CN111671906B - Akr1b抑制剂在制备治疗肺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了AKR1B抑制剂在制备治疗肺癌药物中的应用，所述AKR1B抑制剂包括索比尼尔或依帕司他。本发明首次发现AKR1B抑制剂能够显著抑制肺癌细胞增强的迁移能力和干性特征，抑制肺癌细胞的增殖能力和细胞活力，联合肺癌的靶向药物(厄洛替尼、吉非替尼或奥希替尼等)使用均能显著抑制耐药复发现象的产生。更重要的是，AKR1B抑制剂中依帕司他已为上市药物，临床用于治疗糖尿病并发症，本发明首次发现依帕司可老药新用于治疗肺癌以及预防耐药，将使更多肺癌患者获益。

Description

AKR1B抑制剂在制备治疗肺癌药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及AKR1B抑制剂在制备治疗肺癌药物中的应用。

背景技术

肺癌是全球发病率和致死率占首位的恶性肿瘤。随着人们对肺癌的认识不断增加以及新的治疗手段不断进入临床，肺癌分类也发生了巨大变化。根据肺癌的病理学特征，可以分为小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-Small CellLung Cancer,NSCLC)，NSCLC占80％以上，包括腺癌、鳞癌、大细胞癌。不同种族的肺癌驱动基因突变谱存在较大差异，亚裔人群以表皮生长因子受体(Epidermal growth factorreceptor,EGFR)突变最为常见。肺癌驱动基因研究的同时也促进了针对这些突变基因药物的研发，以EGFR为靶点的治疗已经应用于临床并取得了一定疗效。近十年来，以吉非替尼(Gefitinib)、厄洛替尼(Erlotinib)和奥希替尼(Osimertinib)等为代表的表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(Epidermal growth factor receptor tyrosine kinaseinhibitor,EGFR-TKI)已成为EGFR突变型晚期肺癌最主要的治疗手段，但几乎所有EGFR-TKIs治疗有效的患者在用药10-14个月后产生耐药，最终难逃疾病复发进展的厄运，这成为临床治疗的巨大瓶颈。目前已知的EGFR-TKI获得性耐药机制，在分子层面主要包括EGFR编码基因继发耐药突变如第20外显子的T790M，突变以及促癌信号转换如Met基因扩增和PI3K-Akt信号通路活性增强；在细胞和组织可塑性层面主要包括肿瘤细胞转分化如发生上皮间质转化(Epithelial-mechanchymal transition,EMT)、增强肿瘤干细胞(Cancer stemcell,CSC)特性、向小细胞肺癌或鳞癌分化等，理解这些机制，并开展联合疗法对改善治疗至关重要。

索比尼尔(Sorbinil)，其主要成分为(S)-6-氟-2,3-二氢螺[4H-1-苯并吡喃-4,4-咪唑烷]-2,5-二酮(1)，分子式为C₁₁H₉FN₂O₃，分子量为236.20。索比尼尔是醛酮还原酶AKR1B抑制剂，在治疗糖尿病和糖尿病并发症方面发挥治疗作用。

依帕司他(Epalrestat)，其主要成分为5-[(1Z，2E)-2-甲基-3-苯基-2-丙烯亚基]-4-氧代-2-硫代-噻唑烷乙酸，分子式为C₁₅H₁₃NO₃S₂，分子量为319.40。依帕司他是一种可逆性的醛酮还原酶(AKR1B)非竞争性抑制剂，临床用于治疗糖尿病神经病变，用药安全低毒副作用且未见致癌作用。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供AKR1B抑制剂在制备治疗肺癌药物中的应用。AKR1B抑制剂能够显著抑制肺癌细胞的转移，可用于制备治疗肺癌的药物。

本发明的第二个目的在于，提供AKR1B抑制剂与肺癌靶向药物联合用药在制备治疗肺癌药物中的应用。

本发明的第三个目的在于，提供一种治疗肺癌的药物组合物。

为了实现上述第一个目的，本发明提供了AKR1B抑制剂在制备治疗肺癌药物中的应用。

作为一个优选方案，所述肺癌包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌。

作为一个优选方案，所述AKR1B抑制剂包括索比尼尔或依帕司他。

为了实现上述第二个目的，本发明提供了AKR1B抑制剂与肺癌靶向药物联合用药在制备治疗肺癌药物中的应用。

作为一个优选方案，所述AKR1B抑制剂包括索比尼尔或依帕司他。

作为一个优选方案，所述肺癌靶向药物包括厄洛替尼、吉非替尼或奥希替尼。

为了实现上述第三个目的，本发明提供了一种治疗肺癌的药物组合物，所述药物组合物包括AKR1B抑制剂与肺癌靶向药物。

作为一个优选方案，所述AKR1B抑制剂包括索比尼尔或依帕司他，所述肺癌靶向药物包括厄洛替尼、吉非替尼或奥希替尼。

本发明中AKR1B抑制剂包括但不限于索比尼尔(Sorbinil)、依帕司他(Epalrestat)，及其可药用盐；肺癌靶向药物包括但不限于厄洛替尼(Erlotinib)、吉非替尼(Gefitinib)或奥希替尼(Osimertinib)，及其可药用盐。

根据本发明的可药用盐是药物学技术领域技术人员熟知的生理上可接受的碱和/或酸形成的盐。与生理上可接受的碱形成的适当的盐包括，例如碱金属和碱土金属盐，如钠、钾、钙和镁盐，铵盐，以及与适当有机碱形成的盐，如甲胺，二甲胺，三甲胺，哌啶，吗啉和三乙醇胺。与生理上可接受的酸形成的适当的盐包括，例如与无机酸形成的盐，如氢卤酸(特别是盐酸盐或氢溴酸盐)，硫酸盐和磷酸盐，以及与有机酸形成的盐。

本发明的治疗肺癌的药物组合物，包括索比尼尔或其可药用盐和厄洛替尼或其可药用盐，及其药学上可接受的载体；

包括索比尼尔或其可药用盐和吉非替尼或其可药用盐，及其药学上可接受的载体；

包括索比尼尔或其可药用盐和奥希替尼或其可药用盐，及其药学上可接受的载体；

包括依帕司他或其可药用盐和厄洛替尼或其可药用盐，及其药学上可接受的载体；

包括依帕司他或其可药用盐和吉非替尼或其可药用盐，及其药学上可接受的载体；

包括依帕司他或其可药用盐和奥希替尼或其可药用盐，及其药学上可接受的载体。

本发明发现肺癌细胞中AKR1B表达水平明显升高。通过进一步干预实验发现，AKR1B通过促进肺癌转移等从而诱导其耐药复发，而使用AKR1B抑制剂可显著抑制肺癌耐药现象的产生。本发明以肺癌细胞(HCC827和H1975细胞株及其耐药株)为细胞模型，使用AKR1B抑制剂索比尼尔和依帕司他进行体外细胞实验，实验结果表明，索比尼尔和依帕司他均能显著抑制肺癌细胞株增强的迁移能力和干性特征，抑制肺癌细胞株的增殖能力和细胞活力，联合肺癌的靶向药物协同使用均能显著抑制耐药现象的产生。

本发明的优点在于，本发明使用AKR1B抑制剂进行了以小鼠皮下瘤模型和尾静脉转移模型的体内实验，实验结果表明，依帕司他和索比尼尔能抑制肺癌细胞的成瘤能力，联合肺癌的靶向药物厄洛替尼、吉非替尼或奥希替尼协同使用则能显著抑制肺癌细胞的成瘤能力，延缓耐药现象的产生。此外，依帕司他还能显著抑制肺癌耐药细胞增强的转移能力，包括脑转移和肺转移能力。

附图说明

图1为肺癌细胞中AKR1B转录水平表达情况。

图2为肺癌细胞中AKR1B蛋白水平表达情况。

图3为AKR1B抑制剂(索比尼尔和依帕司他)抑制肺癌细胞迁移能力的情况。

图4为AKR1B抑制剂(索比尼尔和依帕司他)抑制肺癌细胞增殖能力的情况。

图5为AKR1B抑制剂(索比尼尔和依帕司他)联用治疗肺癌的靶向药物厄洛替尼、吉非替尼和奥希替尼抑制肺癌细胞活力的情况。

图6为AKR1B抑制剂依帕司他抑制肺癌细胞在小鼠体内转移能力的情况。

图7为AKR1B抑制剂依帕司他单用及联合治疗肺癌的靶向药物吉非替尼抑制肺癌细胞在体内成瘤能力的情况。

图8为AKR1B抑制剂依帕司他单用及联合治疗肺癌的靶向药物吉非替尼对裸鼠体重的影响。

具体实施方式

以下，结合具体实施方式对本发明的技术进行详细描述。应当知道的是，以下具体实施方式仅用于帮助本领域技术人员理解本发明，而非对本发明的限制。

实施例1.肺癌细胞中AKR1B转录水平表达

为了检测AKR1B转录水平的表达情况，实验选取肺癌药物敏感细胞和耐药细胞为模型，提取目的细胞的RNA后逆转录，最后计算AKR1B mRNA水平。

选取培养状态良好的肺癌敏感株和耐药株，制成单细胞悬液，接种于标准的6孔板中，细胞密度为2-3×10⁵/孔，贴壁培养待细胞生长至汇合度为80-90％时，吸弃原培养板中的培养基，每孔加入2mL PBS洗涤1次以去除残留的培养液，弃PBS洗涤液，准备提取目的细胞中的RNA。RNA的具体提取步骤如下：

(1)准备提取RNA前需先配置好裂解液，裂解液需现配现用，1mL Buffer RL中需要加入20μL 50×DTT，混匀后向6孔板中每孔加入300μL现配的裂解液，上下轻晃培养板以确保裂解液均匀覆盖于细胞表面，室温裂解2-5min后沿壁吹打细胞至其充分裂解。

(2)将试剂盒中的gDNA Eraser Spin Column放置于2mL Collection Tube中。

(3)把充分裂解的细胞悬液转移至gDNA Eraser Spin Column中，12000rpm，室温离心2min。

(4)弃去上室gDNA Eraser Spin Column,保留2mL Collection Tube中的滤液。

(5)向滤液中加入300μL相同体积的70％乙醇溶液，用移液枪轻柔吹打使其混合均匀(可能会出现沉淀)。

(6)迅速地将混合均匀的液体转移至试剂盒中配套的RNA Spin Column中，12000rpm,室温离心1min，弃去滤液。

(7)在RNA Spin Column中加入500μL的Buffer RWA溶液，12000rpm,室温离心30s,弃去滤液。

(8)在RNA Spin Column中加入600μL的Buffer RWB溶液，12000rpm,室温离心30s,弃去滤液。

(9)向RNA Spin Column的膜中央，小心缓慢逐滴加入50μL现配的DNase I反应液，室温下静置15-20min。

(10)向RNA Spin Column的膜中央，小心缓慢逐滴加入350μL的Buffer RWB溶液，12000rpm,室温离心30s，弃去滤液。

(11)重复第10步。

(12)将RNA Spin Column重新安置到2mL Collection Tube中，12000rpm,室温离心2min。

(13)将RNA Spin Column安置到1.5mL新的RNase free Collection Tube中，向RNA Spin Column的膜中央，小心缓慢逐滴加入50-100μL RNase free dH₂O,在室温下静置5-10min后，12000rpm，室温离心2min，洗脱RNA。

(14)RNA含量以及浓度测定；使用紫外分光光度计测定RNA样品的OD值。注意：样品的OD260/OD280范围在1.8–2.0之间才为合格样品。

(15)提取10μL RNA样品用于后续逆转录实验。

逆转录反应具体的操作如下：

(1)将实验相关目的基因的引物和RNase-Free ddH2O在室温(15-25℃)下自然溶解，随后迅速转移至冰盒上。所有的实验试剂在使用前需颠倒混匀，1000rpm，室温离心15s后使用。

(2)建立20μL的逆转录反应体系，将以下各组分按量加入相应的离心管。

4μL	5×PrimeScript RT Master Mix
		50ng-1μg	Total RNA
根据实际体积加至20μL	RNase-Free ddH<sub>2</sub>O

(1)

(3)充分混匀后，进行逆转录反应，条件如下：

(2)

37℃	15min
		85℃	5s
4℃	+∞

(4)将完成逆转录的cDNA标记清楚细胞的名称、细胞的代数、冻存的时间以及操作者的名字简称，-20℃贮存，为后续的PCR实验做准备。

引物设计和合成：

AKR1 forward primer	GCTACTTTGTCCAGCCCACA
		AKR1 reverse primer	TCCCAGTTCTCTTCCATTTCC
β-actin reverse primer	TGGAAGGTGGACAGCGAGG
		β-actin forward primer	CGGGAAATCGTGCGTGAC

(5)PCR反应体系的配制如下：

PCR扩增反应的条件(两步法)：

结果如图1所示，肺癌细胞中AKR1B转录水平显著升高。

实施例2.肺癌细胞中AKR1B蛋白水平表达

为了检测AKR1B蛋白水平的表达情况，实验选取肺癌药物敏感细胞和耐药细胞为模型，通过Western blot检测AKR1B蛋白量的变化。

提取细胞中总蛋白具体步骤如下：

(1)取复苏后培养2至4代稳定生长的肺癌敏感细胞和耐药细胞，制成单细胞悬液接种于6孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养24h，使其生长贴壁。

(2)弃除细胞培养液，将细胞培养板置于冰上，加入预冷PBS液3mL洗涤2次作用。用移液管吸干上清后，加入100-200μL细胞裂解液，在冰上裂解30min。

(3)用细胞刮刀刮下细胞，将细胞碎片及裂解液移入离心管中，在4℃，14000rpm条件下离心15min，去除沉淀后将上清液转移到新的离心管中。

(4)取部分上清液，用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白的终浓度。

(5)量取上清，加入1/4上清体积的5×SDS-上样缓冲液，并与样品混匀，100℃条件下加热，蛋白变性后，放至-20℃冰箱保存。

SDS-PAGE蛋白电泳制备步骤如下：

(1)认真清洗玻璃板，洗净后置于50℃烘箱中5-10min，烘干玻璃板上的水汽后，将两块玻璃板对齐插入灌胶槽中，然后准备配胶及灌胶等后续实验所需试剂。

(2)根据实验所需蛋白的分子量，选择配制不同浓度的凝胶进行实验，本实验所需要的目的蛋白分子为常规蛋白，故配制10％的凝胶。配胶最后加入APS和TEMED，加入这两种试剂后需要迅速放漩涡振荡，使其充分混匀，每块胶吸取7-8mL溶液，该过程需要缓慢地倒入玻璃板夹层中，为避免倒入过程中产生气泡并且保证液面齐平，加完分离胶后需要迅速加入0.5-1mL异丙醇溶液，室温静置45min-60min至分离胶充分凝固，倒掉上层的异丙醇溶液，用单蒸水清洗残留的异丙醇，清洗3-4次后将水吸净，准备后续浓缩胶的配置及灌胶。

10％分离胶配制方法如下：

双蒸水	4.9mL
		10％过硫酸铵	100μl
40％丙烯酰胺	2.5mL
		TEMED	8μl
1.5M Tris-HCl(含SDS，pH8.8)	2.5mL
		总体积	10mL

(3)根据以下配方配制5％浓缩胶，最后加入促凝剂APS和TEMED，加入这两种试剂后需要迅速漩涡振荡，使其充分混匀，每块胶吸取3-4mL溶液。充分混匀后缓慢灌入两块玻璃板之间，随后将梳齿水平插入浓缩胶，整个过程需要保证无气泡产生，室温静置45-60min左右至浓缩胶凝固后收胶。

5％浓缩胶配制方法如下：

灭菌水	3.69mL
		10％过硫酸铵	60μL
40％丙烯酰胺	0.75mL
		TEMED	8μL
1M Tris-HCl(含SDS，pH 6.8)	1.5mL
		总体积	6mL

(4)蛋白样品制备及上样：将10×电泳液稀释成足量的1×电泳液，把玻璃板插入电泳槽中，加入足量的1×电泳液，水平缓慢拔出齿梳，根据实验需要在样品孔中加入相应体积的蛋白样品。

(5)电泳：将电泳装置与配置电源连接，在电压为50-60V下进行实验，当电泳跑完浓缩胶，再将电压调至90-100V继续跑分离胶部分。

(6)湿转法转膜：：剪下5×7cm大小的PVDF膜，在甲醇中浸泡活化5min，将配置的10×转膜液稀释成足量的1×转膜液，将滤纸和海绵垫泡在转膜液中，把胶从玻璃板取出，切掉凝胶上层的浓缩胶后，放入转膜液中平衡5-10min。随后将海绵垫、滤纸和凝胶叠成“三明治”形式，将浸泡在转膜液中的夹子打开使黑色面水平在下，整个过程避免膜与胶间产生气泡，最后在0.22A恒流的条件下转膜2-2.5h。

(7)封闭：将转上蛋白的PVDF膜取出放入1×TBST中浸泡5min，以洗掉残余的转膜液，随后进行封闭，在摇床上水平轻晃，室温下封闭1-2h。

(8)一抗孵育：封闭结束后加入足量1×TBST溶液，在摇床上室温清洗，2-3次，每次5-10min，提前按照说明书上western blot实验推荐的稀释比例，将待测的目的蛋白抗体用一抗稀释液稀释，配制AKR1B和Actin抗体。清洗结束后将配制的一抗加到相应蛋白的孵育槽中，4℃孵育过夜。

(9)二抗孵育：回收一抗孵育液。随后用足量1×TBST溶液在摇床上清洗3-4次，每次5-8min，根据相应的一抗配制二抗，二抗按照1：5000的稀释比例，使用二抗稀释液进行稀释，在摇床上室温孵育1-2h后弃掉二抗溶液，用足量1×TBST漂洗3-4次，每次5-8min,准备曝光。

(10)将显色试剂盒中的A液与B液以1：1比例进行混匀，均匀滴到PVDF膜蛋白面，左右轻微晃动后，用Odyssey仪器在相应波长下显影成像。

结果如图2所示，与敏感株相比，肺癌耐药株中AKR1B蛋白水平显著升高。

实施例3.AKR1B抑制剂(索比尼尔和依帕司他)抑制肺癌细胞的迁移能力

为了进一步探究AKR1 B抑制剂对肺癌细胞迁移能力的作用，通过划痕实验进行探究，具体步骤如下：

(1)取复苏后培养2至4代稳定生长的肺癌药物敏感细胞和耐药细胞，制成单细胞悬液接种于96孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，使其生长贴壁。

(2)在显微镜下观察细胞汇合度达到90％左右后可划痕。

(3)肺癌敏感细胞和耐药细胞分别设为DMSO组、依帕司他组和索比尼尔组。

(4)将96孔培养板放入Incucyte活细胞检测仪中实时监测。

结果如图3所示，AKR1B抑制剂索比尼尔和依帕司他能抑制肺癌细胞的迁移能力，且对耐药株效果更为明显。这也是本发明首次发现索比尼尔和依帕司他能抑制肺癌细胞的迁移能力。

实施例4.AKR1B抑制剂(索比尼尔和依帕司他)抑制肺癌细胞的增殖能力

实验具体步骤如下：

(1)取复苏后培养2至4代稳定生长的肺癌敏感细胞和耐药细胞，制成单细胞悬液接种于96孔板中，细胞密度为2000-3000个/孔，置于37℃、5％CO₂培养箱，使其生长贴壁。

(2)在显微镜下观察细胞汇合度达到20％左右后可进行后续实验。

(3)肺癌敏感细胞和耐药细胞分别设为DMSO组、依帕司他组和索比尼尔组。

(4)加入药物后将96孔培养板放入Incucyte活细胞检测仪实时监测。

结果如图4所示，AKR1B抑制剂索比尼尔和依帕司他能抑制肺癌细胞株的增殖能力，这也是本发明首次发现索比尼尔和依帕司他能抑制肺癌细胞株，尤其是耐药株的增殖能力。

实施例5.AKR1B抑制剂(索比尼尔和依帕司他)联用治疗肺癌的靶向药物厄洛替尼、吉非替尼或奥希替尼抑制肺癌细胞株的细胞活力

实验具体步骤如下：

(1)取复苏后培养2至4代稳定生长的肺癌细胞，制成单细胞悬液接种于96孔板中，细胞密度为4000-5000个/孔，将培养板放置于37℃，5％CO₂恒温细胞培养箱中预培养。

(2)在显微镜下观察细胞汇合度达到30％左右后可进行后续实验。

(3)肺癌耐药细胞分别设为肺癌靶向药组(厄洛替尼、吉非替尼或奥希替尼)、肺癌靶向药(厄洛替尼、吉非替尼或奥希替尼)+依帕司他组和肺癌靶向药(厄洛替尼、吉非替尼或奥希替尼)+索比尼尔组。

(4)加药培养72小时后吸走原培养液，将CCK-8溶液用1640培养液按照1:10的比例进行稀释，向每孔加入100μL现配的CCK-8工作溶液(注意加入工作溶液过程中避免生成气泡)。

(5)将加入工作液的培养板置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中继续孵育0.5-2h，随后用多功能酶标仪测定在450nm处的吸光度。

结果如图5所示，AKR1B抑制剂索比尼尔和依帕司他联合肺癌的靶向药物厄洛替尼、吉非替尼或奥希替尼使用均能显著抑制耐药现象的产生。

实施例6.AKR1B抑制剂依帕司他抑制肺癌耐药株在小鼠体内转移能力

本实验所用SPF级BALB/c免疫缺陷型裸鼠，3-4周龄，雌性，由上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供，动物实验操作符合《实验动物管理条例》要求。

裸鼠体内转移瘤模型建立的具体步骤如下：扩增肺癌耐药细胞，将细胞重悬后制成密度为2-3×10⁶个/mL的细胞悬液，将体外构建的细胞通过尾静脉注射法注射至胸腺免疫缺陷的裸鼠体内。待成功形成转移灶后，随机将裸鼠分为两组，分别为溶剂对照组和依帕司他组，所有药物均采用灌胃的给药方式。持续给药一段时间后，我们对溶剂对照及依帕司他组裸鼠的荧光信号值进行定量统计。

结果如图6、图7所示，AKR1B抑制剂依帕司他能显著抑制肺癌细胞在体内外的转移能力，包括脑转移和肺转移能力。

实施例7.AKR1B抑制剂依帕司他单用及联合治疗肺癌的靶向药物吉非替尼抑制肺癌细胞在体内成瘤能力

本实验所用SPF级BALB/c免疫缺陷型裸鼠，3-4周龄，雌性，由上海西普尔－必凯实验动物有限公司提供，动物实验操作符合《实验动物管理条例》要求。

裸鼠皮下异种移植瘤模型建立的具体步骤如下：扩增肺癌细胞，将细胞重悬后制成密度为2-3×10⁶个/mL的细胞悬液，在胸腺免疫缺陷的裸鼠上肢腋窝处接种肺癌细胞，细胞接种的密度约为2-3×10⁶个/点，待肿瘤体积为200mm³左右，将裸鼠随机分为4组，分别为对照组、吉非替尼组、依帕司他组、吉非替尼+依帕司他联合给药组。所有药物均采用灌胃的给药方式。待对照组肿瘤长到1000mm³,对裸鼠进行安乐死，小心取出皮下移植瘤，拍照并称瘤重。

结果如图8所示，AKR1B抑制剂依帕司他联合肺癌的靶向药物吉非替尼使用能显著抑制肺腺癌移植瘤对吉非替尼耐药现象的产生。

本实验隔天称量小鼠体重，体重变化如图8所示，对照组、吉非替尼组、依帕司他组、吉非替尼+依帕司他联合给药组的小鼠体重无明显差异，提示依帕司他有着很好的治疗效果且毒副作用较低。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.AKR1B抑制剂与肺癌靶向药物联合用药在制备治疗耐药肺癌药物中的应用，其特征在于，所述AKR1B抑制剂选自索比尼尔或依帕司他，所述肺癌靶向药物选自厄洛替尼、吉非替尼或奥希替尼，AKR1B抑制剂联合肺癌靶向药物抑制肺癌对靶向药物耐药现象的产生。

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