CN111662477A - 一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，包括如下步骤：在低功率的等离子体条件下短时间内处理硝酸纤维素膜，以活化硝酸纤维素表面；将甲基丙烯酸MAA以气态方式通入真空腔中，等离子体引发气态的MAA与硝酸纤维素膜表面进行接枝反应，得到等离子体改性表面富含羧基的硝酸纤维素膜；将改性后的膜表面喷涂1‑环已基‑2‑吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸CMC反应生成具有活性基团可用于蛋白固定的硝酸纤维素膜，所得改性的膜真空干燥保存，可用于免疫层析试纸的制备。该改性方法具有操作简单、处理效率高等优点，所得改性膜具有较强的亲水性、较高的蛋白负载量，以及蛋白固定稳定的特点，在免疫层析项目中可以提高试剂性能，避免试纸条检测中的拖尾现象，降低抗体用量等优点。

Description

一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法
技术领域
本发明涉及临床医学检测试纸用抗体，具体涉及一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法。
背景技术
免疫层析技术是一种操作简单，检测快速，应用方便便携，结果直观可靠的免疫学检测技术，在现代POCT(point of care testing)中占有重要地位。目前免疫层析技术已经比较成熟，在诊断领域有着广泛的应用。其中硝酸纤维素膜材料因为拥有低成本、毛细流动稳定和拥有不同的吸水速率和表面活性组分的特点，从而被绝大多数免疫层析诊断产品系统选用。尽管硝酸纤维素膜有这些积极的特性，硝酸纤维素膜也有许多的缺陷，包括：膜蛋白负载量偏低，负载固定足量蛋白易出现拖尾现象，膜结构易受环境变化(例如湿度)影响，检测批间性能和重复性差。
此外对于高性能指标要求的检测项目，往往通过增加硝酸纤维素膜的划线抗体用量，来提高实际性能，这样不仅加大了检测成本，同时也不易达到预期的检测要求。一方面，过高的抗体蛋白无法在硝酸纤维素膜上固定，导致在毛细流动下产品拖尾，破坏原本在检测线处的反应，另一方面硝酸纤维素与抗体蛋白只是简单的物理吸附效果，抗体自身以受环境影响，不能形成有效的固定，使得抗体的抗原决定簇表位利用率降低，导致捕获抗原能力降低，因此如何提高硝酸纤维镀膜的蛋白负载量，加强抗体固定效率，对于提高免疫层析试纸条的性能起到极大的作用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法。该改性方法具有操作简单、处理效率高等优点，所得改性硝酸纤维素膜具有较强的亲水性、较高的蛋白负载量，以及蛋白固定稳定的特点，在免疫层析项目中可以提高试剂性能，避免试纸条检测中的拖尾现象，降低抗体用量等优点。
本发明提供如下技术方案：
一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，包括以下步骤：
S1、在低功率的等离子体条件下短时间内处理硝酸纤维素膜，以活化硝酸纤维素膜表面；
S2、将甲基丙烯酸(MAA)以气态方式通入真空腔中，等离子体引发气态的甲基丙烯酸(MAA)与硝酸纤维素膜表面进行接枝反应，得到表面含有甲基丙烯酸接枝低聚物的硝酸纤维素膜；
S3、将改性后的接枝聚合物硝酸纤维素膜，通过在检测线区域进行喷涂的方式，向羧基结构引入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸(CMC)溶液进行化学反应，并形成碳二酰亚胺酯活化膜；
S4、对碳二酰亚胺酯活化膜进行真空干燥保存，使用时，采用划线进行抗体固定。
作为优选，等离子体的处理功率为10-20W，处理时间为30-300s。
作为优选，接枝反应在功率为10-20W的条件下进行，反应时间为60-600s。
作为优选，接枝物为含有C＝C双键的羧酸小分子，如甲基丙烯酸、丙烯酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、衣康酸、巴豆酸、马来酸、肉桂酸等。
作为优选将甲基丙烯酸液体采用真空泵低压气化的方法，通过鼓泡机引入等离子体反应腔体，进行接枝反应。
作为优选，将等离子体改性后所得的低聚物接枝硝酸纤维素膜，于35-45℃下干燥5-15h。
作为优选，使用低沸点醇酮类物质溶解浓度为1-10mg/ml的1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸溶液，向羧基改性后的硝酸纤维素膜采用喷涂的方式，喷量1-4ul/cm，进行羧基活化反应。
醇酮类物质选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丙酮。醇酮类物质优选甲醇。
作为优选，羧基活化后的硝酸纤维素膜，置于真空干燥箱中进行真空干燥保存，湿度小于20％，压力0.1MPa，干燥时间3-8小时。
本发明还提供了如上述技术方案所述的改性的硝酸纤维素膜在免疫层析中的应用。
低温等离子体表面处理是一种新型的表面处理手段，它主要是利用低温等离子体离子轰击材料表面，使得材料表面及近表面层的分子发生化学键的断裂形成大量的自由基，通过引入相应的等离子体气氛，可在材料表面形成相应的低分子聚合物。进而对材料表面结构以及基团进行改性，可以提高材料表面的基团密度，提高材料亲水性能。
由于低温等离子体能量通常比常规共价键的键能高大约一个数量级，因此该方法对膜材料具有诱发化学接枝的性质。同时与传统的化学改性相比，低温等离子体改性聚合物效果显著，工艺简单。通过引入富含双键的羧基化合物，可以在膜材料表面接枝一些富含羧基的低聚物，可进一步利用羧基与抗体蛋白中的氨基进行缩合反应，从而提高硝酸纤维素膜材料的抗体蛋白固定性能。
其次利用1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸(CMC)对改性后的硝酸纤维素膜进行处理，可有效避免活化剂在水溶液中的水解失活的问题。疏水性的CMC修饰的碳二酰亚胺活性基团可在真空干燥的条件下长期保存，具有长效的蛋白固定性能。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明所提供的改性硝酸纤维素膜的方法，具有操作简单、运行高效，改性后硝酸纤维素膜所获得的接枝活性基团密度高的特点。改性硝酸纤维素膜可用于高效固定检测试纸检测线上的抗体，减少检测线抗体用量，提高免疫层析试纸条的反应性能。所改进的硝酸纤维素膜，能够提高硝酸纤维素膜的蛋白负载效能、提高蛋白在膜表面的固定能力，实现定点偶联等技术问题。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，包括以下步骤：
将硝酸纤维素膜在15W等离子体条件下处理90s，以活化硝酸纤维素膜表面；
将液体甲基丙烯酸MAA通过连接瓶并入真空泵，进行低压气化，并以鼓泡机以气态方式通入等离子体真空腔中，真空度为300pa，保持15W等离子体条件下引发气态的将液体甲基丙烯酸MAA与硝酸纤维素膜进行表面接枝反应，反应150s，得到MAA低聚物硝酸纤维素膜；
所得改性后的硝酸纤维素膜置于45℃烘箱下干燥12小时，在材料表面充分反应并固定所形成的低聚物。
将所得接枝MAA低聚物的硝酸纤维素膜进行1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸CMC喷涂处理，其中CMC使用甲醇溶解，配置浓度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm，喷涂后置于37℃的烘箱中干燥2小时；
将改性的碳二酰亚胺酯活化硝酸纤维素膜进行真空干燥处理，真空度0.1Mpa，干燥处理2小时。
实施例2
一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，与实施例1相比区别在于，在10W的等离子体条件下进行处理以及活化硝酸纤维素膜。
实施例3
一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，与实施例1相比区别在于，引入气态MAA进入等离子体腔体后，接枝反应时间为300s。
对比例1
无处理硝酸纤维素膜
与实施例1相比，同样厂家同样型号的硝酸纤维素膜，不进行等离子体表面接枝处理，同样也不进行1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸CMC活化处理。
对比例2
仅CMC处理硝酸纤维素膜
与实施例1相比，同样厂家同样型号的硝酸纤维素膜，不进行等离子体表面接枝处理，只进行CMC喷涂处理，其中CMC使用甲醇溶解，配置浓度为10mg/ml，喷涂量为4ul/cm，喷涂后进行真空干燥处理，真空度0.1Mpa，干燥处理2小时。
实施例4
以下是针对实施例1改性后的硝酸纤维素膜的抗体蛋白固定过程：
使用pH为10.0的PBS缓冲液稀释抗体，配置为50μg/ml的抗体溶液，用喷金划膜仪在改性后硝酸纤维素膜上进行划线，划线量为1ul/cm。划线区域与喷涂CMC的区域保持重叠，且此区域为检测线T，将1mg/ml的羊抗鼠抗体溶液，距离检测线约8mm处作为质控线C，进行划线操作，划线量为1ul/cm，检测线和质控线划好后放入37℃烘箱烘2～5h。
样品垫为玻璃纤维素膜宽度约为1.7cm，浸没在含有0.5％Tween-20的0.01M的PH＝7.4的Tris-HCl缓冲液作为样品垫的处理液，浸润10～15min后，放入37℃烘箱烘1.5～2h；结合垫为玻璃纤维素膜宽度约为5mm，浸没在含有5％蔗糖、5％PVP10000、2％Tween-20、3％BSA的0.01M的PH＝7.4的PBS缓冲液作为结合垫的处理液，浸润10～15min后，放入37℃烘箱烘1.5～2h。
配置5％蔗糖、5％BSA、0.1％Tween-20、1％PEG4000的0.01M的PH＝7.4的PBS缓冲液作为荧光微球保存液，将荧光微球稀释至2mg/ml，以喷金浓度为4ul/cm在结合垫处进行喷金处理，浸润10～15min，同样37℃烘箱烘1.5～2h。将处理好的样品垫，结合垫依次粘贴在试纸条上，装入用公司定制的塑料底板进行组装。
对组装好的试纸条进行不同浓度的抗原的反应测试，将抗原稀释液滴加到塑料卡壳的样品池处，反应15min后，放置与荧光免疫分析仪中进行精确读数。
以上操作均为制备免疫层析试纸条的一般步骤，在实施例2以及实施例3采用相同的操作，不再赘述。
实施例5
与实施例4相比，区别在于抗体划线工艺采用的膜为未非改性硝酸纤维膜。
实施例6
与实施例4相比，区别在于抗体划线工艺采用的膜为未非等离子体改性硝酸纤维膜，但进行CMC喷涂处理的硝酸纤维素膜。
实施例7
与实施例4相比，区别在于抗体划线工艺中，抗体配置浓度为25ug/ml。
实施例8
与实施例4相比，区别在于抗体划线工艺中，抗体配置浓度为12.5ug/ml。
实施例9
与实施例4相比，制备改性后的硝酸纤维素膜再干燥条件下保存24天后，再进行划线、干燥、组装等操作。
性能测试：
实施例1：
在SAA项目上，分别测定抗原浓度为5ng/mL的校准品以及抗原稀释液，每个浓度测量三次重复，在荧光免疫分析仪上检测读出检测线以及控制线的数值，即T值和C值，按照T/C的强度值做均值，信噪比为11.52。
Figure BDA0002534243220000071
实施例2：
在SAA项目上，分别测定抗原浓度为5ng/mL的校准品以及抗原稀释液，每个浓度测量三次重复，在荧光免疫分析仪上检测读出检测线以及控制线的数值，即T值和C值，按照T/C的强度值做均值，信噪比为7.43。
Figure BDA0002534243220000072
实施例3：
在SAA项目上，分别测定抗原浓度为5ng/mL的校准品以及抗原稀释液，每个浓度测量三次重复，在荧光免疫分析仪上检测读出检测线以及控制线的数值，即T值和C值，按照T/C的强度值做均值，信噪比为17.63。
Figure BDA0002534243220000081
对比例1：
在SAA项目上，分别测定抗原浓度为5ng/mL的校准品以及抗原稀释液，每个浓度测量三次重复，在荧光免疫分析仪上检测读出检测线以及控制线的数值，即T值和C值，按照T/C的强度值做均值，信噪比为3.04。
Figure BDA0002534243220000082
对比例2：
在SAA项目上，分别测定抗原浓度为5ng/mL的校准品以及抗原稀释液，每个浓度测量三次重复，在荧光免疫分析仪上检测读出检测线以及控制线的数值，即T值和C值，按照T/C的强度值做均值，信噪比为2.92。
Figure BDA0002534243220000091
实施例7：
在SAA项目上，分别测定抗原浓度为5ng/mL的校准品以及抗原稀释液，每个浓度测量三次重复，在荧光免疫分析仪上检测读出检测线以及控制线的数值，即T值和C值，按照T/C的强度值做均值，信噪比为4.61。
Figure BDA0002534243220000092
实施例8：
在SAA项目上，分别测定抗原浓度为5ng/mL的校准品以及抗原稀释液，每个浓度测量三次重复，在荧光免疫分析仪上检测读出检测线以及控制线的数值，即T值和C值，按照T/C的强度值做均值，信噪比为2.16。
Figure BDA0002534243220000093
实施例9：
在SAA项目上，分别测定抗原浓度为5ng/mL的校准品以及抗原稀释液，每个浓度测量三次重复，在荧光免疫分析仪上检测读出检测线以及控制线的数值，即T值和C值，按照T/C的强度值做均值，信噪比为10.56。
Figure BDA0002534243220000101
本发明提供的硝酸纤维素膜的改性方法，先利用等离子活化膜表面，使其结构中C-C和C-H键被破坏生成自由基，再利用等离子引发气态的甲基丙烯酸(MAA)与膜表面活性自由基发生接枝共聚反应。利用了甲基丙烯酸易挥发的特点，在低压条件下，通过鼓泡器将低浓度的甲基丙烯酸单体引入等离子体反应腔中，气态引发接枝相较常规等离子体处理后浸泡的方法来说，反应效率更高，不仅避免大量液体对硝酸纤维素膜的浸润破坏，同时还避免液体浸泡反应时，水分子参与等离子体生产的自由基的猝灭效应。所获得的材料表面接枝效率更高，且硝酸纤维素膜可自身保持原先多孔结构不发生变化。
将单体MAA接枝到硝酸纤维素膜表面后，获得羧基改性的硝酸纤维素膜再与1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸(CMC)反应得到具有碳二酰亚胺活性酯的硝酸纤维素膜。相较于常规1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)这类活化剂而言，CMC的疏水性更强，与膜材料表面反应效率更高，可利用甲醇等易挥发液体进行微量喷涂反应，避免活化剂在于水溶液接触导致水解失活的问题。
改性后的硝酸纤维素膜具有较多的碳二酰亚胺反应基团，可与抗体蛋白进行化学键固定偶联，避免检测时抗体在硝酸纤维素膜上由于毛细作用了而产生拖尾现象。
相较传统划线时在硝酸纤维素膜上的吸附模式，不可避免的划线蛋白在毛细作用下也会发生位移现象，而化学偶联的方式固定划线蛋白不仅可以解决划线蛋白固定的问题，同时改性的硝酸纤维素膜可提供更多的反应基团，提高反应效率，进而提高载量，获得更好反应性能。在获得相同试剂性能的前提下，改性硝酸纤维素膜材料也可相应减少抗体原料的损耗。同时疏水性的CMC活化剂修饰的碳二酰亚胺活性基团可在真空干燥的条件下长期保存，避免了水解受潮而导致的活性基团的失活。
结论：
由上可见，本发明实施例中提供的表面处理改性的硝酸纤维素膜，可以有效的提高蛋白负载量，提高实际的检测性能，稳定蛋白的固定。等离子体改性是的硝酸纤维素膜表面引入了大量的羧基基团，并可以进行化学固定，而单纯的CMC活化剂并不能提高硝酸纤维素膜材料的性能。此改性方法可有效应用在免疫层析试剂的开发中，提高实际灵敏度，改善试剂性能，并有助于节省抗体原料，降低试剂成本。
与其他改性方法相比，本发明所提供的改性硝酸纤维素膜的方法具有操作简单、运行高效，改性后硝酸纤维素膜所获得的接枝活性基团密度高的特点。与非改性硝酸纤维素膜相比试剂性能提高明显，灵敏度提高4-6倍，膜材料稳定性良好，长期放置后仍保持到高性能水平，获得相同的反应性能，改性的硝酸纤维素膜对比未改性膜，在检测项目获得相同性能时抗体用量可减少3-4倍。尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、在低功率的等离子体条件下，短时间内处理硝酸纤维素膜，以活化硝酸纤维素膜表面；
S2、将甲基丙烯酸以气态方式通入真空腔中，等离子体引发气态的甲基丙烯酸与硝酸纤维素膜表面进行接枝反应，得到表面含有甲基丙烯酸接枝低聚物的硝酸纤维素膜；
S3、将改性后的接枝聚合物硝酸纤维素膜，通过在检测线区域进行喷涂的方式，向羧基结构引入1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸溶液进行化学反应，并形成碳二酰亚胺酯活化膜；
S4、对碳二酰亚胺酯活化膜进行真空干燥保存，使用时，采用划线进行抗体固定。
2.根据权利要求1所述的一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，其特征在于：所述等离子体的处理功率为10-20W，处理时间为30-300s。
3.根据权利要求1所述的一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，其特征在于：所述接枝反应在功率为10-20W的条件下进行，反应时间为60-600s。
4.根据权利要求1所述的一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，其特征在于：所述接枝物为含有C＝C双键的羧酸小分子。
5.根据权利要求4所述的一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，其特征在于：含有C＝C双键的羧酸小分子选自甲基丙烯酸、丙烯酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸、衣康酸、巴豆酸、马来酸或肉桂酸。
6.根据权利要求1所述的一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，其特征在于：将甲基丙烯酸液体采用真空泵低压气化的方法，通过鼓泡机引入等离子体反应腔体，进行接枝反应。
7.根据权利要求1所述的一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，其特征在于：将等离子体改性后所得的低聚物接枝硝酸纤维素膜，于35-45℃下干燥5-15h。
8.根据权利要求1所述的一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，其特征在于：使用低沸点醇酮类物质溶解浓度为1-10mg/ml的1-环已基-2-吗啉乙基碳二亚胺对甲苯磺酸溶液，向羧基改性后的硝酸纤维素膜采用喷涂的方式，喷量1-4ul/cm，进行羧基活化反应。
9.根据权利要求8所述的一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，其特征在于：所述醇酮类物质选自甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇或丙酮。
10.根据权利要求1所述的一种应用在免疫层析上硝酸纤维素膜的改性方法，其特征在于：羧基活化后的硝酸纤维素膜，置于真空干燥箱中进行真空干燥保存，湿度小于20％，压力0.1MPa，干燥时间3-8小时。
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