞因子表达；每组n＝7只小鼠。通过流式细胞术分析在感染后第5天分离的CD4+T细胞中IFN-γ、IL-4和IL-17的表达。(E)在第3天从用IL-12ms、IL-17ms或对照ms进行治疗的假感染或受感染的小鼠中收集的阴道组织中的IFN-γ、IL-4和IL-17mRNA水平的RT-PCR分析；每组n＝7只小鼠。通过RT-PCR检测的细胞因子基因表达水平相对于β-肌动蛋白的表达标准化，并且对于假感染组设定为1.0。(F)在第5天从用IL-17ms或对照ms进行治疗的假感染或受感染的小鼠中分离的阴道细胞的表型特征；每组n＝7只小鼠。用IL-12ms、IL-17ms或对照ms进行治疗的假感染或受感染的小鼠中的(G)阴道和(H)血清抗淋球菌IgA和IgG抗体反应；每组n＝7只小鼠。接种15天后收集阴道洗液和血清，并通过ELISA测定淋球菌特异性及总IgA和IgG。显示了三个独立实验中的一个代表的结果。D–H中，#p<0.05；*p<0.01(非配对t检验)；
图5是显示初次感染期间的阴道内IL-12微球(ms)治疗对继发性淋球菌感染的影响的图。(A)在初次感染期间用IL-12ms、可溶性IL-12、IL-17ms或对照ms进行治疗的小鼠或先前经过或未经过IL-12ms治疗的假感染小鼠中的继发性感染时程；每组n＝8只小鼠。发现先前用
进行治疗的小鼠与对照之间的感染负荷有显著差异(ANOVA)。(B)将来自A中所示实验的数据绘制成在初次感染期间的指定治疗下在再感染后仍保持感染的小鼠的百分比。与对照(Kaplan-Meier)相比，先前用IL-12ms(p<0.0001)进行治疗的小鼠明显更快地清除了感染。(C)在第5天从在初次感染期间用IL-12ms、IL-17ms或对照ms进行治疗的再感染小鼠或在初次和继发阶段内均被假感染(“假再感染”)的小鼠中分离的ILNCD4+T细胞中细胞因子表达的流式细胞术分析；每组n＝7只小鼠。(E)在第3天从在初次感染期间用IL-12ms、IL-17ms或空白ms进行治疗的假感染或再感染的小鼠中收集的阴道组织中的IFN-γ、IL-4和IL-17mRNA水平的RT-PCR分析；每组n＝7只小鼠。通过RT-PCR检测的细胞因子基因表达水平相对于β-肌动蛋白的表达标准化，并且对于假再感染组设定为1.0。在初次感染期间用IL-12ms、IL-17ms或空白ms进行治疗的假再感染或再感染的小鼠中针对继发性感染的(E)阴道和(F)血清抗淋球菌IgA和IgG抗体反应；每组n＝7只小鼠。接种15天后收集阴道洗液和血清，并通过ELISA测定淋球菌特异性及总IgA和IgG。显示了三个独立实验中的一个代表的结果。C–F中，#p<0.05；*p<0.01(非配对t检验)。
图6显示用淋球菌OMV加IL-12/ms的阴道内(i.vag)免疫诱导了对淋病奈瑟菌的生殖器感染的抗性，并产生了免疫反应。a：以7天的间隔用来自FA1090菌株的OMV(40μg蛋白)加对照(空白)ms或IL-12/ms(1μg IL-12)对小鼠免疫3次；对照小鼠用空白ms或单独用IL-12/ms进行假免疫。末次免疫后两周，通过淋病奈瑟菌FA1090菌株(5×106CFU)的i.vag接种对所有小鼠进行攻击，并通过阴道擦拭和铺板监测感染。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，*P<0.01(ANOVA)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比，P<0.01(Kaplan-Meier分析，对数秩检验，OMV加IL-12/ms对OMV加空白ms)。b：终止后(第15天)收集的样品中针对FA1090菌株的阴道洗液(左)和血清(右)抗体，以平均值±SEM表示，N＝5个样品；#P<0.05，*P<0.01，斯氏t检验。c：终止时(第15天)从ILN回收的CD4+细胞中的细胞内细胞因子染色，以平均值±SEM表示，N＝3个样品，针对每种细胞因子的CD4+染色的百分比；*P<0.01，斯氏t检验。d：以14天的间隔用淋球菌(Ngo)OMV(40μg蛋白)加空白ms或IL-12/ms(1μg IL-12)对小鼠免疫2次；对照小鼠单独用空白ms或用NTHI OMV(40μg蛋白)加IL-12/ms(1μg IL-12)进行假免疫。两周后，用淋病奈瑟菌FA1090菌株(5×106CFU)对所有小鼠进行攻击。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，*P<0.01(ANOVA，淋球菌OMV加IL-12/ms对淋球菌OMV加空白ms)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比，P<0.0001(Kaplan-Meier分析，对数秩检验，淋球菌OMV加IL-12/ms对淋球菌OMV加空白ms)。
图7显示在淋球菌攻击之前，通过淋球菌OMV加IL-12/ms的免疫产生的抗体反应。a：用1、2或3剂的淋球菌OMV(40μg蛋白)加IL-12/ms(1μg IL-12)末次免疫后2周，通过ELISA检测的阴道洗液(左图)和血清(右图)抗体。对照样品获自用空白ms(3剂)进行假免疫的小鼠；其他小鼠用淋球菌OMV加空白ms免疫3次。数据以平均值±SEM表示，N＝5个样品，#P<0.05，*P<0.01，相对于对照样品(ANOVA)。用2剂FA1090 OMV加空白ms或IL-12/ms免疫的小鼠的阴道洗液(b)和血清(c)抗体的持续时间；数据以平均值±SEM表示，N＝5个样品；C，来自未免疫小鼠的对照样品。
图8显示：a：通过用淋球菌OMV(40μg蛋白)加IL-12/ms(1μg IL-12)免疫1、2或3次，并且在末次免疫后2周用淋球菌OMV加IL-12/ms的免疫诱导的ILN细胞中的T细胞细胞因子反应。对照ILN获自用空白ms(3剂)进行假免疫的小鼠，其他小鼠用淋球菌OMV加空白ms免疫3次。数据以平均值±SEM表示，N＝3个样品，针对每种细胞因子的CD4+或CD8+细胞染色的百分比。*P<0.01(斯氏t检验)，用IL-12/ms和空白ms进行的免疫之间的对比。b：用淋球菌OMV加IL-12/ms或OMV加空白ms两次免疫后1-6个月的CD4+ILN细胞中IFNγ反应的持续时间。数据以平均值±SEM表示，N＝3个样品，针对IFNγ的CD4+细胞染色的百分比；C，来自未免疫小鼠的对照ILN。
图9显示用两剂淋球菌(FA1090)OMV加IL-12/ms免疫后，对淋球菌(FA1090)攻击的抗性持续至少6个月。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，*P<0.01(ANOVA，淋球菌OMV加IL-12/ms对淋球菌OMV加空白ms)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比，P<0.001(Kaplan-Meier分析，对数秩检验，淋球菌OMV加IL-12/ms对淋球菌OMV加空白ms)。
图10显示对异源性淋球菌攻击的抗性。a：用FA1090 OMV加IL-12/ms或空白ms免疫一个月后，用淋病奈瑟菌FA1090菌株(同源性攻击)或MS11菌株(异源性攻击)攻击小鼠。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，*P<0.001(ANOVA，示出以作比较)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比，对于FA1090攻击而言，IL-12/ms对空白ms的P<0.02；对于MS11攻击而言，IL-12/ms对空白ms的P<0.001(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。b：用MS11 OMV免疫的小鼠对淋病奈瑟菌FA1090的攻击有抗性。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，*P<0.01(ANOVA)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比，P<0.01(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。b：用FA1090 OMV免疫的小鼠对淋病奈瑟菌FA19的攻击有抗性。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，*P<0.01(ANOVA，示出以作比较)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比，对于FA1090攻击而言，IL-12/ms对空白ms的P<0.01；对于FA19攻击而言，IL-12/ms对空白ms的P<0.0001(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)，N＝8只小鼠。d：用FA19 OMV免疫的小鼠对淋病奈瑟菌FA1090的攻击有抗性。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，*P<0.01(ANOVA)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比，P<0.01(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。b：用FA1090 OMV免疫的小鼠对临床分离物GC68的攻击有抗性。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，*P<0.01(ANOVA)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比，P<0.01(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。
图11显示淋球菌OMV的免疫蛋白质组学。a：来自淋病奈瑟菌FA1090、MS11和FA19菌株的OMV制剂的SDS-PAGE，用考马斯蓝染色。b：用通过SDS-PAGE分离的淋球菌OMV制剂进行试验的小鼠血清的Western印迹分析。泳道1是来自用FA1090 OMV加空白ms免疫的小鼠的对照血清，针对FA1090 OMV进行试验；泳道2-4是来自用FA1090 OMV加IL-12/ms免疫的小鼠的1号血清，针对来自FA1090(泳道2)、MS11(泳道3)或FA19(泳道4)的OMV进行试验；泳道5是来自用FA1090 OMV加IL-12/ms免疫的小鼠的2号血清，针对来自FA1090的OMV进行试验；泳道6是抗体H5(抗孔蛋白PIB3)，针对FA1090 OMV进行试验。c-e：通过二维电泳和Flamingo荧光染色揭示了源自FA1090(c)、MS11(d)和FA19(e)的淋球菌OMV的蛋白质组图谱(左图)以及通过用小鼠2号血清作为探针而获得的相应免疫印迹(右图)。进行了MS/MS分析的免疫反应斑点标记为斑点1和2(箭头)。分子量标记(kDa)显示在左侧。
图12显示通过淋球菌OMV加IL-12/ms的免疫诱导的攻击抗性依赖于IFNγ和B细胞。a：用FA1090 OMV免疫的IFNγ-ko和野生型小鼠中的感染过程(FA1090)之间的对比；左图是淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，·P<0.01(ANOVA)；右图是每个时间点仍保持感染的动物的百分比，野生型小鼠的IL-12/ms和空白ms之间的P<0.0001(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。b：用FA1090 OMV免疫的μMT和野生型小鼠中的感染过程(FA1090)之间的对比；左图是淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，·P<0.01(ANOVA)；右图是每个时间点仍保持感染的动物的百分比，野生型小鼠的IL-12/ms和空白ms之间的P<0.0001(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。终止时(第13天)检测的IFNγ-ko和野生型中的阴道洗液(c)和血清(d)抗体反应之间的对比(平均值±SEM，N＝5个样品)。对于野生型小鼠，阴道洗液和血清中的IgA和IgG反应有显著差异(P<0.05，斯氏t检验，OMV加空白ms对OMV加IL-12/ms)，而IFNγ-ko小鼠没有。e：终止时(第13天)检测的μMT和野生型小鼠中的T细胞细胞因子反应之间的对比(平均值±SEM，N＝3个样品)。对于野生型和μMT小鼠，对OMV加空白ms和OMV加IL-12/ms的免疫的IFNγ反应之间都有显著差异(P<0.01)。a：用FA1090OMV免疫的CD4-ko和野生型小鼠中的感染过程(FA1090)之间的对比；左图是淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，#P<0.05，·P<0.01(ANOVA)，示出以作比较；右图是每个时间点仍保持感染的动物的百分比，野生型小鼠的IL-12/ms和空白ms之间的P<0.001，CD4-ko小鼠的IL-12/ms和空白ms之间的P<0.01(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。g：用FA1090 OMV免疫的CD8-ko和野生型小鼠中的感染过程(FA1090)之间的对比；左图是淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，#P<0.05，·P<0.01(ANOVA)，示出以作比较；右图是每个时间点仍保持感染的动物的百分比，野生型小鼠的IL-12/ms和空白ms之间的P<0.001，CD8-ko小鼠的IL-12/ms和空白ms之间的P<0.02(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。
图13是图1重复：用淋球菌OMV加IL-12/ms的i.vag免疫诱导了对淋病奈瑟菌的生殖器感染的抗性，并产生了免疫反应。A：以7天的间隔用来自FA1090菌株的OMV(40μg蛋白)加对照(空白)ms或IL-12/ms(1μg IL-12)对小鼠免疫3次；对照小鼠用空白ms或单独用IL-12/ms进行假免疫。末次免疫后两周，通过淋病奈瑟菌FA1090菌株(5×106CFU)的i.vag接种对所有小鼠进行攻击，并通过阴道擦拭和铺板监测感染。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，P<0.01(ANOVA，OMV加IL-12/ms对OMV加空白ms)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比，P<0.001(Kaplan-Meier分析，对数秩检验，OMV加IL-12/ms对OMV加空白ms)。B：终止后(第15天)收集的样品中针对FA1090菌株的阴道洗液(左)和血清(右)抗体，以平均值±SEM表示。
C：终止时(第15天)从ILN回收的CD4+细胞中的细胞内细胞因子染色，以平均值±SEM表示，N＝3个样品，针对每种细胞因子的CD4+染色的百分比。D：以14天的间隔用淋球菌(Ngo)OMV(40μg蛋白)加空白ms或IL-12/ms(1μg IL-12)对小鼠免疫2次；对照小鼠单独用空白ms或用NTHI OMV(40μg蛋白)加IL-12/ms(1μg IL-12)进行假免疫。两周后，用淋病奈瑟菌FA1090菌株对所有小鼠进行攻击。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，*P<0.001(ANOVA，淋球菌OMV加IL-12/ms对淋球菌OMV加空白ms)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比，P<0.001(Kaplan-Meier分析，对数秩检验，淋球菌OMV加IL-12/ms对淋球菌OMV加空白ms)。
图14显示图6C中所示数据的流式细胞术图的实例。如所示进行免疫的小鼠中清除感染后(第15天)的ILN细胞的细胞内细胞因子染色。X轴(FL4H)：细胞因子荧光；Y轴(PE2)：CD4荧光(A-L)；CD8荧光(M-P)。
图15显示通过由NTHI制备的OMV的免疫诱导的反应；样品在如所示进行免疫后2周收集。A：阴道洗液抗体(平均值±SEM，N＝5个样品)；B：血清抗体(平均值±SEM，N＝5个样品)；C：ILN细胞中的T细胞细胞因子(平均值±SEM，N＝3个样品)。*P<0.01相比于对照样品(斯氏t检验)。
图16显示通过淋球菌OMV加IL-12/ms的免疫诱导的阴道洗液(A)和血清(B)中抗淋球菌抗体反应的IgG亚类(平均值±SEM，N＝5个样品)。#P<0.05，*P<0.01相比于对照样品(斯氏t检验)。
图17显示：A:ILN中的T细胞反应对淋球菌抗原的特异性。将来自用FA1090 OMV加空白ms或IL-12/ms免疫的小鼠的ILN CD4+T细胞预装CFSE，并在抗原呈递细胞的存在下和(刺激)或不和FA1090细胞一起体外培养3天。对CD4进行表面染色后，通过流式细胞术检测增殖，并通过ELISA测定细胞因子分泌。数据以平均值±SEM表示，N＝7个样品。*P<0.01相比于对照样品(斯氏t检验)。B：用OMV加空白ms或IL-12/ms末次免疫(1、2或3剂)后第3天从阴道组织提取的RNA的RT-PCR分析。数据以平均值±SEM表示，N＝7个样品。*P<0.01相对于来自用OMV加空白ms免疫的小鼠的样品(斯氏t检验)。C：用OMV加IL-12/ms免疫1-6个月后收集的CD4+ILN细胞中的IFNγ反应的持久性。数据以平均值±SEM表示，N＝7个样品。
图18显示用FA1090 OMV加IL-12/ms免疫6个月后用淋病奈瑟菌FA1090攻击的小鼠中的反应。A：阴道洗液抗体(平均值±SEM，N＝5个样品)；B：血清抗体(平均值±SEM，N＝5个样品)；C：由CD4+ILN细胞产生的细胞因子(平均值±SEM，N＝3个样品)。#P<0.05，*P<0.01相比于来自假感染小鼠对照样品(斯氏t检验)。
图19显示在异源性淋球菌攻击后用淋球菌OMV加空白ms或IL-12/ms免疫的小鼠中的反应。A、B、C；用FA1090 OMV免疫并用MS11攻击的小鼠；A：阴道洗液抗体；B：血清抗体，针对MS11(平均值±SEM，N＝5个样品)；C：CD4+ILN细胞中的细胞因子反应(平均值±SEM，N＝3个样品)。D、E、F；用FA1090 OMV免疫并用FA19攻击的小鼠；D：阴道洗液抗体；E：血清抗体，针对FA19(平均值±SEM，N＝5个样品)；F：CD4+ILN细胞中的细胞因子反应(平均值±SEM，N＝3个样品)。#P<0.05，*P<0.01相比于来自假感染小鼠对照样品(斯氏t检验)。
图20是图7重复。A、B、F、G：在免疫缺陷小鼠中用淋球菌OMV加IL-12/ms进行i.vag免疫。A：用FA1090 OMV免疫的IFNγ-ko和野生型小鼠中的感染过程(FA1090)之间的对比；左图是淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，·P<0.01(ANOVA)；右图是每个时间点仍保持感染的动物的百分比，野生型小鼠的IL-12/ms和空白ms之间的P<0.001(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。B：用FA1090 OMV免疫的μMT小鼠中的感染过程(FA1090)；左图是淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8个小鼠)。C：用FA1090 OMV免疫的CD4-ko小鼠中的感染过程(FA1090)；左图是淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)；右图是每个时间点仍保持感染的动物的百分比，P<0.01(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。D：用FA1090 OMV免疫的CD8-ko和野生型小鼠中的感染过程(FA1090)之间的对比；左图是淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)；右图是每个时间点仍保持感染的动物的百分比，P<0.01(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。
图21显示用淋球菌OMV(FA19菌株)加IL-12/ms的i.n.免疫对BALB/c小鼠中的淋球菌攻击感染的影响。A:淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)，P<0.01(ANOVA淋球菌OMV加IL-12/ms对淋球菌OMV加空白ms)；B：每个时间点仍保持感染的动物的百分比。
图22显示用不同剂量的淋球菌OMV(FA1090菌株)加IL-12/ms的免疫对BALB/c小鼠中的FA19菌株的异源性淋球菌攻击感染的影响。低剂量：每剂60μg，中等剂量：每剂30μg，低剂量：每剂15μg的OMV蛋白，加1μg IL-12/ms。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8只小鼠)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比。
图23显示A：用淋球菌OMV(30μg蛋白；FA1090菌株)加1μg IL-12/ms的鼻内或阴道内免疫对BALB/c小鼠中的FA19菌株的异源性淋球菌攻击感染的影响的比较。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8-9只小鼠)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比。终止时(攻击后2周)在清除感染后收集的样品中针对淋病奈瑟菌的B：血清、C：阴道洗液、D：唾液的抗体；*P<0.01相比于对照(斯氏t检验)。
图24显示用淋球菌OMV(30μg蛋白；FA1090菌株)加1μg IL-12/ms的鼻内或阴道内免疫对BALB/c小鼠中的FA1090菌株的同源性淋球菌攻击感染的影响的比较。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8-9只小鼠)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比。
图25显示用淋球菌OMV(30μg蛋白；FA1090菌株)加1μg IL-12/ms的鼻内免疫对BALB/c小鼠中的MS11菌株的异源性淋球菌攻击感染的影响。给予小鼠一剂OMV加IL-12/ms，或两剂，间隔2周；对照小鼠给予2剂空白ms。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝9只小鼠)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比。
图26显示用淋球菌OMV(30μg蛋白；MS11菌株)加1μg IL-12/ms的鼻内免疫对BALB/c小鼠中的FA1090菌株的异源性淋球菌攻击感染的影响。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝8-9只小鼠)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比。
图27显示用淋球菌OMV(30μg蛋白；MS11菌株)加1μg IL-12/ms的鼻内免疫对BALB/c小鼠中的FA19菌株的异源性淋球菌攻击感染的影响。左图：淋病奈瑟菌的回收物(CFU)(平均值±SEM，N＝9只小鼠)；右图：每个时间点仍保持感染的动物的百分比。
具体实施方式
本发明基于我们的研究，这些研究有助于揭示淋病奈瑟菌防止免疫系统对其产生有效免疫反应的方式。这里，我们提供一种新颖的方法来克服淋病奈瑟菌抑制针对其免疫反应的能力。
在一个方面，方法包括通过给予来自淋病奈瑟菌的抗原制剂和存在于微球(ms)中的IL-12，来降低个体罹患淋病奈瑟菌感染的可能性。来自淋病奈瑟菌的抗原制剂的一个例子是OMV。OMV和IL-12ms可以阴道内递送。在一个实施方式中，OMV和IL-12ms可以鼻内递送。OMV和IL-12ms可以通过不同的给药途径递送。例如，可以一个为阴道内递送，另一个为鼻内递送。在一个实施方式中，OMV和IL-12ms通过相同的给药途径递送，例如鼻内。
在一个实施方式中，OMV和IL-12ms在相同组合物中递送。每剂的OMV和IL-12ms的量可以是引发免疫反应的量。OMV可以在每剂0.01至1mg蛋白的范围内。在一个实施方式中，OMV可以在每剂0.01至2mg蛋白的范围内。在实施方式中，OMV可以是每剂10、50、100、250、500、750、1,000、1250、1,500、1,750或2,000μg蛋白。在一个实施方式中，OMV可以在每剂15-300μg蛋白的范围内。在一个实施方式中，OMV剂量可以是50至1,000μg蛋白。对于70kg的人来说，这对应于约0.7至28微克蛋白/kg体重的OMV剂量。在一个实施方式中，OMV可以是0.5至30μg蛋白/kg体重。IL-12(微球中)可以是1至500μg/剂。这对应于约14ng至7μg/kg体重(假设体重70kg)。在一个实施方式中，IL-12可以是10ng至10μg/kg体重。在一个实施方式中，IL-12可以是10、50、100、200、300、400或500μg/剂。在一个实施方式中，IL-12可以是10至300ng或5至300ng/kg体重。在一个实施方式中，IL-12(微球中)可以是0.5至20微克/剂。可基于IL-12的载量来决定微球的量。组合物可以在载体、缓冲液等中提供，或者可以冻干。两种组分可以分开提供，并且可在临给药前组合，或者可以分开给药。在一个实施方式中，组合物不具有任何添加的游离可溶性IL-12。任何在给药前从微球漏出的IL-12都认为是不显著的。即使存在游离可溶性IL-12，也不认为其对本发明的效果和方法有贡献。相反，组合物中需要包封在微球中的IL-12来体现保护作用。
可以从淋病奈瑟菌的外膜制备外膜囊泡(OMV)。例如，可以从淋病奈瑟菌培养菌株的外膜制备OMV。OMV可以从在肉汤或固体培养基中生长的淋病奈瑟菌获得。该制备可以包括从培养基中分离细菌细胞(例如通过过滤或通过低速离心等)，裂解细胞(例如通过添加去污剂、渗透压、超声处理、空化、均质化等)，从胞质分子中分离外膜级分(例如通过过滤；或通过外膜和/或外膜囊泡的不同沉淀或聚集，或通过亲和分离方法；或通过高速离心)。
组合物优选以多剂给药，其间存在间隔。例如，可以至少一周的间隔给予至少两剂。间隔可以为一至三周。在一个实施方式中，以约2周的间隔采用两剂。
在一个实施方式中，本发明的IL-12制剂是缓释制剂。在一个实施方式中，IL-12掺入(本文中也称为包封或微包封)在聚合物微粒(本文中也称为微球)中进行递送。在一个实施方式中，微粒是可生物降解且生物相容性的。这种微球的制备技术是本领域已知的。参见例如美国专利号6,143,211、6,235,244、6,616,869和7,029,700，其中有关用于制备微球的方法和组合物的公开内容通过引用纳入本文。在一个实施方式中，采用相反转技术来制备微包封IL-12。通常，将可生物降解的聚合物溶解在溶剂(例如二氯甲烷或其他有机溶剂)中，然后通过向溶于溶剂的聚合物中添加微粉化的IL-12(即IL-12和赋形剂例如聚乙烯吡咯烷酮的冻干混合物)形成混合物。然后引入非溶剂(例如酒精或己烷)，导致自发形成微包封IL-12。可生物降解的聚合物的实例包括乳酸和乙醇酸的聚合物，聚酸酐，聚(原酸)酯，聚氨酯，聚(丁酸)，聚(戊酸)，聚(己内酯)，聚(羟基丁酸酯)，聚(丙交酯-乙交酯)共聚物和聚(丙交酯-己内酯)共聚物，以及天然聚合物。在一个实施方式中，微球由乳酸的聚合物(聚乳酸(PLA))组成。
在一个实施方式中，含IL-12的微球随着时间的推移通过水解而缓慢降解，释放出包封的IL-12。在使用前将微球悬浮，也可以将其递送到可接受的缓冲生理盐水溶液中。在一个实施方式中，例如在约4天的时间内缓慢释放IL-12可以连续刺激局部存在的免疫细胞，而不会将局部组织或循环中的IL-12浓度提高到有潜在危害的水平。微球由可生物降解的材料制成。在一个实施方式中，微球的水解产物是乳酸，是正常代谢的无害产物。PLA是可吸收缝线的组分，为此目的已使用了数十年，因此被认为是安全的。已知微包封IL-12在环境温度下稳定储存，并具有较长的保质期。
微球在10nm至10微米的范围内。微球可以悬浮在药学上可接受的介质、如生理缓冲液中。在一个实施方式中，IL-12的载量是0.1至10μg/mg颗粒。在一个实施方式中，载量是1至5μg的IL-12/mg颗粒。在一个实施方式中，载量约为2.5μg的IL-12/mg颗粒。
IL-12制剂可以导致治疗和/或预防效果的量使用。小鼠中观察到的有效剂量为1μg的IL-12。确定对人类有效的剂量在临床医生和其他参与治疗此类感染的个人的能力范围内。通常，给药量取决于各种因素，包括感染的严重程度，个体的体重、健康状况和年龄。这些因素可由临床医生容易地确定。在一个实施方式中，剂量可以是每天1μg至200μg的IL-12。在一些实施方式中，剂量是每剂1、5、10、15、20、50、75、100、125、150、175和200μg、以及1至200μg和其间所有范围内的所有整数的IL-12。如果与抗微生物剂联用，则所需剂量可以较少。
可以根据需要重复给药。例如，可以每天重复给药，在一天或更长间隔内重复多次，例如2-4天、每周或每月的间隔。在一个实施方式中，以1天至1个月(28、29、30或31天)的间隔、或超过该间隔的间隔、以及其间的所有间隔重复给药。可以根据需要重复治疗方案。在一些实施方式中，每2、3、4、5、6、7、10或14天或更长时间进行给药。
在一个实施方式中，本发明提供通过阴道内施用掺入聚合物微球中的IL-12来治疗女性对象中的生殖道感染的方法。可通过该方法治疗的感染包括细菌感染、真菌感染、寄生虫感染、病毒感染等。在一个实施方式中，量足以促进Th1驱动的针对引起感染的微生物的反应。在一个实施方式中，量足以提供针对病原微生物的治疗效果、预防效果或两者。本文所用术语“治疗”或“处理”是指减少或消除感染。当感染的根本原因减少时，认为感染减少了。
在一个实施方式中，本发明的方法可用于治疗生殖道感染，例如由细菌如淋病奈瑟菌引起的宫颈阴道感染。该方法包括提供掺入可生物降解的生物相容性微球中的细胞因子白介素12(IL-12)的局部(阴道内)施用的步骤。在一个实施方式中，剂量足以促进Th1驱动的针对淋病奈瑟菌感染的反应。在一个实施方式中，本发明提供通过IL-12微球的局部给药来治疗和/或预防宫颈阴道淋球菌感染(即淋病)的方法。不希望受任何特定理论的束缚，认为这种方法至少部分通过逆转淋病奈瑟菌干扰宿主免疫反应的能力来发挥作用。
在一个实施方式中，将IL-12制剂局部递送至个体的生殖道的粘膜表面。在一个实施方式中，个体在本方法开始前未曾接受IL-12，或未给予IL-12。在一个实施方式中，个体未通过任何其他给药方式接受IL-12。在一个实施方式中，制剂不含其他治疗剂、其他预防剂、或其他同时是治疗剂和预防剂的药剂。在一个实施方式中，制剂不含引起感染的微生物(例如以灭活形式)或来自其的抗原，并且尚未和/或不向个体给予灭活微生物或来自其的抗原。在另一实施方式中，制剂可以递送至已经接受过生殖道感染(例如淋球菌感染)的治疗(IL-12除外)的个体。
在一个实施方式中，本发明还包括向个体给予抗微生物剂的步骤。例如，在一个实施方式中，本发明的方法包括如下步骤：鉴定患有或已被诊断患有生殖道感染的个体，将包含治疗有效量、预防有效量或治疗和预防有效量的组合物的组合物局部(例如阴道内)递送至生殖道，该组合物在可生物降解的聚合物微球中包含IL-12，并且任选地向个体给予一种或多种抗微生物剂(例如抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂)。抗微生物剂可以在给予IL-12制剂之前、之时或之后给药。这种治疗的实例是给予抗菌剂如抗生素。适合用于生殖道感染的抗生素的实例包括氟喹诺酮类，头孢菌素类，阿奇霉素，头孢曲松，强力霉素和头孢克肟。
在一个实施方式中，本文所述的微包封IL-12的给予减少淋病奈瑟菌感染。在一个实施方式中，感染被消除。可以通过常规的微生物学方法(例如培养和检测)来检测感染存在与否或感染水平。在一个实施方式中，可以通过取得阴道拭子并检测细菌的存在(例如通过形成菌落的能力)，或者通过核酸扩增方法，来检测感染。
在另一个实施方式中，本文所述的微包封IL-12的给予减少淋病奈瑟菌感染，并减少微包封IL-12的治疗停止后淋病奈瑟菌反复感染的风险。不希望受任何特定理论的束缚，认为IL-12的预防效果是通过刺激免疫系统而实现的。在一个实施方式中，IL-12的给予不显著提高全身循环中IL-12的水平。在一个实施方式中，IL-12的血清水平不提高至高于50皮克/ml。
对于阴道内应用，本发明的制剂可以施用于充当载体的制品来递送。例如，可以将制剂掺入插入物、涂药器、片剂、栓剂、阴道环、阴道海绵、棉条等之中或之上，然后通过这些进行递送。制剂还可以以液体、乳膏、凝胶、洗剂、软膏、糊剂、喷雾剂等形式递送。
药物制剂可以任选地包含药学上可接受的载体、缓冲剂、稀释剂、增溶剂或乳化剂以及各种盐。这样的添加剂为本领域熟知。参见例如雷明顿药物科学(Remington'sPharmaceutical Sciences),第18版,(1990,宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(MackPublishing Company)18042)。
局部施用本文所述的微包封IL-12的优点在于，其可提供持续效果，并同时避免潜在的全身毒性问题。
在一个实施方式中，本发明用于治疗生殖器沙眼衣原体感染(衣原体感染症)。衣原体感染症是另一种性传播疾病(STD)，其发病甚至比淋病更常见，并且是美国最常报道的传染病，认为每年影响多达300万人(全球>9200万)。它也是女性的盆腔炎疾病及其后遗症(不孕症和异位妊娠的风险)的主要原因。因此，在一个实施方式中，采用掺入聚合物微球中的IL-12的局部(阴道内)施用来促进局部Th1免疫反应，以针对沙眼衣原体进行治疗和预防。在一个实施方式中，本发明的方法用于治疗由淋病奈瑟菌和沙眼衣原体引起的泌尿生殖器感染。这在STD门诊中可能是有利的，因为淋病和衣原体感染症的迹象和症状相似，而且鉴别诊断可能依赖于确定病原微生物。而且，两者的混合感染也很常见。在其他实施方式中，也可以用微包封IL-12的(阴道内)施用来治疗其他生殖道感染，以提高针对其的局部免疫力。
在其他实施方式中，将微包封IL-12的局部施用应用于治疗其他局部粘膜感染，其中，正常的免疫反应不足以消除该局部粘膜感染。实例包括：支气管炎和慢性阻塞性肺病(呼吸道)，中耳炎(中耳感染，这是美国儿科就诊的最常见原因)，幽门螺杆菌感染(导致胃溃疡并可能导致胃癌)，以及可能是牙周疾病(从35岁开始困扰大多数成年人，并且是成年人牙齿脱落的主要原因)。
在一个实施方式中，IL-12可以与含有淋球菌抗原的疫苗一起给药。例如，IL-12可以与非活淋球菌疫苗一起局部给药。如实施例3中所述，我们已经在一起给予或不给予IL-12/ms的情况下用淋球菌外膜囊泡(OMV)制剂对小鼠进行了i.vag免疫。OMV包含大多数天然构型的表面抗原，不会因加热或化学灭活而变性。结果表明，Th1驱动的抗体依赖性保护性免疫反应的产生可持续至少几个月，并且对淋病奈瑟菌的抗原性不同的菌株有效。如实施例4中所述，也可以通过鼻内途径进行免疫。
OMV和IL-12微球可以给予女性或男性对象。给予男性对象时，组合物可以鼻内递送，给予女性对象时，组合物可以阴道内和/或鼻内递送。
提供下列实施例以进一步说明本公开。这些实施例的意图不是限制性的。
实施例1
本发明已在阴道淋球菌感染的小鼠模型中得到证明。小鼠模型的详情可见于Jerse,Infect.Immun.67:5699-5708；1999。
与给予空白微球的对照小鼠相比，在淋病奈瑟菌初次阴道感染(第0天)的第0、2和4天用IL-12微球(1μg)对小鼠进行阴道内治疗可加快感染的清除(参见图1)。
图1显示用包封在PLA微球中的1μg IL-12进行的阴道内治疗(第0、2和4天)对小鼠中淋病奈瑟菌阴道感染过程的影响。数据以从每天采集的阴道拭子回收的淋病奈瑟菌的cfu的平均值±SEM表示，每组N＝8只小鼠。对照小鼠给予空白微球。在第14天用抗生素治疗小鼠，然后休息以备继发性感染(参见图2)。
对在初次阴道淋球菌感染期间用IL-12微球进行治疗的小鼠进行恢复、在第14天用抗生素(头孢曲松)进行治疗、休息、然后在一个月后用淋病奈瑟菌再感染时，与在初次感染期间给予空白微球的对照小鼠相比，继发性感染被更快地清除。一般来说，认为继发性感染以与初次感染相同的动力学被清除，并且只产生很少或不产生抗体反应。
图2显示在淋病奈瑟菌的初次感染期间用IL-12微球进行的阴道内治疗(参见图1)对小鼠中淋病奈瑟菌继发性阴道感染过程的影响。对照小鼠给予空白微球。数据以从每天采集的阴道拭子回收的淋病奈瑟菌的cfu的平均值±SEM表示，每组N＝8只小鼠。
进一步，将用微包封IL-12(IL-12微球)进行的阴道内治疗对淋病奈瑟菌的小鼠生殖道感染过程的影响与可溶性IL-12的影响进行比较。为此该目的，在淋病奈瑟菌感染后第0、2、4、6、8和10天在一组8只小鼠中以(溶于无菌磷酸盐缓冲生理盐水的)游离可溶形式阴道内滴注1μg的IL-12(即每隔一天，直至感染被清除)，以便与用IL-12微球治疗的小鼠和仅用载剂治疗的对照组小鼠直接进行比较。用IL-12微球治疗的小鼠在7天内清除了感染，明显快于对照组，而用可溶性IL-12治疗的小鼠以与对照组相同的速度清除感染(参见图3)。数据以从每天采集的阴道拭子回收的淋病奈瑟菌的cfu的平均值±SEM表示，每组N＝8只小鼠。
结果显示，如上所述，可溶性IL-12的局部阴道内治疗对感染过程没有影响，而IL-12微球加快清除。
实施例2
本实施例描述了另一套实验，其显示IL-12微球的阴道内施用对淋病奈瑟菌阴道感染的有效性。
材料和方法
小鼠：BALB/c小鼠购自杰克逊实验室(Jackson Laboratories)(缅因州巴尔港)，并维持在布法罗大学实验动物设施的标准条件下。所有动物所采用的方案已由布法罗大学(University at Buffalo)的机构动物护理和使用委员会批准。
细菌：淋病奈瑟菌FA1090在补充有血红蛋白和增菌培养基
(BD诊断系统公司(BD Diagnostic Systems)，新泽西州富兰克林湖)的GC琼脂上培养。检查生长以检查菌落形态是否与Opa蛋白和菌毛表达一致，并从平板上收获淋球菌并测定细胞密度。Opa表达为：Opa A、B/D/G、E/K。
微球：如下所述采用相反转纳米包封(PIN)技术将细胞因子包封到聚乳酸(PLA)微球中。简而言之，将重组IL-12(小鼠或人)与包括蔗糖(0.1％，w/w)和聚乙烯吡咯烷酮的赋形剂在水中混合，然后冻干。将冻干的材料溶解在叔丁醇(TBA)中，并与溶解在TBA中的聚乳酸(PLA)Resomer混合(对于微粉化的IL-12和PLA溶液，体积比为1：3)。然后，将该溶液倒入100倍体积的己烷中，以诱导颗粒形成。然后，将颗粒过滤并冻干。制造了三种制剂：(a)不含细胞因子或抗体的对照微球；(b)小鼠IL-12(0.25μg/mg颗粒)；和(c)小鼠IL-17(0.25μg/mg颗粒)。
小鼠阴道感染模型：如上所述，在第0天用活淋病奈瑟菌FA1090阴道感染7至9周龄的雌性小鼠。每天在补充有选择性抗生素的GC琼脂上定量培养阴道粘液，以确定细菌定殖量。检测限为每只小鼠100CFU回收物。从第0天到第8天，每两天给予微球制剂进行阴道内治疗，方法是滴注含IL-12或IL-17的微球或对照微球在PBS中的40μl悬浮液。
细胞分离和流式细胞术：处死小鼠，无菌切除腹股沟淋巴结(ILN)和生殖道。将ILN在Hanks缓冲盐溶液中拨弄以释放细胞。通过酶消化制备阴道单细胞悬浮液。分离的细胞用染色缓冲液洗涤两次，然后与所示抗体在冰上孵育30分钟，洗涤两次，并在FACSCalibur细胞仪上进行分析。为了确定细胞内细胞因子的表达，用蛋白质转运抑制剂佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯-离子霉素-
(eBioscience，加利福尼亚州圣迭戈)再刺激细胞5小时，然后用CYTOFIX/
固定/通透溶液(eBioscience)固定。与异硫氰酸荧光素、藻红蛋白或别藻蓝蛋白偶联的小鼠CD4、CD8、CD19、CD11b、CD11c、NKG2D、Gr-1、IFN-γ、IL-4和IL-17A的抗体购自eBioscience。
细胞因子ELISA：用购自eBioscience的ELISA试剂盒一式三份地测定血清或阴道洗液样品中的IL-12p70、IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-17A水平。
实时RT-PCR：使用
RNA纯化迷你试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州瓦伦西亚)分离从小鼠收获的整个阴道的总细胞RNA，并使用ISCRIPTTM cDNA合成试剂盒(伯乐公司(Bio-Rad)，加利福尼亚州赫拉克勒斯)转录为cDNA。使用
绿色染料(荧光染料)(伯乐公司)在ICYCLER
实时PCR检测系统(伯乐公司)上进行实时RT-PCR，以实时监测PCR。基于由伯乐公司IQTM 5光学系统软件确定的阈值循环(Ct)分析目标基因的相对定量。
血清和粘膜抗体的检测：在接种后第15天从单个小鼠收集唾液、阴道洗液和血清样品。通过ELISA检测唾液、血清和阴道洗液中的淋球菌特异性IgA、IgG和IgM以及分泌物中的总IgA、IgG和IgM浓度。
统计学分析：数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示。使用重复测量方差分析(ANOVA)分析了载有IL-12、IL-17、抗TGF-β、抗IL-10的微球和空白微球治疗对阴道淋病奈瑟菌感染的影响之间的对比的数据，使用Bonferroni校正了成对比较的事后检验。Kaplan-Meier分析和对数秩检验也用于比较感染清除率。通过非配对双尾t检验分析了来自体外实验的数据，以比较两个选定组之间的平均值。P<0.05被认为具有统计学显著性。
结果
IL-12微球的阴道内给药保护小鼠不受生殖道淋病奈瑟菌感染。为了考察载有IL-12的微球的治疗效果，用淋病奈瑟菌感染多组雌性BALB/c小鼠，并且每天通过阴道拭子培养监测细菌负荷。初步剂量范围实验显示，相对于用空白微球进行的治疗，每两天阴道内滴注含1.0μg IL-12的微球足以加快感染的清除；用2.0μg的微包封IL-12不能进一步提高清除率，并且较低剂量的效果逐渐降低(图4A)。
未经治疗或用空白微球进行治疗的小鼠在约15天内清除了感染(图4B、C)。以最佳剂量1.0μg阴道内滴注的微包封IL-12从第4天开始显著降低了可回收的淋病奈瑟菌负荷，这些小鼠比用空白微球进行治疗或未经治疗的小鼠提前7、8天清除了感染(图4B、C)。在第7天停止治疗后，感染没有复发。相反，游离的可溶性IL-12的阴道内给药完全不能提高淋病奈瑟菌的清除率(图4B、C)。
以最佳剂量(1.0μg)阴道内给予的载有IL-17的微球也加快淋病奈瑟菌感染的清除，但程度比按相同时间表给予的IL-12微球要小(图4B、C)。
用IL-12微球进行的治疗提高对阴道淋球菌感染的Th1和抗体反应。为了阐明IL-12的治疗作用的潜在机制，我们在用载有IL-12的微球或空白微球进行治疗的小鼠中表征了对生殖器淋球菌感染的局部免疫反应。在用淋病奈瑟菌或仅用载剂接种后第3、5、7和14天，从每组7只小鼠的ILN和阴道制备单细胞悬浮液，用于通过流式细胞术进行评估，以检测细胞内IFN-γ、IL-4和IL-17。从接种后第3天开始，在局部引流ILN中观察到IL-17+/CD4+T细胞，在第5天产生峰值，并在感染期间持续。在第5天，对照治疗的受感染小鼠的ILN中约有22％的CD4+T细胞是IL-17+，而IFN-γ+仅有约3.5％，并且检测到的IL-4+/CD4+T细胞很少(图4D)。IL-12微球治疗显著增强了针对淋病奈瑟菌的Th1免疫反应，这可通过IFN-γ+/CD4+T细胞数量的显著增加来表明(图4D)。相反，IL-12微球不改变Th2或Th17反应，因为治疗组之间的ILN中IL-4+/CD4+和IL-17+/CD4+T细胞的数量相似(图4D)。RT-PCR分析显示，在IL-12微球治疗后，受感染小鼠的阴道中的IFN-γ表达升高，但IL-4或IL-17mRNA表达没有升高(图4E)。尽管IL-17微球改善了淋球菌感染，但该治疗与Th1或Th2反应的增强无关(图4D、E)，Gr-1+中性粒细胞向生殖道的流入增加(图4F)。
我们还通过ELISA测定了接种后第7天收集的阴道洗液和血清中的IL-12p70、IFN-γ、IL-4和IL-17浓度。在用IL-12微球进行治疗的受感染小鼠的阴道洗液中检测到IL-12(176.5±48.6pg/ml)。在这些小鼠的血清中发现低水平的IL-12(41.7±10.7pg/ml)，这表明IL-12微球治疗对淋球菌感染的影响并非主要由于细胞因子进入循环。与流式细胞术研究一致，在用IL-12微球进行治疗的受感染小鼠的阴道洗液(32.6±9.8pg/ml)和血清(43.3±11.5pg/ml)中存在IFN-γ，但未检测到IL-4和IL-17。在对照治疗的受感染小鼠中未检测到任何这些细胞因子。
IL-12可以以IFN-γ依赖性方式或直接刺激体液免疫反应。因此，我们确定了在淋病奈瑟菌感染期间IL-12微球治疗是否导致接种后第15天收集的阴道洗液、唾液和血清中产生抗淋球菌抗体。IgM抗体水平低，实验组之间差异很小(数据未示出)。在任何一组小鼠中均未检测到唾液淋球菌特异性抗体(数据未示出)。对照治疗小鼠的淋病奈瑟菌感染并未在阴道洗液或血清中显著提高淋球菌特异性IgA或IgG抗体。然而，IL-12微球治疗增加了阴道和血清特异性IgG抗体(图4G、H)以及阴道特异性IgA抗体(图4G)的产生。
用IL-12微球进行的治疗诱导针对继发性淋病奈瑟菌感染的保护性记忆性免疫。我们进一步检测了IL-12微球治疗是否导致产生免疫记忆和针对再感染的保护性免疫力。感染淋病奈瑟菌的小鼠组用载有IL-12的微球或空白微球进行治疗，并且在感染过程进行后，在第15天用头孢曲松(300μg i.p.)治疗小鼠，以确保完全消除淋球菌。用IL-12微球进行治疗的另一组假感染的小鼠用于评估在没有感染的情况下IL-12可能的持续作用。五至六周后，所有小鼠均接种相同菌株的淋病奈瑟菌，而无进一步治疗。如先前观察到的，对照治疗小鼠的初次感染不能保护其免受后续的继发性攻击：在先前经空白微球治疗的小鼠中，继发性淋球菌感染的持续时间和细菌负荷与年龄相匹配的原初
小鼠的初次感染相同(图5A、B)。相反，在初次感染期间用载有IL-12的微球进行的阴道内治疗保护小鼠免受继发性感染：在初次感染期间用IL-12微球进行治疗的再感染小鼠比对照更有效地抵抗了攻击(图5A、B)。然而，先前对假感染小鼠的IL-12微球治疗并未诱导针对后续感染的保护(图5A、B)。该结果还排除了任何持久性微球仍影响继发性淋病奈瑟菌感染的可能性。
分别在继发性感染的第5天和第3天对ILN细胞和阴道进行流式细胞术和RT-PCR分析，表明先前的IL-12微球治疗对继发性淋球菌感染的保护作用也与Th1(IFN-γ)反应的显著增强有关(图5C、D)。用淋病奈瑟菌再攻击后，经IL-12微球治疗的小鼠中也有强烈的特异性二次抗体反应。预先用IL-12微球治疗的再感染小鼠的阴道洗液中的淋球菌特异性IgA和IgG抗体以及血清中的IgG抗体显著高于对照组(图5E、F)。
与IL-12微球治疗的效果相反，在初次淋球菌感染期间用IL-17微球进行的治疗未导致对继发性淋球菌感染的任何保护性免疫，也未诱导任何记忆性T细胞或抗体反应(图5A-F)。
实施例3
本实施例描述了本实验疫苗在鼠模型中诱导Th1驱动的免疫反应和对淋病奈瑟菌感染的抗性。
结果
用淋球菌OMV加IL-12/ms进行的小鼠阴道内免疫加快淋病奈瑟菌的攻击感染的清除。用淋球菌OMV(FA1090菌株；40μg蛋白)加IL-12/ms(1μg IL-12)、或用OMV加对照(空白)ms i.vag免疫多组8只雌性BALB/c小鼠；用IL-12/ms或单独用空白ms假免疫另外两个对照组。1周和2周后重复免疫，并且在又过了2周后通过i.vag滴注淋病奈瑟菌FA1090(5x106CFU)来攻击所有小鼠。对照(假免疫)小鼠或用OMV加空白ms免疫的小鼠在攻击后第7天开始清除感染，并在第15天全部清除；中位清除天数为10-13。这三个对照组之间的清除速度无显著差异(图6a)。但是，用OMV加IL-12/ms免疫的小鼠从第6天开始清除感染，并在第9天全部清除；中位清除＝7.5天，相比之下，用OMV和空白ms免疫的小鼠中的中位清除为12天(P<0.01，Kaplan-Meier；表1和图6a)。再重复该实验两次，结果相似(参见表1和图13)。该发现的进一步的重复实例可以在以下报道的后续实验中看到，例如图6d、9、10a和c(以及关于其他淋球菌菌株的图10b、d和e)以及图12a、b、f和g(C57BL/6小鼠)。
表1：来自采用同源性攻击的免疫实验的汇总数据(BALB/c小鼠)。
在清除后(终止时，接种后第15天)收集的血清和阴道洗液样品通过ELISA检测针对完整淋球菌(FA1090)的抗体。这表明用OMV加IL-12/ms免疫的小鼠产生了最高水平的阴道和血清IgG和IgA抗体，而用OMV加空白ms免疫的小鼠产生的这些抗体水平要低得多(图6b)。未免疫和假感染的小鼠在起始稀释度下在检测背景之上未能检测到抗体，并且单独用空白ms免疫并感染的小鼠也未产生可检测的抗体(图6b)。对同时收集的腹股沟淋巴结(ILN)单核细胞进行表面CD4表达和细胞内细胞因子的染色，并通过流式细胞术进行分析。这表明只有用OMV加IL-12/ms免疫的小鼠才能产生CD4+/IFNγ+(和CD8+/IFNγ+)T细胞，而没有小鼠产生大量的CD4+/IL-4+T细胞(图6c；也参见图14)。但是，不论免疫与否，感染淋病奈瑟菌的所有小鼠均产生CD4+/IL-17+T细胞(图6c和图14)。
进行进一步实验以确定诱导对感染的免疫抗性所需的最小免疫次数。i.vag给予单剂的OMV加IL-12/ms不能始终如一地产生攻击抗性，但以2周的间隔给予两剂的OMV(40μg蛋白)加IL-12/ms(1μg IL-12)足以诱导相似的感染抗性，中位清除＝8天(图6d；表1)。另外，用由非典型流感嗜血杆菌(NTHI)制备的OMV加IL-12/ms进行的对照免疫未能诱导对淋病奈瑟菌的抗性；中位清除＝13天(图6d；表1)。这诱导了针对NTHI的抗体，但不诱导针对淋病奈瑟菌的抗体(图15a和b)，并在ILN中产生了产生IFNγ的CD4+和CD8+细胞(图15c)。
用淋球菌OMV加IL-12/ms的阴道内免疫诱导持续的淋球菌特异性抗体反应和Th1细胞反应。为了表征用1、2或3剂的淋球菌OMV加IL-12/ms免疫后及攻击前的局部和全身免疫反应，在末次攻击后2周从经免疫的小鼠和对照小鼠收集血清、阴道洗液和ILN。血清抗淋球菌IgM抗体水平低，实验组之间差异很小。在单独给予空白ms的小鼠的阴道洗液或血清样品中，在背景之上未能检测到IgA和IgG抗体。用3剂淋球菌OMV加空白ms的阴道内免疫提高了阴道和血清抗淋球菌IgA和IgG抗体的水平，但程度比用OMV加IL-12/ms进行的免疫要低(图7a)。相反，用一剂OMV加IL-12/ms的免疫在血清和阴道洗液中诱导了低水平的抗淋球菌抗体；第二剂增加了抗体的产生，但是在3剂后未见进一步的提高(图7a)。抗体似乎对淋病奈瑟菌具有特异性，因为在针对大肠杆菌或NTHI的对照水平之上未检测到该抗体。阴道洗液和血清中IgG亚类抗体的检测均显示IgG2a占优势，IgG1和IgG2b的量较少，而IgG3的水平低(图16)。阴道洗液和血清中抗淋球菌IgA和IgG抗体的产生在用2剂的OMV加IL-12/ms免疫后3个月达到峰值，并且在免疫后6个月仍可检测到(图7b和c)。
ILN细胞的流式细胞术分析表明，与对照小鼠相比，用OMV加IL-12/ms免疫的小鼠的IFNγ+/CD4+和IFNγ+/CD8+T细胞的数量增加(图8a)。从抗体反应中可以看出，一次免疫足以诱导IFNγ的产生，而通过两次免疫又有进一步提高；3剂没有进一步增加它。相反，相对于对照，用OMV加IL-12/ms的免疫未显著增加IL-4+/CD4+和IL-17+/CD4+T细胞的数量(图8a)。为了确定诱导的IFNγ+/CD4+(和IFNγ+/CD8+)T细胞是否对淋球菌抗原具有特异性，将从ILN分离的CD4+细胞预装CFSE，在带有淋球菌OMV的抗原呈递细胞的存在下，或以无刺激为对照，在体外培养3天，并通过流式细胞术评估其增殖。与来自对照小鼠的细胞相比，免疫小鼠的ILN的CD4+细胞在体外对刺激作出反应，明显增殖得更多，并产生明显更多的IFNγ(图17a)。未见IL-4的产生，但是IL-17是由用淋球菌OMV培养的CD4+T细胞产生的(图17a)。免疫后4个月，ILN CD4+T细胞的IFNγ产生水平尽管缓慢下降，但仍保持高水平(图8b)。
另外，在末次免疫后3天，从安乐死的小鼠切除阴道，并从整个组织中提取RNA。RT-PCR分析显示，与对照相比，用淋球菌OMV加IL-12/ms的免疫显著增强了IFNγ的mRNA表达，但未增强IL-4或IL-17的mRNA表达(图17b)。用淋球菌OMV加IL-12/ms的i.vag免疫后长达2个月，阴道组织中的IFNγmRNA表达和由ILN CD4+细胞产生的IFNγ仍保持高水平(图17c)。这些发现支持了从来自引流ILN的细胞获得的细胞因子表达结果。
疫苗诱导的感染抗性的持续时间。为了评估免疫抗性的持续时间，将多组8只小鼠用淋球菌OMV加IL-12/ms免疫，并在免疫后2、4或6个月用相同的淋病奈瑟菌菌株(FA1090)攻击。与经假免疫或用OMV加空白ms免疫的年龄匹配的对照相比，用OMV加IL-12/ms免疫的小鼠在免疫后2或4个月受到攻击时对淋病奈瑟菌有抗性；对照中的中位清除＝11-11.5天，相比之下，经免疫的小鼠中为7天(表1＝补充表1)。在免疫后6个月对小鼠进行攻击时，在重复实验中获得了相似的结果；对照中的中位清除＝9.5-10天，相比之下，用OMV加IL-12/ms免疫的小鼠中为6.5天(图9；表1)。终止后，在血清和阴道洗液中检测到抗淋球菌抗体(图18a和b)。ILN中存在分泌IFNγ-(但不是IL-4-)的CD4+T细胞(图18c)。值得注意的是，攻击后检测到的抗体和IFNγ反应高于攻击前(与图7b、c和8b相比)，暗示记忆的唤醒。如先前所观察到的，无论是何种免疫，在淋病奈瑟菌攻击后总会发现分泌IL-17的T细胞(图18c)。没有评估更长的时间，因为随着年龄的增长，小鼠对淋球菌感染的抗性越来越强。
免疫诱导对淋病奈瑟菌异源性菌株的抗性。对于任何疫苗的一项重要考量是，其应当有效地抵抗病原体的不同菌株以及免疫菌株具有抗原同源性的菌株。淋病奈瑟菌的抗原变异性是众所周知的，通过多种分子机制牵涉到其绝大多数表面抗原。因此，我们确定了用一株淋球菌OMV进行i.vag免疫是否能有效地抵抗其他菌株的攻击，其程度与相同菌株的攻击相似。首先，对小鼠(每组8只)用由FA1090菌株制备的OMV加IL-12/ms或空白ms进行i.vag免疫，一个月后用淋病奈瑟菌FA1090或MS11菌株(5x 106CFU)攻击。用FA1090 OMV的免疫以相似的程度诱导了对FA1090或MS11的攻击的抗性(图10a；表2)。攻击和清除后，针对MS11的抗体升高至相似的水平，并且由ILN中的IFNγ+/CD4+T细胞表示的Th1反应有类似的增强(图19a、b和c)。以相应的方式，用MS11 OMV(加IL-12/ms)的免疫诱导了对FA1090菌株的攻击的抗性(图10b；表2)。
表2：来自采用异源性攻击的免疫实验的汇总数据(BALB/c小鼠)。
淋球菌菌株FA1090和MS11都具有相同主要类型(PorB.1B)的孔蛋白，尽管为不同的亚型。因此，为了确定主要孔蛋白类型是否是免疫抗性所必需的，用FA19菌株(PorB.1A)进行了进一步实验。用FA1090 OMV(加IL-12/ms)的免疫诱导了对FA19攻击的抗性(图10c；表2)。终止时检测到的抗体反应显示出对FA19的交叉反应性，并且ILN中的IFNγ+/CD4+T细胞升高(图19d、e和g)。相应地，用FA19 OMV的免疫诱导了对菌株FA1090的攻击的抗性(图10d；表2)。其他的免疫和攻击组合(即针对FA19的MS11，反之亦然)同样显示出相似的交叉抗性(表2)。
自最初分离以来，淋病奈瑟菌FA1090、MS11和FA19菌株就已在许多实验室中广泛使用并广泛传代培养。结果，它们可能已获得突变并在一些特性上发生了变化。因此，我们还用新的临床菌株对经免疫的小鼠进行了攻击，这些菌株自分离以来极少在体外传播。用FA1090 OMV加IL-12/ms免疫的小鼠对临床分离物GC68(PorB.1B菌株；图10e；表2)和GC69(PorB.1A；表2)的攻击也具有抗性。
免疫诱导的抗体所靶向的抗原。通过一维(1D)SDS-PAGE检查时，FA1090、MS11和FA19 OMV的蛋白质谱相似，但具有明显的定量和定性变化(图11a)。来自用FA1090 OMV加IL-12/ms免疫的一只小鼠(1号)的血清的、针对通过SDS-PAGE分离的FA1090、MS11或FA19OMV的Western印迹分析表明，IgG抗体与迁移至约35-80kDa的条带反应，对来自所有三个菌株的OMV中存在的条带具有反应性(图11b，泳道2-4)。约35kDa处的这些条带之一可能对应于孔蛋白，因为H5抗体与类似迁移率的条带反应(图11b，泳道6)。另一份血清(2号)对迁移至约45-65kDa的三条条带显示出强反应性(图11b，泳道5)。为了鉴定约45-65-kDa抗原，我们使用了免疫蛋白质组学方法，包括OMV的二维(2D)SDS-PAGE分离和平行2D SDS-PAGE，然后进行免疫印迹(2D-免疫印迹)和质谱分析。Flamingo染色揭示的OMV的三个2D蛋白质图谱显示，FA1090、MS11和FA19菌株之间的蛋白质种类繁多，并且OMV蛋白质组存在显著差异(图11c、d和e)。相反，印迹的蛋白质图谱显示两个质量斑点(斑点1和斑点2)，分别对应于45kDa和43kDa以及pI 5.2和5.5(FA1090 OMV；图11c)，或者显示一个质量斑点(斑点1)，具有约45kDa的质量和pI 5.2(MS11和FA19 OMV；图11d和e)。从斑点1和斑点2获得的胰蛋白酶肽的质谱分析(图11c，d和e)分别显示了翻译延伸因子-Tu(EF-Tu)和推定的周质多胺结合蛋白PotF3作为最佳匹配(表3)。EF-Tu似乎是最可靠的抗原，因为它在所有三个2D免疫印迹中均具有免疫反应性，并且在所有OMV制剂中均具有最高的置信度(得分从485.0至947.1)和覆盖率(64.2至90.6)(表3)。
对淋病奈瑟菌的免疫抗性依赖于IFNγ和抗体。为了确定用OMV辅以IL-12/ms进行免疫的保护作用是否依赖于IFNγ或抗体反应，或者还是依赖于由CD4+或CD8+T细胞控制的免疫力，我们使用IFNγ(IFNγ-ko)B细胞(μMT)、CD4+T细胞(CD4-ko)或CD8+T细胞(CD8-ko)缺陷的突变C57BL/6小鼠进行了免疫实验。用FA1090 OMV加IL-12/ms或空白ms免疫多组8只C57BL/6野生型(对照)和免疫缺陷小鼠，并在一个月后用淋病奈瑟菌FA1090(5x 106CFU)进行攻击。相对于野生型对照，未免疫的免疫缺陷小鼠中的阴道淋球菌感染过程没有改变。从第7-11天开始，所有野生型和免疫缺陷小鼠都开始降低可回收的淋球菌负荷，并在第12-14天(中位数9-13天)清除了感染，类似于先前部分所述实验中使用的BALB/c小鼠(图12a、b、f和g；表4)。
表4：来自采用免疫缺陷小鼠的免疫实验的汇总数据(C57BL/6背景)
与野生型小鼠相反，与用OMV加空白ms的免疫相比，用OMV加IL-12/ms免疫的IFNγ-ko或μMT小鼠中淋球菌感染的清除没有加速(图12a和b；表4；图20a和b)。因此，IFNγ或B细胞的缺陷消除了IL-12/ms在产生对生殖器淋球菌感染的免疫抗性中的辅助作用。在野生型小鼠中，由OMV加IL-12/ms诱导的淋球菌特异性阴道和血清IgA和IgG抗体的产生在IFNγ-ko小鼠中被消除了(图12c和d)，并且正如预期的那样，没有由经免疫的IFNγ-ko小鼠的ILN细胞产生IFNγ(未示出)。同样，在μMT小鼠中也没有检测到对免疫的抗体反应(未示出)。相反，用淋球菌OMV加IL-12/ms免疫的μMT小鼠的ILN中的IFNγ+/CD4+T细胞数量没有受到影响，没有IL-4反应，而IL-17反应保持不变(图10e＝图5e)。这些发现表明，通过淋球菌OMV加IL-12/ms的免疫诱导的抗性依赖于IFNγ和B细胞，后者可能产生淋球菌特异性抗体。
与野生型对照相比，用淋球菌OMV加IL-12/ms免疫的保护作用在CD4-ko中不完全减弱，在CD8-ko小鼠中也部分减弱(图12f和g；表4；图20c和d)。这些发现表明，对CD4+T细胞产生免疫抗性的需求可能会被其他也产生IFNγ的细胞(包括CD8+或NK细胞)部分补偿。但是，CD8+细胞对于保护性免疫似乎并不那么重要。
讨论
我们首次证明了，完整的哺乳动物免疫系统能可靠地产生疫苗诱导的生殖器淋球菌感染免疫抗性状态。这种免疫状态似乎依赖于由B细胞产生的抗体，以及主要由CD4+T细胞产生的IFNγ。用淋球菌OMV加IL-12/ms作为佐剂的小鼠i.vag疫苗接种诱导了针对淋球菌抗原的血清和阴道IgG和IgA抗体以及引流ILN中分泌IFNγ的CD4+和CD8+T细胞。免疫后，Th1细胞和抗体反应均持续数月，并且能够引发对淋病奈瑟菌攻击的抗性至少6个月，并唤醒免疫记忆。单独用淋球菌OMV的i.vag免疫，无论是不使用佐剂还是使用对照(空白)ms，都只诱导了较弱的抗体反应，没有可检测的IFNγ产生，并且对攻击感染没有明显的抗性。用由NTHI制备的OMV加IL-12/ms的对照免疫，尽管诱导了IFNγ反应，但不会产生免疫抗性或与淋病奈瑟菌交叉反应的抗体。因此，尽管对于抵抗淋病奈瑟菌而言IFNγ似乎是必需的，但没有特异性抗体是不够的。
我们在这里报道，作为淋球菌OMV疫苗的佐剂i.vag给予IL-12/ms，生殖器淋球菌感染过程的明显缩短，这表明可增强Th1驱动的保护性免疫。应强调的是，游离可溶性IL-12是无效的，并且对OMV的辅助作用需要包封在ms中的IL-12。
鉴于淋病奈瑟菌显示的众所周知的和广泛的抗原变异，扩展至异源性菌株的抗性以及针对制备OMV疫苗的同源性菌株的抗性是出乎意料的。我们的结果显示，用源自FA1090菌株的OMV免疫同样很好地增强对MS11和FA19菌株的抗性，反之亦然，并且除这些“实验室菌株”外，抗性还扩展到淋病奈瑟菌的临床分离物。在主要的淋球菌表面抗原中，我们知道FA1090、MS11和FA19的不同之处在于它们的孔蛋白(PorB)分子不同。FA1090和MS11具有不同亚型的PorB.1B，FA19具有PorB.1A(Elkins等,Mol.Microbiol.14,1059-1075(1994))。尽管没有很好地表征，但它们的基因组中编码的Opa蛋白却有所不同(Hobbs等,Front.Microbiol.2,123(2011),Cole等,PLoS One 4,e8108(2009)，并且它们的LOS不同(Erwin等,J.Exp.Med.184,1233-1241(1996))。Opa蛋白和LOS聚糖链也是可相变的，导致表达不同的抗原表位(Apicella,M.A.等，淋病奈瑟菌脂寡糖的表位表达中的表型变异(Phenotypic variation in epitope expression of the Neisseria gonorrhoeaelipooligosaccharide).Infect.Immun.55,1755-1761(1987))。
与交叉保护性免疫一致，通过免疫诱导的抗体的ELISA分析表明，关于血清和阴道洗涤液中的IgG和IgA，针对不同菌株均可检测到在定量上相似水平的抗体。抗体似乎对淋病奈瑟菌具有特异性，因为未检测到针对大肠杆菌或NTHI的抗体，并且也不是通过用由NTHI制备的OMV进行免疫而产生的。然而，血清IgG抗体的Western印迹分析揭示了淋病奈瑟菌不同菌株之间共有抗原的证据。迁移至45-65kDa的条带以比主要淋球菌外膜蛋白(例如孔蛋白和Opa，在30-40kDa范围内)更高的分子量迁移。
我们的研究鉴定了两种新型淋球菌候选疫苗，FA1090、MS11和FA19 OMV中的EF-Tu，以及FA1090中的PotF3。这两种蛋白质均已在细胞包膜的定量蛋白质组分析和源自四种常见淋球菌分离物的OMV中鉴定出来(Zielke等,Molec.Cell.Proteomics 13,1299-1317(2014))。EF-Tu特别令人感兴趣，因为在两个斑点和所有分析的OMV中都已经将其鉴定出来。EF-Tu通常被认为是胞质GTP结合蛋白，并且是蛋白质合成中的重要因素。
本公开提供了证明可以通过非活疫苗(OMV)与Th1驱动佐剂IL-12/ms的i.vag给药使个体对淋病奈瑟菌免疫。尽管遭受了先前的挫折，但这些发现证明了针对淋病奈瑟菌的疫苗的可行性，并且这些发现也阐明了需要诱导以产生保护性免疫的免疫反应的类型。
方法
小鼠。包括野生型BALB/c和C57BL/6小鼠、C57BL/6背景的B6.129S7-Ifngtm1Ts/J(IFNγ缺陷)、B6.129S2-Ighmtm1Cgn/J(B细胞缺陷；也称为μMT)、B6.129S2-Cd4tm1Mak/J(CD4缺陷)以及B6.129S2-Cd8atm1Mak/J(CD8缺陷)小鼠在内，所有小鼠均购自杰克逊实验室(缅因州巴尔港)。实验中使用BALB/c小鼠，除非另有说明。小鼠维持在布法罗大学实验动物设施中的BSL2设施中，这由AAALAC完全认可。所有动物所采用的方案已由布法罗大学(Universityat Buffalo)的机构动物护理和使用委员会批准。
细菌。淋病奈瑟菌FA1090菌株由Janne Cannon博士(北卡罗来纳大学教堂山分校)提供；MS11菌株由Daniel Stein博士提供(马里兰大学)；FA19菌株和临床分离物从由北卡罗来纳大学教堂山分校维持的临床菌株收集物中获得。为了在鼠感染模型中使用，用来自FA1090菌株的抗链霉素的rpsL基因转化淋病奈瑟菌9087和0336菌株，分别产生GC68和GC69菌株。大肠杆菌K12由Terry Connell博士(布法罗大学)提供。不可分型的流感嗜血杆菌(NTHI)6P24H1菌株由Timothy Murphy博士(布法罗大学)提供。淋病奈瑟菌在补充有增菌培养基
(BD诊断系统公司，新泽西州富兰克林湖)的GC琼脂上培养，并检查所得生长以检查菌落形态是否与Opa蛋白和菌毛表达一致。NTHI在仅补充有血红蛋白的GC琼脂上培养。大肠杆菌在BHI琼脂上培养。从平板上收集细菌并确定细胞密度(Liu等,MucosalImmunol.5,320-331(2012))。
IL-12微球。除了用蔗糖(0.1％,w/w)代替牛血清白蛋白以外，如前所述采用相反转纳米包封技术将鼠IL-12(惠氏公司(Wyeth)，宾夕法尼亚州费城)包封到聚乳酸微球中(Egilmez等,Methods Mol.Med.75,687-696(2003))。以相同方式制备空白微球，但不使用IL-12。
淋球菌外膜囊泡(OMV)。在补充的GC琼脂上培养18-22小时后，将淋病奈瑟菌从平板中收获到冰冷的醋酸锂缓冲液(pH 5.8)中，并通过25号针头10-12次以剪切下细菌的外膜。将悬浮液在微量离心管中以13,000RPM旋转1分钟。收集上清液并以107,000×g超速离心2小时。用50mM Tris-HCl(pH 8.0)洗涤颗粒物，并重悬于PBS中。用Micro BCA蛋白试剂盒(赛默飞世尔科技公司(Thermo Scientific)，伊利诺伊州罗克福德)或RC DC蛋白分析试剂盒(伯乐公司，加利福尼亚州赫拉克勒斯)检测蛋白。
免疫时间表和小鼠阴道感染模型。用总体积为40μl的PBS中的上述各种菌株的淋球菌OMV(40μg蛋白)加IL-12/ms(1μg IL-12)或空白ms来i.vag免疫多组7至9周龄的8只雌性小鼠；对照组单独用IL-12/ms或用空白ms进行假免疫。如所示，以7-14天的间隔对小鼠免疫1至3次。又过了2周至6个月后，按照先前的描述(Jerse,Infect.Immun.67,5699-5708(1999；Liu等,J.Infect.Dis.208,1821-1829(2013))用5x 106CFU的活淋病奈瑟菌感染经免疫的小鼠，其中的改动是在第-2、0和2天使用0.5mg Premarin(辉瑞公司(Pfizer)，宾夕法尼亚州费城)作为雌二醇进行皮下注射。每天收集的阴道拭子在补充有血红蛋白、
(增菌培养基)和选择性抗生素(万古霉素、链霉素、乳酸链球菌素、粘菌素和甲氧苄啶)的GC琼脂上进行定量培养，以确定细菌定殖量。检测限为每只小鼠100个菌落形成单位(CFU)回收物。淋球菌回收量由对实验处理是“盲”的个体来计数，并且所有实验均重复2或3次以供验证。
血清和粘膜抗体的检测。在指定的时间点从小鼠收集阴道洗液和血清的样品(Liu等,mBio 2:(2011)。使用未稀释的阴道洗液和10倍稀释的血清作为初始稀释液，在涂有完整淋球菌的平板上通过ELISA测定阴道洗液和血清中的淋球菌特异性IgA、IgG、IgM和IgG亚类抗体IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。17,26在涂有抗IgA、抗IgG或抗IgM抗体(南方生物技术公司(Southern Biotech)，亚拉巴马州伯明翰)的平板上通过ELISA测定分泌物中的总IgA、IgG和IgM浓度。使用H5小鼠单克隆抗体(对淋病奈瑟菌血清型PIB3有特异性)或亲和纯化的小鼠IgA、IgG和IgM(南方生物技术公司)建立标准曲线。通过碱性磷酸酶偶联的山羊抗小鼠IgA、IgG、IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3抗体(南方生物技术公司)和对硝基苯基磷酸酯底物(南方生物技术公司)检测结合的抗体。在配有SoftMax软件的VersaMax酶标仪(分子仪器公司(Molecular Devices)，加利福尼亚州森尼韦尔)或配有KC Junior软件的ELX800Universal酶标仪(伯腾仪器公司(Bio-Tek Instruments)，佛蒙特州威努斯基)中读取平板。抗体数据表示为相对于同时检测的对照样品(来自假免疫小鼠)中检测到的抗体水平的相对值(增加倍数)。
流式细胞术。分离的细胞用染色缓冲液洗涤两次，然后与所示抗体在冰上孵育30分钟，洗涤，并在FACSCalibur细胞仪上进行分析。为了进行细胞内染色，首先将细胞用CYTOFIX/
(eBioscience)固定。与FITC、PE或别藻蓝蛋白偶联的小鼠CD4、CD8、IFNγ、IL-4和IL-17A的抗体购自eBioscience。
淋巴细胞分离与培养。使用Histopaque 1083(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)密度梯度离心从无菌收获的ILN中分离单核细胞，并从2或3只小鼠中收集，以提供足够数量的细胞进行培养。使用Dynal CD4细胞分离试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)，通过阴性选择来纯化CD4+T细胞。在无刺激或有2×107淋病奈瑟菌细胞的条件下，将细胞在密度为2×106细胞/ml的24孔培养板中在等量的作为APC的丝裂霉素C灭活脾细胞的存在下进行培养。
增殖试验。用羧甲基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE；西格玛奥德里奇公司)标记细胞。然后将CFSE标记的细胞在PBS中洗涤两次，重新计数，并如上所述进行刺激。收获培养的细胞，然后用别藻蓝蛋白偶联抗小鼠CD4抗体染色。通过在FACSCalibur细胞仪中对CD4+细胞群体进行门选来获取数据。用CFSE荧光的衰减来测定细胞增殖。
细胞因子ELISA。使用购自eBioscience的ELISA试剂盒一式三份地测定IFNγ、IL-4和IL-17A水平。
实时RT-PCR。使用
RNA纯化迷你试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州瓦伦西亚)分离从小鼠收获的整个阴道的总细胞RNA，并使用ISCRIPTTM cDNA合成试剂盒(伯乐公司(Bio-Rad)，加利福尼亚州赫拉克勒斯)转录为cDNA。使用
绿色染料(伯乐公司)在ICYCLER
检测系统(伯乐公司)上进行实时RT-PCR，以实时监测PCR。所用的引物如下：IFNγ，5’-TACTGCCACGGCACAGTCATTGAA-3’(SEQ ID NO:1)，5’-GCAGCGACTCCTTTTCCGCTTCCT-3’(SEQ ID NO:2)；IL-4，5’-GAAGCCCTACAGACGAGCTCA-3’(SEQID NO:3)，5’-ACAGGAGAAGGGACGCCAT-3’(SEQ ID NO:4)；IL-17A，5’-TCAGGGTCGAGAAGATGCTG-3’(SEQ ID NO:5)，5’-TTTTCATTGTGGAGGGCAGA-3’(SEQ ID NO:6)；β-肌动蛋白，5’-CCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3’(SEQ ID NO:7)，5’-GAGGCATACAGGGACAGCACA-3’(SEQ ID NO:8)。基于由伯乐公司IQTM 5光学系统软件确定的阈值循环(Ct)分析目标基因的相对定量。
Western印迹。将淋病奈瑟菌OMV制剂在含有2-巯基乙醇的十二烷基硫酸钠(SDS)上样缓冲液中煮沸5分钟。使用RC DC蛋白质检测试剂盒进行蛋白质定量。在10％聚丙烯酰胺SDS电泳凝胶上从每个样品分离出10毫克的蛋白质。使用电泳转移系统(伯乐公司，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯)将蛋白质条带转移到硝酸纤维素膜上。和1:200稀释的血清样品或1:20稀释的阴道洗液样品一起在含3％脱脂奶的PBS中孵育2小时，然后用含3％脱脂奶的PBS于4℃过夜封闭硝酸纤维素膜。用1:4000稀释的辣根过氧化物酶偶联山羊抗小鼠IgG(圣克鲁斯生物技术公司(Santa Cruz Biotechnology)，加利福尼亚州帕索罗布尔斯)检测与淋病奈瑟菌OMV制剂结合的特异性抗体。使用Pierce检测试剂盒进行化学发光检测，并使用ChemiDoc MP成像系统(伯乐公司)收集图像。
免疫蛋白质组学。使用DC蛋白质检测试剂盒(伯乐公司)测定OMV中的蛋白质浓度。将OMV样品[300μg和50μg蛋白，分别用于二维(2D)SDS-PAGE-MS/MS分析和免疫印迹]在90％丙酮中沉淀过夜，用100％冰冷的丙酮洗涤两次并风干。将蛋白质颗粒物在200μL的补水缓冲液(7M尿素，2M硫脲，2％CHAPS，2％ASB-14、1％DTT，2mM TBP，2％3-10IPG缓冲液，微量橙色G)中重建，并用于将pH 4-7ReadyStrip IPG胶条(伯乐公司)在25℃下彻夜补水。使用
i12TM IEF系统(伯乐公司)进行等电聚焦，总功率为26,000Vh，设置如下：电流限制为50μA，26,000Vh的8000V快速斜坡，保持750V。使用Criterion TGX Any kD凝胶(伯乐公司)进行二维(2D)SDS-PAGE。将蛋白质在Flamingo荧光染料(伯乐公司)中染色过夜，并使用ChemiDoc成像系统(伯乐公司)将斑点可视化。为了进行免疫印迹，使用TurboBlott转移系统(伯乐公司)将分离的蛋白质转移到PVDF膜上。将膜在牛奶的5％PBS Tween溶液中封闭2小时，并与来自免疫小鼠的血清一起孵育过夜，然后与抗小鼠HRP偶联抗体(伯乐公司)一起孵育，以进行探测。使用Clarity Western ECL底物和ChemiDoc MP成像系统(伯乐公司)将斑点可视化。膜上的蛋白质用Novex可逆膜蛋白质染色剂(英杰公司)染色，用经Flamingo染色的2D凝胶覆盖选定的“锚定”斑点的位置。切下匹配的斑点，并用胰蛋白酶消化蛋白质。使用ZipTip C18(密理博(Millipore)，马萨诸塞州比尔里卡)将含有提取肽的样品脱盐，并用70％乙腈/0.1％TFA洗脱，在真空浓缩仪(speed vac)中干燥。将脱盐的肽溶解在0.1％甲酸中的2％乙腈(20μL)中，并用与混合型Orbitrap Elite ETD(赛默飞世尔科技公司)质谱仪连接的Thermo Scientific Easy-nLC II(赛默飞世尔科技公司，马萨诸塞州沃尔瑟姆)纳米HPLC系统通过LC/ESI MS/MS进行分析(2μL)。在线脱盐使用装有MagicC18AQ(5μm
树脂；(麦克科姆生物技术公司(Michrom Bioresources))，美国加利福尼亚州奥本市)的反相捕集柱(100μm×20mm)完成，然后在直接安装在电喷雾离子源上的装有Magic C18AQ(5μm
树脂；麦克科姆生物技术公司)的反相柱(75μm×250mm)上进行肽分离。以400nL/min的流速使用0.1％甲酸中的7％至35％乙腈的30分钟梯度来进行色谱分离。将加热的毛细管温度设定为300℃，并向电喷雾头施加2750V的喷雾电压。以数据依赖模式运行Orbitrap Elite仪器，在Orbitrap中的MS测量扫描之间自动切换(AGC目标值1,000,000，分辨率240,000，注入时间250毫秒)，并在线性离子阱(AGC目标值10,000，注入时间100毫秒)中采集MS/MS谱。通过傅里叶变换(FT)全扫描选择20个最强离子，通过碰撞诱导的离解(归一化碰撞能量为35％)在线性阱中破碎。动态筛选选定的离子15秒钟，列表大小为500，排除质量为质量宽度±0.5。使用Proteome Discoverer 1.4(赛默飞世尔科技公司)进行数据分析。根据淋病奈瑟菌数据库(FA1090、FA19和MS11)与cRAP.fasta(一种常见污染物的数据库)(thegpm.org/crap/)组合，检索所有鉴定出的肽；这会创建蛋白质组学实验中常见的蛋白质列表，这些蛋白质是因偶然或不可避免的污染而存在的。将胰蛋白酶设为酶，最大错位切割设为2。前体离子容差设为10ppm，碎片离子容差设为0.8Da。可变修饰包括甲硫氨酸上的氧化(+15.995Da)和半胱氨酸上的氨基甲酰甲基(+57.021Da)。使用Sequest HT检索数据。所有检索结果均通过Percolator进行评分。
统计学分析。数据以平均值±该平均值的标准误差(SEM)表示。免疫对接种后淋病奈瑟菌回收量的影响的数据采用双向ANOVA进行分析，采用费舍尔受保护的最小显著差异事后检验进行重复测定。另外，采用Kaplan-Meier分析和对数秩检验来比较治疗组之间的感染清除(定义为连续3天零回收中的第一天)。对于免疫反应数据，采用非配对双尾t检验来比较两组之间的平均值，或将ANOVA与Bonferroni事后检验用于多重比较。P<0.05被认为具有统计学显著性。使用Microsoft Excel或Prism 5(GraphPad软件公司(GraphPadSoftware)，加利福尼亚州圣迭戈)进行统计学分析。
实施例4
本实施例描述了OMV和IL-12ms的鼻内给药。雌性小鼠(每组8只)在第0和14天用OMV(40μg蛋白，FA19菌株)加IL-12/ms(1μg IL-12)或空白ms鼻内免疫。两周后，用5×106CFU的淋病奈瑟菌FA1090菌株对所有小鼠进行阴道内攻击。将每天收集的阴道拭子稀释，并在含有选择性抗生素的GC琼脂平板上进行定量培养。结果显示，用OMV加IL-12 ms免疫的小鼠比对照组明显更快地清除了感染(p<0.01，图21)。另外，用OMV加IL-12ms免疫的小鼠中的细菌定殖量显著降低。
实施例5
进行了研究以进一步说明通过鼻内途径递送的包含OMV和IL-12微球的组合物的保护作用，以及鼻内途径与阴道内途径的比较。
用不同剂量的由淋病奈瑟菌FA1090菌株制备的OMV：15μg、30μg或60μg的OMV蛋白和微包封IL-12(IL-12/ms；1μg IL-12)一起，或单独用IL-12/ms鼻内(i.n.)免疫小鼠。2周后重复免疫。末次给药后两周，用活淋病奈瑟菌FA19菌株对小鼠进行阴道内攻击，然后在感染过程中如前所述每天进行阴道拭和铺板。如图22所示，与单独用IL-12/ms免疫的对照组相比，用低剂量15μg的OMV免疫的小鼠未显示出加快的感染清除(中位清除时间：两组均为10天)。用常规(中等)剂量30μg或增加剂量60μg的OMV免疫的小鼠比对照组明显更快地清除了感染(中位清除时间分别为6天和7.5天)(P<0.001，Kaplan-Meier，对数秩检验)。
如下所述将鼻内(i.n.)免疫与阴道内(i.vag)免疫进行比较：用30μg淋球菌FA1090 OMV(作为蛋白质)加IL-12/ms(1μg IL12)或空白微球(ms)i.n.或i.vag免疫小鼠，并在2周后重复免疫。两周后，用活淋病奈瑟菌FA19对小鼠进行i.vag攻击(异源性攻击)，然后在感染过程中如前所述每天进行阴道拭和铺板。如图23A-D所示，用OMV加IL-12/ms进行i.n.免疫的小鼠与i.vag免疫的小鼠相当地清除了感染。清除感染后(攻击后2周)，收集血清、阴道洗液和唾液样品，以通过ELISA检验IgG和IgA抗淋球菌抗体。用IL-12/ms免疫的小鼠与用相同疫苗i.vag免疫的小鼠相当地清除了感染(图23A)。用OMV加IL-12/ms进行i.n.免疫的小鼠在血清(图23B)和阴道洗液(图23C)中产生的IgG和IgA抗体的水平高于i.vag免疫的小鼠。用OMV加IL-12/ms进行i.n.免疫的小鼠也产生了高水平的唾液IgA抗体(图23D)。
当用与用于制备OMV的菌株相同的FA1090菌株对小鼠进行攻击(同源性攻击)时，用OMV加IL-12/ms进行i.n.免疫的小鼠(如图3所示)与i.vag免疫的小鼠相当地清除了感染(图24)。
用淋球菌FA1090 OMV(30μg蛋白)加IL-12/ms(1μg IL-12)对小鼠进行一次或两次i.n.免疫；对照小鼠接受空白ms。第二次免疫后两周，用淋病奈瑟菌MS11对小鼠进行i.vag攻击(异源性攻击)。如图25所示，用OMV加IL-12/ms免疫两次的小鼠(中位清除时间：4天)比用一剂疫苗免疫的小鼠(中位清除时间：9天)或对照小鼠(中位清除时间：7天)更快地清除了感染；P＝0.0155(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。
用由淋病奈瑟菌MS11制备的OMV(30μg蛋白)加IL-12/ms(1μg IL-12)或空白ms对小鼠进行i.n.免疫，并用异源性淋球菌FA1090菌株进行攻击。如图26所示，用MS11 OMV加IL-12/ms免疫的小鼠(中位清除时间：7天)比用MS11 OMV加空白ms免疫的小鼠(中位清除时间：11天)或未免疫的对照小鼠(中位清除时间：12天)更快地清除了感染；P＝0.0231(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。
用由淋病奈瑟菌MS11制备的OMV(30μg蛋白)加IL-12/ms(1μg IL-12)或空白ms对小鼠进行i.n.免疫，并用异源性淋球菌FA19菌株进行攻击。如图27所示，用MS11 OMV加IL-12/ms免疫的小鼠(中位清除时间：5天)比用MS11 OMV加空白ms免疫的小鼠(中位清除时间：9天)或未免疫的对照小鼠(中位清除时间：10天)更快地清除了感染；P＝0.0007(Kaplan-Meier分析，对数秩检验)。
应注意的是，在这些实验中使用的淋病奈瑟菌菌株表达不同的孔蛋白类型。淋球菌孔蛋白PorB是淋病奈瑟菌中的主要外膜蛋白，由两种主要类型PorR-1A和PorB-1B代表，每种类型都有许多亚型。FA1090菌株具有孔蛋白型PorB-1B，菌株MS11也具有孔蛋白型PorB-1B，尽管其亚型不同于FA1090，并且菌株FA19具有孔蛋白型PorB-1A。另外，这些菌株表达不同的Opa蛋白和脂寡糖结构，因此它们代表淋病奈瑟菌的广泛不同的抗原变体。
尽管已经针对一个或多个特定实施例描述了本发明，但是应理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以做出本发明的其他实施例。
序列表
<110> 纽约州立大学研究基金
<120> 生殖道感染的联合治疗和预防
<130> 011520.01370
<140> PCT/US18/62590
<141> 2018-11-27
<150> 15/824,700
<151> 2017-11-28
<150> 16/138,526
<151> 2018-09-21
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
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<220>
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<400> 8
gaggcataca gggacagcac a 21
Claims (16)
1.一种降低个体中的淋病奈瑟菌生殖道感染风险的方法，其包括如下步骤：向所述个体鼻内给予一定量的掺入聚合物微球中的IL-12和来自淋病奈瑟菌的外膜囊泡(OMV)，来有效地降低罹患生殖道感染的风险。
2.如权利要求1所述的方法，其中，IL-12微球和OMV在相同组合物中递送。
3.如权利要求1所述的方法，其中，IL-12微球和OMV在最长为三周的时间段内多次给药。
4.如权利要求3所述的方法，其中，IL-12微球和OMV在给药之间以至少约1周的间隔给药2至4次。
5.如权利要求4所述的方法，其中，IL-12微球和OMV在给药之间以约2周的间隔给药2次。
6.如权利要求1所述的方法，其中，OMV在每剂0.01至2000μg蛋白的范围内。
7.如权利要求6所述的方法，其中，OMV在每剂0.01至1000μg蛋白的范围内。
8.如权利要求1所述的方法，其中，OMV在0.5至30μg/kg体重的范围内。
9.如权利要求1所述的方法，其中，IL-12在每剂1至500μg的范围内。
10.如权利要求1所述的方法，其中，IL-12在10ng至10μg/kg体重的范围内。
11.如权利要求1所述的方法，其中，OMV在每剂0.01至2000μg蛋白的范围内，并且IL-12在每剂1至500μg的范围内。
12.一种用于鼻内给药的组合物，其在药物载体中包含淋病奈瑟菌外膜囊泡(OMV)和IL-12，其中IL-12掺入聚合物微球中。
13.如权利要求12所述的组合物，其中，OMV在每剂0.01至2000μg蛋白的范围内，并且IL-12在每剂1至500μg的范围内。
14.如权利要求12所述的组合物，其中，所述组合物基本上不含可溶性IL-12。
15.一种用于对个体进行针对淋病奈瑟菌感染的鼻内疫苗接种的试剂盒，其包括多剂的适合于鼻内给药的组合物、以及任选的组合物给药的说明书，所述组合物在药物载体中包含淋病奈瑟菌外膜囊泡(OMV)和IL-12，其中IL-12掺入聚合物微球中，并且其中，OMV的量为每剂0.01至2000μg蛋白，并且IL-12的量为每剂1至500μg。
16.一种用于对个体进行针对淋病奈瑟菌感染的鼻内疫苗接种的试剂盒，其分别包括：
i)适合于鼻内给药的组合物，该组合物包含淋病奈瑟菌外膜囊泡(OMV)，其中OMV的量为每剂0.01至2000μg；
ii)适合于鼻内给药的组合物，该组合物包含IL-12，其中IL-12掺入聚合物微球中，并且IL-12的量为每剂1至500μg；以及
iii)任选的说明书，其关于i)和ii)的组合以及组合后的组合物的给药。
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Non-Patent Citations (3)
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