CN111662892A - β-酮己二酸代谢相关三个基因的结构优化与应用 - Google Patents

β-酮己二酸代谢相关三个基因的结构优化与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种优化后适用于大肠杆菌表达的β‑酮己二酸代谢相关的三个基因及其应用。每个基因都由独立的T7启动子和终止子控制，其核苷酸序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示，其编码的蛋白质的氨基酸序列分别如SEQ ID No 4、SEQ ID No 5和SEQ ID No 6所示。本发明优化合成的基因能够在大肠杆菌中成功表达，工程菌能够将β‑酮己二酸完全降解且以β‑酮己二酸为碳源生长，优化后基因可用于构建有机污染修复工程生物。

Description

β-酮己二酸代谢相关三个基因的结构优化与应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及结构优化的β-酮己二酸利用相关三个基因的序列。
背景技术
芳香族化合物是一类重要的有机污染物，它能通过各种工业、农业、制药和市政排放等人类活动进入环境造成污染。而传统的污染修复方式主要是物理和化学方法，存在成本高、设施复杂、修复效率低等问题。通过生物处理，修复环境中的芳香族污染物是一个可行的替代方案。对降解机理的深入研究，有助于我们充分利用丰富的自然资源。
目前已发现许多好氧细菌和真菌能够以某种芳香族化合物为唯一碳源和能源，这证明在这些微生物中存在这些芳香族化合物的代谢途径。目前，普遍认为微生物可以在有氧或者厌氧条件下对芳香族化合物降解先是通过外围代谢途径（Peripheral catabolicpathway）将不同的酚类化合物转化为少数几种核心代谢产物（Predominant products）包括：邻苯二酚、对苯二酚及它们的衍生物等，而这些核心代谢产物再通过一些相同或相似的核心代谢途径（Central catabolic pathway）转化为三羧酸循环的中间代谢物（Citratecycle itermediates），最终为微生物所利用。
β-酮己二酸途径就是一个广泛存在于土壤细菌和真菌中核心代谢途径。核心代谢产物原儿茶酸或邻苯二酚通过不同的分支形成beta-酮己二酸内酯，之后通过共同途径生成β-酮己二酸。而β-酮己二酸再通过β-酮己二酸琥珀酰辅酶A转移酶和β-酮己二酸单酰辅酶A硫解酶的催化生成琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A，从而进入三羧酸循环，为微生物所利用。这一代谢途径是许多芳香族化合物降解的最终通路，也是将降解产物与三羧酸循环链接的桥梁，主要包括苯、酚、甲苯、苯甲酸、烷基苯、硝基酚、氯酚、萘等都能通过β-酮己二酸途径降解。
虽然目前已知大量微生物具有有机污染物降解能力，但具体到能降解某一特定种类物质时，可供选择的微生物数量和种类比较有限，难以满足生物修复技术的需求。通过生物技术手段，选择合适的宿主，构建污染修复工程生物是一种可行的解决方案。而beta-酮己二酸到琥珀酰辅酶A和乙酰辅酶A转化，是β-酮己二酸途径是不同代谢分支汇合后的最终代谢过程，是将有机污染物中的碳原子引入微生物自身代谢网络并供其利用的桥梁，是构建多种不同有机污染修复工程生物的基础，因此成功实现这一代谢途径的异源表达具有重要的意义及应用潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供能够在大肠杆菌中表达的β-酮己二酸代谢相关三个基因的优化重组与应用：
pcaI基因：编码β-酮己二酸琥珀酰辅酶A转移酶a亚基
pcaJ基因：编码β-酮己二酸琥珀酰辅酶A转移酶b亚基
pcaF基因：编码β-酮己二酸单酰辅酶A硫解酶
β-酮己二酸经过两步酶促反应生成珀酰辅酶A和乙酰辅酶A。
基于Rhodococcussp.DK17菌基因簇（DQ346669.1）中的pcaI基因和pcaJ基因与Rhodococcus sp. PBTS2菌基因组（CP015220.1）中的pcaF基因。本发明只保留每个基因的编码序列，并分别连接上独立的T7启动子和终止子调控其表达。同时优化编码区基因结构，遵循以下原则：（一）优化基因密码子，提高基因翻译效率。（二）消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。（三）消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。（四）使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性。（五）优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。
所述经优化的β-酮己二酸代谢相关三个基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1、SEQID No 2和SEQ ID No 3所示。每个基因两端分别边上T7启动子与终止子，完整序列两端分别连接EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，全长序列由生工生物工程（上海）股份公司（参见图1）。
将合成的基因片段经EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a，得到重组质粒pET-pca，并将其转化大肠杆菌BL21(DE3)，得到阳性株系。
阳性菌株在100毫升M9(含1%甘油和50μg/ml卡那霉素)液体培养中37℃摇菌24小时，离心去上清，菌体用10毫升M9(含1%甘油、0.2%阿拉伯糖、50μg/ml卡那霉素和1mM IPTG)液体培养基重悬，向其中添加5mMβ-酮己二酸，阳性菌株能将培养基中的β-酮己二酸代谢。而且阳性菌株能够以β-酮己二酸为碳源生长。
有益效果：
本发明优化并合成了β-酮己二酸代谢相关三个基因，并能在大肠杆菌中成功表达，阳性菌株能够有效代谢培养基中的β-酮己二酸，并能以β-酮己二酸为碳源在生长。在废水处理和环境修复等领域具有应用潜力。
附图说明：
图1 为用于在大肠杆菌中表达邻苯二酚降解相关四个基因的载体示意图。
图2 为阳性株系对β-酮己二酸的利用。
图3 为阳性株系在以5mMβ-酮己二酸为碳源的M9的液体培养基中的生长。
图4 为阳性株系在以5mMβ-酮己二酸为碳源的M9的固体培养基中的生长。
具体实施方式：
下面结合具体实施方式来进一步阐述本发明。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
本发明实施中未注明的实验方法，如连接、转化、相关培养基的配制等参照分子克隆实验指南第三版（黄培堂等译，中国，科学出版社，2002）中方法进行。所用大肠肝菌由上海市农业科学院生物技术研究所植物基因工程研究室保存，各类限制性内切酶、连接酶等购自上海皓嘉公司。未注明的化学药品为分析纯级，购自生工生物工程（上海）股份公司或上海国药集团有限公司。
实施例 1
beta-酮己二酸代谢相关三个基因pcaI、pcaJ和pcaF基因的优化设计与合成
将来源于不同菌株的三个基因pcaI、pcaJ和pcaF基因的编码序列，按以下原则：（一）优化基因密码子，兼顾大肠杆菌和植物的密码子偏爱，提高基因翻译效率。（二）消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。（三）消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。（四）使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性。（五）优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。每个基因两端分别边上T7启动子与终止子，完整序列两端分别连接EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点，全长序列由生工生物工程（上海）股份公司合成。
实施例 2
大肠杆菌表达载体的构建与转化
将合成的基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后，连入相同酶切的载体pET-28a，得到重组质粒pET-pca。并将其通过热激转化大肠杆菌BL21(DE3)，在涂布在加有卡那霉素抗性人固体2YT平板上，37℃过夜培养后得到阳性克隆。对阳性克隆中的质粒进行酶切和DNA序列测定确定基因序列完整性和正确性。
实施例 3
阳性菌株对β-酮己二酸的降解与利用
阳性菌株在100毫升M9(含1%甘油和50μg/ml卡那霉素)液体培养中37℃摇菌24小时，离心去上清，菌体用10毫升M9(含1%甘油、0.2%阿拉伯糖、50μg/ml卡那霉素和1mM IPTG)液体培养基重悬，向其中添加5mMβ-酮己二酸，阳性菌株能将培养基中的β-酮己二酸消耗（参见图2）。
当将按上述条件培养24小时的阳性菌株，用M9碳源用5mMβ-酮己二酸替代的液体培养基（不加甘油与酪蛋白水解物）重悬为OD600=0.5左右时，于30℃摇菌24小时后菌量较对照明显增加（参见图3）；将重悬的菌，于M9碳源用5mMβ-酮己二酸替代的固体培养基30℃培养5天后，长出明显菌落（参见图3）。
培养基中β-酮己二酸的GC-MS检测方法：
取10mL发酵液，使用液氮冻融的方法将细胞破壁，超声波提取后，离心取上清液，冻干后加入衍生化试剂BSTFA，60℃下衍生半小时，待GC-MS检测。
气相色谱-质谱联用仪（GC-MS/MS，7890B-7000C，美国Agilent公司）；HP-5 MS毛细管柱（30m×0.25mm×0.25μm，美国Agilent公司）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；超声机（上海一恒科学仪器有限公司）、氮吹仪（上海安谱科技有限公司）、超纯水系统（美国Merck Millipore 公司）。
色谱条件：色谱柱：Agilent HP-5 MS毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 µm）；载气He（99.999%），流速1.0mL/min；进样口温度290 ℃；升温程序：100 ℃以40 ℃/min升至160℃，再以10 ℃/min升至250 ℃，最后以20 ℃/min升至300 ℃；进样量1.0 μL，分流比50:1。
GC-MS质谱分析条件：电子轰击离子源（EI），电离能量70 eV；全扫描（scan）模式，扫描范围m/z：50 ~ 400；离子源温度230 ℃，四级杆温度150 ℃，接口温度300℃。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> β-酮己二酸代谢相关三个基因的结构优化与应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 750
<212> DNA
<213> artifical synthesize
<400> 1
atggtgaaca aggtgttcgc aactgctgct gaggctgttg ctgatgttcc tgacggtgca 60
tcacttgctg ttggtggctt tggactcgtg ggaatcccat ctgtcctgat cgatgcactg 120
cttgcacaag gtgcaactga tctggagact gtgtccaaca actgtggaac tgacggcttc 180
ggactgggac tgctgcttga gcagcatcgt atccgtcgta ccatctcatc ctacgttggt 240
gccaacaagg agttcgcacg tcagtacctg tctggtgagc tggaggttga gctgactcca 300
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cctgctggtg ttggaactca ggttgctgat ggtggactgc caatccgtta cgatggacaa 420
ggaggcatcg ctgttgcatc caagcctaag gagactcgtg agttcgatgg tgaggcattc 480
gttcttgaac gtgccatccg taccgacttc gcactggttc atgcatggaa gggtgatcgt 540
cttggcaacc ttgtgtatcg tgagactgca cgtaacttca atcctgatgc tgctggtgct 600
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<211> 642
<212> DNA
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<212> DNA
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<211> 249
<212> PRT
<213> artifical synthesize
<400> 4
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1 5 10 15
Pro Asp Gly Ala Ser Leu Ala Val Gly Gly Phe Gly Leu Val Gly Ile
20 25 30
Pro Ser Val Leu Ile Asp Ala Leu Leu Ala Gln Gly Ala Thr Asp Leu
35 40 45
Glu Thr Val Ser Asn Asn Cys Gly Thr Asp Gly Phe Gly Leu Gly Leu
50 55 60
Leu Leu Glu Gln His Arg Ile Arg Arg Thr Ile Ser Ser Tyr Val Gly
65 70 75 80
Ala Asn Lys Glu Phe Ala Arg Gln Tyr Leu Ser Gly Glu Leu Glu Val
85 90 95
Glu Leu Thr Pro Gln Gly Thr Leu Ala Glu Arg Met Arg Ala Gly Gly
100 105 110
Ala Gly Ile Pro Ala Phe Tyr Thr Pro Ala Gly Val Gly Thr Gln Val
115 120 125
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130 135 140
Val Ala Ser Lys Pro Lys Glu Thr Arg Glu Phe Asp Gly Glu Ala Phe
145 150 155 160
Val Leu Glu Arg Ala Ile Arg Thr Asp Phe Ala Leu Val His Ala Trp
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Phe Asn Pro Asp Ala Ala Gly Ala Gly Arg Ile Thr Ile Ala Gln Val
195 200 205
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Pro Gly Ile Phe Val Gln Arg Val Val Glu Val Gly Lys Gln Glu Thr
225 230 235 240
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245
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145 150 155 160
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Val Ile Asp Val Thr Pro Asp Gly Leu Arg Leu Val Glu Thr Ala Pro
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Gly Gly Val Glu Ser Met Ser Gln Thr Glu Phe Tyr Ala Thr Gly Met
115 120 125
Arg Trp Gly Val Lys Ala Glu Ala Val Ala Leu Ser Asp Arg Leu Ala
130 135 140
Arg Ala Arg Val Thr Ala Gly Gly Lys Asn Phe Pro Val Pro Gly Gly
145 150 155 160
Met Ile Glu Thr Ala Glu Asn Leu Arg Gln Glu Phe Ser Ile Ser Arg
165 170 175
Ala Asp Gln Asp Ala Leu Ala Val Gln Ser His Arg Arg Ala Val Ala
180 185 190
Ala Gln Asn Ser Gly Val Phe Ala Glu Glu Ile Val Gly Val Ser Val
195 200 205
Pro Gln Arg Lys Ser Glu Pro Val Leu Val Ser Thr Asp Glu His Pro
210 215 220
Arg Ala Asp Thr Thr Val Glu Ser Leu Ala Lys Leu Lys Ala Ile Arg
225 230 235 240
Ala Ser Ile Asp Pro Glu Ser Thr Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly
245 250 255
Gln Asn Asp Gly Ala Ala Ile Ala Ile Val Thr Thr Pro Glu Lys Ala
260 265 270
Ala Ala Leu Gly Leu Arg Pro Leu Ala Arg Leu Ala Ser Trp Gly Val
275 280 285
Ala Gly Val Ala Pro Arg Thr Met Gly Ile Gly Pro Val Pro Ala Ser
290 295 300
Glu Lys Ala Leu Gly Arg Leu Gly Leu Thr Leu Asp Asp Met Gly Val
305 310 315 320
Ile Glu Leu Asn Glu Ala Phe Ala Ala Gln Ala Leu Ala Val Thr Arg
325 330 335
Ser Trp Gly Ile Glu Ser Asp Asp Pro Arg Leu Asn Pro His Gly Ser
340 345 350
Gly Ile Ser Leu Gly His Pro Val Gly Ala Thr Gly Ala Arg Ile Leu
355 360 365
Ala Thr Leu Leu Arg Glu Met Asp Arg Arg Glu Val Arg Tyr Gly Leu
370 375 380
Glu Thr Met Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly Leu Ala Ala Val Phe Glu
385 390 395 400
Arg Leu Ser

Claims (4)

1.人工优化后的β-酮己二酸利用相关的三个基因，其特征在于，这三个基因的核苷酸序列分别如SEQ ID No 1、SEQ ID No 2和SEQ ID No 3所示。
2.根据权利要求1所述的三个基因的核苷酸序列，其特征在于，其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No 4、SEQ ID No 5和SEQ ID No 6所示。
3.根据权利要求1所述的三个基因的核苷酸序列构建大肠杆菌表达载体pET-pca，其特征在于，每段基因序列均与T7启动子和终止子相连组成一个表达单元，将三个表达单元串连插入表达载体。
4.根据权利要求3所述的大肠杆菌表达载体，其特征在于，该载体转化大肠杆菌后，阳性菌株将β-酮己二酸完全降解且以β-酮己二酸为碳源生长。
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