CN111686143A - 冷蒿萃取物其制备方法和应用 - Google Patents

冷蒿萃取物其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及冷蒿萃取物及其制备方法和应用。本发明用超声提取法，以蒸馏水作为提取溶剂，获得具有很好的抗炎作用冷蒿水提物，用不同的极性溶剂萃取冷蒿水提物，确定了冷蒿的正己烷和乙酸乙酯萃取物降低炎症介质NO和炎症因子IL‑6、1L‑1β、TNF‑α的表达与释放，对炎症进行调控。

Description

冷蒿萃取物其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及冷蒿萃取物及其制备方法和应用。
背景技术
炎症，是机体对感染或组织损伤所产生的一种防御措施，可发生在人体的各种组织和器官中，例如常见的肝炎，胃炎，肺炎等。其中细菌的感染或病毒的感染、烧伤和割伤、强酸和强碱腐蚀以及人体的免疫系统失调，都可以引起机体的炎症，将这些因子称为炎症因子。
冷蒿(Artemisia frigida Willd)为菊科(Compositae)蒿属(Artemisia)的一种多年生草本植物。冷蒿的总黄酮提取物具有明显的抗炎效果。但冷蒿抗炎作用的有效活性成分及其作用机制尚不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供冷蒿萃取物。
本发明的再一目的是提供冷蒿萃取物的制备方法。
本发明的再一目的是提供上述冷蒿萃取物的应用。
根据本发明的冷蒿乙酸乙酯萃取物中的抗炎馏分，通过以下步骤制备而得，
(1)制备冷蒿水提物，
将冷蒿粉碎，超声水提，超声条件：超声功率500W，温度50℃，时间30min，获得的水提物蒸发浓缩备用；
(2)萃取，依次以正己烷，分别得到水相、正己烷萃取物，并收集正己烷萃取组分。
根据本发明的冷蒿乙酸乙酯萃取物中的抗炎馏分，通过以下步骤制备而得，
(1)制备冷蒿水提物，
将冷蒿粉碎，超声水提，超声条件：超声功率500W，温度50℃，时间30min，获得的水提物蒸发浓缩备用；
(2)萃取，依次以正己烷、氯仿、乙酸乙酯萃取冷蒿水提物，分别得到水相、正己烷萃取物、氯仿相萃取物、乙酸乙酯萃取物，并收集乙酸乙酯萃取组分。
根据本发明的本发明的冷蒿乙酸乙酯萃取物中的抗炎馏分，其中，在步骤(1)中，水与冷嵩粉的比例为40:1mL/g。
根据本发明的本发明的冷蒿萃取物中的抗炎馏分，其中，分别以正己烷、氯仿、乙酸乙酯萃取三次。
根据本发明的本发明的冷蒿萃取物，其中，加入与待萃取的冷蒿水提物等体积的正己烷、氯仿、乙酸乙酯。
根据本发明的冷蒿萃取物的制备方法包括以下步骤：
(1)制备冷蒿水提物，
将冷蒿粉碎，超声水提，超声条件：超声功率500W，温度50℃，时间30min，获得的水提物蒸发浓缩备用；
(2)萃取，依次以正己烷萃取冷蒿水提物，分别得到水相、正己烷萃取物，并收集正己烷萃/乙酸乙酯萃取组分。
根据本发明的冷蒿萃取物的制备方法，其中，步骤(2)中，依次以正己烷、氯仿、乙酸乙酯萃取冷蒿水提物，分别得到水相、正己烷萃取物、氯仿相萃取物、乙酸乙酯萃取物，并收集正己烷和乙酸乙酯萃取组分。
本发明还提供了上述冷蒿萃取物用于制备抑制炎症药剂的应用。
本发明用超声提取法，以蒸馏水作为提取溶剂，获得冷蒿水提物，确定了冷蒿水提取物具有很好的抗炎作用。
本发明用不同的极性溶剂萃取冷蒿水提物，获得了相应的萃取物，通过检测各萃取物对细胞存活率和炎症介质NO、IL-6、1L-1β、TNF-α的影响，结果显示，正己烷和乙酸乙酯组分具有较好的抑制炎症因子的效果。
附图说明
图1显示中草药水提物对细胞存活率的影响；
图2显示中草药水提物对细胞存活率的影响；
图3显示中草药水提物对细胞存活率的影响；
图4显示中草药水提物对细胞存活率的影响；
图5显示ELISA试剂盒检测RAW264.7细胞上清中一氧化氮的含量；
图6显示ELISA试剂盒检测RAW264.7细胞上清中白细胞介素-6的含量；
图7显示ELISA试剂盒检测RAW264.7细胞上清中白细胞介素-1β的含量；
图8显示ELISA试剂盒检测RAW264.7细胞上清中TNF-α的含量；
图9显示各组分对细胞存活率的影响；
图10显示各组分对细胞存活率的影响；
图11显示不同极性萃取物对NO含量的影响；
图12显示不同极性萃取物对IL-6含量的影响；
图13显示不同极性萃取物对1L-1β含量的影响；
图14显示不同极性萃取物对TNF-α含量的影响；
图15显示乙酸乙酯组分液相成分分析结果。
具体实施方式
实施例1制备冷嵩水提物
(1)使用微型植物粉碎机将冷蒿粉碎，过60目的分析筛，于密封袋中保存，备用。
(2)在超声提取机中加入800mL蒸馏水，称取冷蒿20g放入超声提取机中搅拌均匀进行超声提取，超声条件：超声功率500W，温度50℃，时间30min。
(3)超声提取后，取出溶液，将上层提取液倒入离心管中，5000rpm离心20min，将离心后的上清收集或转移至旋转蒸发瓶中，用旋转蒸发仪旋转浓缩至5mL左右，用移液枪将液体转移至合适的容器中，用保鲜膜包上，并在上端扎几个孔，放入-80℃冰箱，待冻成固体后，将其放入冻干机中，冻干成粉末，将保鲜膜取下来，盖上离心管的盖子，作为待测样品，做好标记，放入-80℃冰箱备用。
以同样的方法制备黄花蒿粗粉、白头翁、龙蒿、白鲜果皮、多叶棘豆、广布野豌豆、防风、斜茎黄耆种皮、斜茎黄耆叶、灵芝菌棒、东北珍珠梅、苍术茎叶、苍术根须、苍耳、波叶大黄、山韭、茜草、地梢瓜瓜皮的水提取物。
称取水提物10mg置于1.5mL EP管中，在无菌的环境中配置成浓度为10mg/mL的母液，用移液枪吹打混匀或者上下颠倒，使其溶解，用无菌的0.45μm滤膜过滤至新的无菌离心管中，放入﹣80℃冰箱，保存备用。
实施例2水提物对细胞存活率的影响
由图1～图4结果可知，不同中药水提物对细胞的损伤不同，中草药的水提物作用于RAW264.7细胞后，其中白头翁水提物、龙蒿水提物、白鲜果皮水提物、多叶棘豆水提物、防风水提物、斜茎黄耆种皮水提物、斜茎黄耆叶水提物、灵芝菌棒水提物、苍术茎叶水提物、苍术根须水提物、波叶大黄水提物、山韭水提物和地梢瓜瓜皮水提物对细胞会产生不同程度的损伤。黄花蒿水提物、冷蒿水提物、广布野豌豆水提物、东北珍珠梅水提物、苍耳水提物和茜草水提物对细胞无损伤。
实施例3中草药提取物的抗炎作用
选择无细胞毒性的中草药提取物研究其抗炎作用。以LPS诱导的RAW264.7细胞为模型，设置对照组、LPS组(LPS+培养基)、LPS+加药组。将各提取物以100μg/mL的浓度处理RAW264.7细胞，2小时后，除对照组外，均加入终浓度为1000μg/mL的LPS共培养24小时，收集细胞上清，检测抗炎因子的含量。利用ELISA试剂盒检测各水提物对细胞上清中NO、IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影响。
1、中草药水提物对NO含量的影响
由图5所示，各中药水提物抑制NO的能力显著不同，各水提物作用于RAW264.7细胞后，广布野豌豆水提物处理组的NO的含量显著高于LPS模型组；黄花蒿水提物、冷蒿水提物、东北珍珠梅水提物和茜草水提物处理组的NO的含量显著低于LPS模型组，说明黄花蒿水提物、冷蒿水提物、东北珍珠梅水提物和茜草水提物均可以抑制细胞上清液中NO的释放与表达，尤其是冷蒿水提物抑制NO产生的效果更好。抑制NO的能力为冷蒿水提物>黄花蒿水提物＝东北珍珠梅水提物＝茜草水提物。
2、中草药水提物对IL-6含量的影响
各水提物作用于RAW264.7细胞后，检测细胞上清液中IL-6的含量，结果如图6所示，黄花蒿水提物、冷蒿水提物、广布野豌豆水提物、东北珍珠梅水提物、苍耳水提物和茜草水提物处理组的IL-6的含量均低于LPS模型组，这说明各水提物均可以抑制IL-6的释放。抑制IL-6表达的能力为广布野豌豆水提物>茜草水提物>黄花蒿水提物>冷蒿水提物>东北珍珠梅水提物>苍耳水提物。
3、中草药水提物对1L-1β含量的影响
由图7所示，黄花蒿水提物和东北珍珠梅水提物处理组的1L-1β的含量高于LPS模型组；冷蒿水提物、广布野豌豆水提物、苍耳水提物和茜草水提物处理组的1L-1β显著低于LPS模型组，这表明冷蒿水提物、广布野豌豆水提物、苍耳水提物和茜草水提物均可以抑制1L-1β的释放与表达。抑制1L-1β的能力为：冷蒿水提物＝广布野豌豆水提＝茜草水提物>苍耳水提物。
4、中草药水提物对TNF-α含量的影响
由图8所示，黄花蒿水提物处理组的TNF-α的含量高于LPS模型组；冷蒿水提物、东北珍珠梅水提物、苍耳水提物和茜草水提物处理组的TNF-α的含量均有所下降，这说明冷蒿水提物、东北珍珠梅水提物、苍耳水提物和茜草水提物均可以抑制TNF-α的表达与释放。抑制TNF-α的能力为茜草水提物>苍耳水提物＝东北珍珠梅>冷蒿水提物。
实施例4冷蒿水提取物不同极性组分的萃取以及成分分析
1、冷蒿水提取物不同极性组分的萃取
(1)不同溶剂的萃取：在锥形瓶中加入在200mL的实施例1制备的冷蒿水提取，再加入200mL超纯水复溶，上下颠倒混匀，将他们转移至分液漏斗中，并加入等体积的正己烷，上下颠倒混匀，待分层后，从上面的瓶口收集正己烷萃取液，再加入同体积的正己烷，以此方法萃取3次，最终获得正己烷组分。
正己烷萃取完之后，在分液漏斗加入等体积的氯仿、上下颠倒混匀，待分层后，拧开活塞，收集氯仿萃取液，以同样的方法，萃取3次。之后，以同样的方法加入乙酸乙酯、正丁醇，各萃取3次，如此反复，直至所有冷蒿水提取物萃取完成，收集最后剩下的水相。
(2)将各萃取液转移至旋转蒸发瓶中，用旋转蒸发仪旋蒸浓缩直至无溶剂蒸出，和之前冻存的方法一样，将膏状物质转移至离心管中，用保鲜膜封上，在上端扎几个孔，放入-80℃冰箱，待其冻成固体后，放入冻干机中，冻干成粉末，称重并计算得率，取下保鲜膜，盖上离心管的盖子，放入-80℃冰箱保存备用。
2、各萃取组分的液相成分分析
(1)称取正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇组分各10mg，加入1mL超纯水复溶，上下颠倒混匀，用0.45μm滤膜过滤，放入液相瓶中，结果如表1所示。用2000g冷蒿水提物获得了水相组分65.97g，正丁醇组分7.86g，乙酸乙酯组分9.96g，氯仿组分2.15g和正己烷组分0.19g，其中水相组分含量最高，正己烷组分含量最低。
表1各组分的萃取率
Figure BDA0002564312820000051
(2)流动相体系为乙腈-水-0.1％三氟乙酸，流速为1mL/min，柱温为30℃的条件下，采用如下表2所示，用DAD检测器对供试品在200-400nm波长范围内进行三维图谱扫描。
表2洗脱条件
时间(min) A(0.1％三氟乙酸-水) B(乙腈)
0 90％ 10％
10 80％ 20％
25 65％ 35％
30 90％ 10％
40 90％ 10％
HPLC分析不同极性萃取组分显示，各萃取组分的化学成分各不相同，水相、氯仿和正丁醇萃取物成分比较多，正己烷和乙酸乙酯萃取物成分很少。
(3)乙酸乙酯萃取组分的收集
(3-1)乙酸乙酯组分的样品浓度、流动相系统、流速、温度和上述萃取实验操作过程中保持一致；
(3-2)根据乙酸乙酯萃取组分的液相分析图，首先进行粗分，将峰面积小的几个峰收集在一起，峰面积大点的，单独收集；
(3-3)从废液管道中直接收集到离心管中，大量收集，用旋转蒸发仪旋转浓缩至2mL左右，做好标记，转移至离心管中，放入-80℃的冰箱中冻成固体，随后放入冻干机中获得粉末，备用。
实施例5冷蒿水提物不同极性萃取物抗炎作用
为了确定冷蒿水提物抗炎作用的有效活性成分，将其用不同极性溶剂萃取，分别得到水相、正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇五种组分，进一步检测实施例4获得的不同极性萃取物的抗炎作用，考察各组分对细胞存活率、NO、IL-6、IL-1β和TNF-α含量的影响
1、不同极性萃取物对细胞存活率的影响
由图9可知，当用各萃取组分处理RAW264.7细胞时，水相组分处理组的细胞的存活率低于对照组，正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇组分处理组与对照组相比，对细胞存活率无影响或促进细胞增殖。由图10可知，当LPS+萃取组分处RAW264.7细胞时，与LPS模型组相比，水相组分处理组降低细胞存活率，正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇组分处理组的细胞存活率均高于LPS模型组。由此可见，正己烷、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取物具有抗炎作用。
2、不同极性萃取物抗炎作用
选择无细胞毒性的组分进行抗炎作用研究，设置对照组、LPS组(LPS+培养基)、LPS+加药组。将各提取物以100μg/mL的浓度作用于加药组的细胞，2小时后，除对照组外，均加入终浓度为1000μg/mL的LPS共培养24小时，收集细胞上清，用ELISA试剂盒检测炎症因子的含量，最终确定抗炎活性成分。
(1)不同极性萃取物对NO含量的影响
由图11结果可知，正己烷组分、氯仿组分、乙酸乙酯组分和正丁醇组分都可以降低NO的表达量，其对抑制NO释放的能力可以表述为：正己烷组分>乙酸乙酯组分>氯仿组分>正丁醇组分。
(2)不同极性萃取物对IL-6含量的影响
由图12可知，其中正己烷组分和乙酸乙酯组分能够明显的抑制IL-6的表达，氯仿组分和正丁醇组分也可以抑制IL-6的表达，但是并不明显。其抑制能力从大到小依次是：正己烷组分＞乙酸乙酯组分＞氯仿组分＝正丁醇组分。
(3)不同极性萃取物对1L-1β含量的影响
图13结果表明，四种组分中，乙酸乙酯组分对1L-1β的表达没有显著抑制的作用，正己烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取物均可以显著的抑制1L-1β的表达。并且抑制1L-1β的能力为正己烷组分＞正丁醇组分＞氯仿组分＞乙酸乙酯组分。
(4)不同极性萃取物对TNF-α含量的影响
由图14可知，四种组分都可以抑制TNF-α的表达，其中正丁醇组分对TNF-α的抑制不显著，正己烷组分、氯仿组分和乙酸乙酯组分都可以显著抑制TNF-α的表达，且抑制TNF-α的表达的能力大小依次是正己烷组分＝乙酸乙酯组分>氯仿组分>正丁醇组分。
如图15所示，利用高效液相制备色谱对乙酸乙酯萃取物进行分馏，分段收集样品并检测其抗炎作用。
综上所述，正己烷萃取物和乙酸乙酯萃取物的抗炎作用比较明显，正己烷萃取物比乙酸乙酯萃取物效果更佳，但是正己烷萃取物的获得率低于乙酸乙酯萃取物的获得率。

Claims (8)

1.冷蒿萃取物，其特征在于，所述馏分通过以下步骤制备而得，
(1)制备冷蒿水提物，将冷蒿粉碎，超声水提，超声条件：超声功率500W，温度50℃，时间30min，获得的水提物蒸发浓缩备用；
(2)萃取，以正己烷萃取冷蒿水提物，分别得到水相、正己烷萃取物。
2.根据权利要求1所述的冷蒿萃取物，其特征在于，在步骤(2)中，依次以正己烷、氯仿、乙酸乙酯萃取冷蒿水提物，分别得到水相，收集正己烷萃取物和乙酸乙酯萃取物。
3.根据权利要求1所述的冷蒿萃取物，其特征在于，在步骤(1)中，水与冷嵩粉的比例为40:1mL/g。
4.根据权利要求2所述的冷蒿萃取物，其特征在于，分别以正己烷、氯仿、乙酸乙酯萃取三次。
5.根据权利要求1或2所述的冷蒿萃取物，其特征在于，加入与待萃取的冷蒿水提物等体积的正己烷、氯仿、乙酸乙酯。
6.冷蒿萃取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备冷蒿水提物，
将冷蒿粉碎，超声水提，超声条件：超声功率500W，温度50℃，时间30min，获得的水提物蒸发浓缩备用；
(2)萃取，以正己烷萃取冷蒿水提物，分别得到水相、正己烷萃取物。
7.根据权利要求6所述的冷蒿萃取物的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，依次以正己烷、氯仿、乙酸乙酯萃取冷蒿水提物，分别得到水相、正己烷萃取物、氯仿相萃取物、乙酸乙酯萃取物，并分别收集正己烷萃取物和乙酸乙酯萃取物。
8.权利要求1所述的冷蒿萃取物用于制备抑制炎症药剂的应用。
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