CN111650287A - 用于检测活动性肺结核的粪便中小肽及其检测系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了用于检测活动性肺结核的粪便中小肽，所述小肽的氨基酸序列选自AIR、KVH、SEQ ID NO：1～6；其检测系统包括参数采集设备和数据处理装置，通过对待测样品粪便进行LC‑MS检测，分别得到8种小肽的相对表达量，再根据这些小肽的相对表达量大小判断待测样品是否为活动性肺结核患者。与传统方法相比，本发明的方法具有非侵入、样本处理简单、样本无破坏性、进样量少、重复性较好、成本低等优点。

Description

用于检测活动性肺结核的粪便中小肽及其检测系统

技术领域

本发明涉及生物标志物技术领域，更具体地，涉及用于诊断活动性肺结核的粪便代谢物 及其检测系统。

背景技术

结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染 引起的一种广泛存在且在许多情况下可致命的慢性传染病，可侵袭累及许多脏器，其中肺部 感染占绝大部分。尽管结核的发病率近年来在缓慢下降，但在2018年，全球范围内仍有约 1000万例新患病例，死亡人数170万人左右。结核病已成为威胁人类健康的全球性问题，并 成为某些发展中国家和地区，尤其是艾滋病高发区人群死亡的首要原因。

结核病的早期诊断和及时的抗结核治疗对于有效控制结核病的进展和结核分枝杆菌的传 播具有重要意义。目前诊断结核感染的方法有限,主要包括痰涂片、痰细菌液体培养、结核分 枝杆菌素皮肤实验(TST)、放射性X光片、血清学抗体抗原免疫检测以及核酸扩增试验 (NAATs)如聚合酶链反应(PCR)、实时PCR、环介导等温扩增(LAMP)等。其中，病原学检测是肺结核诊断金标准，然而存在较多不足。例如痰涂片染色镜检虽然简单易行，但是大多数情况下，结核病人痰里面并不一定有结核分枝杆菌，因此镜检检出率较低。另外，液体培养法能略提高阳性率，但耗时太长(需2-6周)，且需要专门的生物安全三级实验室。在免疫学诊断方面,结核分枝杆菌素皮肤实验(TST)所使用的结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD) 中含有许多分枝杆菌种类(包括致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和BCG)所共有的抗原分子， 因此PPD诊断结核病的特异性差,不能准确区分PPD实验结果阳性究竟是因为BCG接种、接 触环境中多种非结核分枝杆菌后的致敏还是真正的结核分枝杆菌感染所致。其他免疫学诊断 技术,例如T-SPOT.TB试剂盒和QuantiFERON-TB Gold试剂盒虽然精确度有所提高，但是操 作复杂、价格昂贵、成本极高，严重地制约了其用于数以百万计的活动性结核患者以及数以 亿计的结核潜伏感染人群进行大规模结核筛查与诊断。在PCR方面，最新的基于实时PCR 的xpertMTB/RIF技术敏感性比涂片镜检显著提高，但其高昂的费用以及在利福平耐药低流行 地区存在较高的假阳性限制了它的广泛应用。因此目前仍需寻找一种可以提前准确预测或者 筛查结核病的检测方法，以提前做出预防和治疗，避免错过最佳治疗时机。

基因的表达通过转录和翻译过程得以实现，最终结果表现在生物体或细胞的代谢水平及 相关的终代谢产物上。代谢组学(Metabonomics)研究的是细胞或生物体在应对各种体内外 或细胞内外刺激因素时产生的内源性代谢物的变化，然后可以通过处于代谢循环通路上的某 些关键化合物的定性和定量分析，来预测或解释说明由该刺激引起的细胞或生物体变化是定 位于何种通路。代谢组学以生物系统中的代谢产物(主要针对相对分子质量1000以下的小分 子)为分析对象：常见的生物样本包括生物体液(尿液、血清、血浆、脑脊液、汗液等)、个 体动物或人体组织(肿瘤、肝脏、炎症组织等)和细胞及粪便等。通常以高通量的现代仪器 分析方法为手段，分为质谱和核磁共振两大类。

核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)技术的特点是对样本的需求量少、样品前 处理较简单。NMR技术最大的劣势在于较低的灵敏度、分辨率不足、高丰度分析物经常会掩 盖低丰度的分析物。相对于NMR技术的缺点如低分辨率、检测动态范围小等，质谱具有相 对较高的灵敏度和专一性，可以实现对多个样品快速分析与鉴定。现在开展的代谢组学实验 应用最广泛的仪器平台是气相色谱-质谱连用(Gas Chromatography-MassSpectrometry， GC-MS)和液相色谱-质谱连用(Liquid Chromatography-MassSpectrometr，LC-MS)。GC-MS 更适合分析小分子、热不敏感、可挥发、能气化的化合物。且具有较高的分辨率和灵敏度； 并且有可利用的较为经济的统一规范的质谱数据库。相对于GC-MS，LC-MS更偏向分析较 高极性、更高相对分子质量和对热敏感的化合物，且无需像GC-MS一样做复杂的化学衍生 化等样品前处理。LC-MS更适用于复杂生物样本中代谢产物的检测与潜在的生物标记物的鉴 定。

发明内容

本发明第一个方面的目的在于提供定量粪便中小肽的试剂在制备检测活动性肺结核的试 剂中的应用。

本发明第二个方面的目的在于提供一种用于诊断活动性肺结核的检测系统。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面，提供定量粪便中小肽的试剂在制备检测活动性肺结核的试剂中的 应用，所述小肽的氨基酸序列选自以下序列的至少一种：

AIR；

RVFD(SEQ ID NO：1)；

NETDL(SEQ ID NO：2)；

QFLE(SEQ ID NO：3)；

GEGFK(SEQ ID NO：4)；

KVH；

TERE(SEQ ID NO：5)；

VHFE(SEQ ID NO：6)。

根据本发明的一个方面所述的应用，所述小肽由氨基酸序列如下所示的8种小肽组成：

AIR；

RVFD(SEQ ID NO：1)；

NETDL(SEQ ID NO：2)；

QFLE(SEQ ID NO：3)；

GEGFK(SEQ ID NO：4)；

KVH；

TERE(SEQ ID NO：5)；

VHFE(SEQ ID NO：6)。

本发明的第二个方面，提供一种用于检测活动性肺结核的检测系统，所述检测系统包括 参数采集设备和数据处理装置；

其中，所述参数采集设备定量采集本发明第一个方面所述粪便中小肽的相对表达量；

所述数据处理装置基于参数采集设备获得的数据确定是否感染活动性肺结核。

根据本发明第二个方面所述的检测系统，所述粪便中小肽的相对表达量采用液相色谱- 质谱连用的方法获得。

根据本发明第二个方面所述的检测系统，所述粪便中小肽的相对表达量通过以下步骤获 得：

S1.液相色谱-质谱代谢组学检测样本中权利要求1所述粪便中小肽的相对表达量，采集 对应数据；

S2.对步骤S1中采集的数据进行处理分析，根据分析结果，诊断是否为活动性肺结核样 品。

根据本发明第二个方面所述的检测系统，步骤S1中所述液相色谱-质谱代谢组学检测中， 质谱检测的条件为轰击能量：30eV，8张二级谱图每50ms；ESI离子源参数设置如下：雾化 气压(GS1)：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：650℃，喷雾电压：5000 V。

根据本发明第二个方面所述的检测系统，步骤S2中所述诊断是否为活动性肺结核样本的 方法为：

当样本中本发明第一个方面所述粪便中小肽的相对表达量>2X健康人且>2X未感染肺结 核的结核分枝杆菌潜伏健康人样本中的相对表达量，则说明样本的来源患有活动性肺结核；

否则，说明样本的来源不患有活动性肺结核。

根据本发明第二个方面所述的检测系统，步骤S1所述液相色谱-质谱代谢组学检测采用 AB 5600Triple TOF质谱仪与Analyst TF 1.7,AB Sciex控制软件。

根据本发明第二个方面所述的检测系统，所述数据处理装置采用MS-DIALver.3.98软件。

根据本发明第二个方面所述的检测系统，所述MS-DIAL ver.3.98软件的设置参数为：

峰匹配：MS1容忍偏差：0.015Da(道尔顿)，保留时间容忍偏差：0.3min；

峰鉴定：精确质量容忍偏差(MS1):0.01Da(MS2):0.05Da；

鉴定评分阈值：60％。

本发明的有益效果是：

本发明提供了所述8种小肽作为标志物在诊断待测患者为活动性肺结核患者中的应用。 本发明提供了一种基于粪便LC-MS代谢组学技术区分活动性肺结核的方法。本发明的方法是 对待测患者粪便进行LC-MS检测，分别得到8种小肽的相对表达量，再根据这些小肽的相对 表达量大小判断待测患者是否为活动性肺结核患者。与传统方法相比，本发明的方法具有非 侵入、样本处理简单、样本无破坏性、进样量少、重复性较好、成本低等优点。

附图说明

图1为未感染MTB健康人(Un)组和活动性肺结核患者(ATB)组的多元化统计学分析。(A) PCA模型的得分图；(B)OrthoPLSDA模型得分图。分析数据使用MetaboAnalyst 4.0。

图2.潜伏性健康人(LTBI)组和活动性肺结核患者(ATB)组的多元化统计学分析。(2A) PCA模型的得分图；(2B)OrthoPLSDA模型得分图。分析数据使用MetaboAnalyst 4.0。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

表1下述实施例中实验设备

仪器	生产商
		超高效液相(EkspertUltraLC 110)	AB Sciex
高分辨质谱(AB Triple TOF 5600+)	AB Sciex
		色谱柱(ACQUITY UPLC HSS T3 1.8μm 2.1×100mm)	Waters

表2下述实施例中实验试剂

试剂	生产商
		乙腈(Acetonitrile)	Merck(Darmstadt,Germany)
甲醇(Methanol)	Merck(Darmstadt,Germany)
		甲酸(Formic acid)	CNW(Shanghai,China)
超纯水(Ultrapure water)	Merck(Darmstadt,Germany)

实施例1用于检测活动性肺结核的检测系统

一种用于检测活动性肺结核的检测系统，包括参数采集设备和具有如下数据处理功能的 数据处理装置：

利用LC-MS检测的待测患者粪便的结果进行分析，根据如下标准输出结论：若对待测患 者粪便中8种差异小肽的一种或多种，其相对表达量均>2X Un组平均值(即2倍的未感染 Mtb健康组的平均值)且相对表达量均>2X LTBI组平均值(即2倍的未感染Mtb健康组的平 均值)，则待测患者为或候选为活动性肺结核患者；上述8种差异小肽包括Ala Ile Arg、Arg Val Phe Asp、Asn Glu Thr Asp Leu、GlnPhe Leu Glu、Gly Glu GlyPhe Lys、Lys ValHis、Thr Glu Arg Glu和Val His Phe Glu，对应的氨基酸(缩写)序列如下所示：

AIR；

RVFD(SEQ ID NO：1)；

NETDL(SEQ ID NO：2)；

QFLE(SEQ ID NO：3)；

GEGFK(SEQ ID NO：4)；

KVH；

TERE(SEQ ID NO：5)；

VHFE(SEQ ID NO：6)。

所述参数采集设备包括检测待测患者粪便中8种差异小肽的相对表达量时使用的设备和/ 或试剂。

所述检测系统的使用方法，包括如下步骤：

(1)对待测患者、三个未感染Mtb健康人(Un)和三个Mtb潜伏健康人(LTBI)进行LC-MS 代谢组学检测，分别得到述8种差异小肽，序列如SEQ ID NO：1～8所示：AIR(SEQ ID NO：1)；RVFD(SEQ ID NO：2)；NETDL(SEQ ID NO：3)；QFLE(SEQ ID NO：4)；GEGFK (SEQ ID NO：5)；KVH(SEQ ID NO：6)；TERE(SEQ ID NO：7)；VHFE(SEQ ID NO： 8)的相对表达量。

(2)根据所述相对表达量，按照如下方法判断待测患者是否为活动性肺结核患者：若对 待测患者粪便中8种差异小肽的一种或多种，其相对表达量均>2X Un组平均值(即2倍的未 感染Mtb健康组的平均值)且相对表达量均>2X LTBI组平均值(即2倍的未感染Mtb健康 组的平均值)，则待测患者为或候选为活动性肺结核患者；否则，所述待测患者不为或候选 不为活动性肺结核患者。

上述系统或方法中，所述相对表达量通过如下方法获得：对待测患者粪便进行LC-MS代 谢组学检测，使用MS-DIAL ver.3.98软件对转换后abf文件进行峰寻找、峰对齐等数据处理， 同时基于一级与二级图谱搜索自主整合Metlint和MoNA的数据库，得到8种差异小肽的鉴 定结果及峰下面积；根据对应的平均保留时间和平均Mz的每种脂质的峰下面积，分别计算 得到其相对表达量。

上述系统或方法中，所述LC-MS代谢组学检测采用AB 5600Triple TOF质谱仪在控制软 件(Analyst TF 1.7,AB Sciex)控制下基于IDA功能进行待测患者粪便样本一级、二级质谱 数据的采集，观测粪便中的小分子。在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的 分子离子进行采集对应的二级质谱数据。轰击能量：30eV，8张二级谱图每50ms。ESI离子 源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度： 650℃，喷雾电压：5000V。

实施例2一种基于粪便LC-MS技术判断活动性肺结核的方法

1.研究对象纳入及分组

纳入人群来自于深圳慢病院，年龄18-60岁，且作息、饮食规律，不酗酒嗜烟。具体分 组如下：

(1)未感染结核菌的健康组(45人)即Mtb未感染者，该组人群无任何结核病及相关分枝 杆菌病症状及体征，且γ干扰素释放试验阴性(排除变态反应前期；免疫系统受干扰：应用糖 皮质激素等免疫抑制剂或营养不良及麻疹、百日咳等；免疫功能低下：严重结核病、各种危 重患者、淋巴细胞系统免疫缺陷等)(未做PPD人群，使用结核病抗体IgMIgG(胶体金法) 代替者，需完全阴性方可纳入未感染组)。

(2)感染结核菌的健康组(LTBI)(29人)

PPD皮试检查为阳性的人群并且γ干扰素释放试验阳性，但无任何结核病及相关分枝杆菌 病症状及体征，无法确诊为肺结核的群体，包括与排菌病人密切接触者、结核病防治临床与 实验室医师等高危人群。

(3)初诊为结核病且未进行治疗的患者组(44人)

依据肺结核诊断标准(WS288-2008)标准，经过临床、实验室及影像学检查确诊为肺结 核的患者。初治肺结核病患者指初次发现,并未接受任何抗结核药物治疗，或发现肺结核后虽 经不规则、不合理抗结核治疗，但疗程不超过1个月的病人；复发肺结核患者即为指初治失败 或治疗的病人再次复发的病人(去除查出肺结核后接受不规则、不合理化疗已经超过1个月这 一类患者)。

2.粪菌采集及保存

需用粪便采集管，粪菌样本量不少于5.0g，收集后需尽快(4小时内)保存于-20℃为佳， 保存时间不大于7天(市慢病防治中心收集-86℃保存)。

3.粪便样本收集与处理

(1)样品前处理

1)取样品放置4℃解冻，称取50mg。

2)加入1000μl甲醇乙腈水溶(2:2:1V/V)，涡旋1min。

3)-20℃度放置60min。

4)17000g，4℃，离心15min,取200μl上清溶液真空抽干。

5)用200μl乙腈水溶液(1:1V/V)溶解,17000g，4℃，离心15min，取120μl上清上机。

6)每个样品取10μl混合，制成QC样品。

4.LC-MS检测和数据收集

(1)仪器参数设置

流动相条件：

1)柱温35℃，上样量5μl

2)正离子模式：A：0.1％甲酸水；B：0.1％甲酸乙腈

3)按照表3流动相洗脱梯度表洗脱

表3流动相洗脱梯度表

4)质谱条件：

AB 5600Triple TOF质谱仪能够在控制软件(Analyst TF 1.7,AB Sciex)控制下基于IDA 功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的 分子离子进行采集对应的二级质谱数据。轰击能量：30eV，8张二级谱图每50ms。ESI离子 源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度： 650℃，喷雾电压：5000V。

5.LC-MS结果鉴定及多元统计学分析

(1)转格式：数据首先使用Analysis Base File Converter转换为.abf格式

(2)使用MS-DIAL ver.3.98软件对转换后abf文件进行峰寻找、峰对齐等数据处理， 同时基于一级与二级图谱搜索自主整合Metlint和MoNA的数据库，得到鉴定结果。

(3)MSDIAL软件设置参数：

峰匹配:MS1容忍偏差:0.015Da(道尔顿)，保留时间容忍偏差：0.3min

峰鉴定:精确质量容忍偏差(MS1):0.01Da(MS2):0.05Da

鉴定评分阈值:60％

(4)对于MSDIAL对齐鉴定出来数据，通过控制QC样品指标CV值小30％，才进行 统计分析，然后删除组内缺失值>50％的离子峰。采用TIC离子总和进行归一化，Logtransformation进行转换，应用MetaboAnalyst 4.0软件进行PCA分析。为强化组间差异，进一步采用Orthogonal signal correction-partial least squares discriminantanalysis(OrthoPLSDA)分 析。分析结果以得分图(scores plot)的形式表示。

未感染MTB健康人(Un)组和活动性肺结核患者(ATB)组的多元化统计学分析结果如图1 所示。其中，图1A为PCA模型的得分图；图1B为OrthoPLSDA模型得分图。潜伏性健康人(LTBI)组和活动性肺结核患者(ATB)组的多元化统计学分析结果如图2所示。其中，图2A为PCA模型的得分图；图2B为OrthoPLSDA模型得分图。

6.差异代谢产物的鉴定

搜索满足VIP值>1、倍数变化>2和P值<0.05的代谢产物，最终鉴定得到13个差异代谢 物，如表4所示。

表4未感染Mtb健康人(Un)、潜伏性健康人(LTBI)和活动性肺结核患者(ATB)粪便的 13种差异代谢物及其在粪便中的相对表达量。

根据表4中的8种差异小肽建立了如下判断待测患者为活动性肺结核患者的方法：

对待测患者粪便进行LC-MS检测，分别得到以上8种差异小肽的相对表达量；如一种或 多种脂质的相对表达量>2X Un组平均值(即2倍的未感染Mtb健康组的平均值)，则待测 患者为或候选为活动性肺结核患者。

实施例3区分待测患者为活动性肺结核患者的方法的验证

常规留取4例活动性肺结核患者(ATB)、4例Mtb潜伏健康人和5例未感染Mtb健康人的粪便(粪便来源于深圳慢病院，所有患者均经临床诊断确定，且患者和志愿者均知情)，按照实施例2中的基于粪便LC-MS代谢组学分析技术判断活动性肺结核患者的方法，分别得到8种小肽的相对表达量。8种小肽包括Ala Ile Arg、Arg Val Phe Asp、Asn Glu Thr AspLeu、 GlnPhe Leu Glu、Gly Glu GlyPhe Lys、Lys Val His、Thr Glu Arg Glu和Val HisPhe Glu。

检测结果表明：如表5所示，活动性肺结核患者粪便中8种差异小肽的相对表达量均>2X Un组平均值(即2倍的未感染Mtb健康组的平均值)且8种差异小肽的相对表达量均>2X LTBI 组平均值(即2倍的未感染Mtb健康组的平均值)。

表5 4例活动性肺结核患者(ATB)、4例Mtb潜伏健康人(LTBI)和5例未感染Mtb健康人(Un)的粪便中的8种差异小肽及其在粪便中的相对表达量。

上述检测结果均与实施例1中的区分待测患者为活动性肺结核患者的方法中的表述一致， 说明本发明的区分待测患者为活动性肺结核患者的方法准确，可以用于区分待测患者为活动 性肺结核患者。同时本发明的方法也可用于鉴定待测患者是否为活动性肺结核患者。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东省结核病控制中心

<120> 用于检测活动性肺结核的粪便中小肽及其检测系统

<130>

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Arg Val Phe Asp

1

<210> 2

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asn Glu Thr Asp Leu

1 5

<210> 3

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Phe Leu Glu

1

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Gly Glu Gly Phe Lys

1 5

<210> 5

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Thr Glu Arg Glu

1

<210> 6

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Val His Phe Glu

1

Claims (10)

1.定量粪便中小肽的试剂在制备检测活动性肺结核的试剂中的应用，所述小肽的氨基酸序列选自以下序列的至少一种：

AIR；

RVFD(SEQ ID NO：1)；

NETDL(SEQ ID NO：2)；

QFLE(SEQ ID NO：3)；

GEGFK(SEQ ID NO：4)；

KVH；

TERE(SEQ ID NO：5)；

VHFE(SEQ ID NO：6)。

2.根据权利要求1所述的应用，所述小肽由氨基酸序列如下所示的8种小肽组成：

AIR；

RVFD(SEQ ID NO：1)；

NETDL(SEQ ID NO：2)；

QFLE(SEQ ID NO：3)；

GEGFK(SEQ ID NO：4)；

KVH；

TERE(SEQ ID NO：5)；

VHFE(SEQ ID NO：6)。

3.一种用于检测活动性肺结核的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括参数采集设备和数据处理装置；

其中，所述参数采集设备定量采集权利要求1或2所述粪便中小肽的相对表达量；

所述数据处理装置基于参数采集设备获得的数据确定是否感染活动性肺结核。

4.根据权利要求3所述的检测系统，其特征在于，所述粪便中小肽的相对表达量采用液相色谱-质谱连用的方法获得。

5.根据权利要求4所述的检测系统，其特征在于，所述粪便中小肽的相对表达量通过以下步骤获得：

S1.液相色谱-质谱代谢组学检测样本中权利要求1或2中所述粪便中小肽的相对表达量，采集对应数据；

S2.对步骤S1中采集的数据进行处理分析，根据分析结果，诊断是否为活动性肺结核样品。

6.根据权利要求5所述的检测系统，其特征在于，步骤S1中所述液相色谱-质谱代谢组学检测中，质谱检测的条件为轰击能量：30eV，8张二级谱图每50ms；ESI离子源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：650℃，喷雾电压：5000V。

7.根据权利要求5所述的检测系统，其特征在于，步骤S2中所述诊断是否为活动性肺结核样本的方法为：

当样本中权利要求1或2中所述粪便中小肽的相对表达量>2X健康人且>2X未感染肺结核的结核分枝杆菌潜伏健康人样本中的相对表达量，则说明样本的来源患有活动性肺结核；

否则，说明样本的来源不患有活动性肺结核。

8.根据权利要求5至7任一所述的检测系统，其特征在于，步骤S1所述液相色谱-质谱代谢组学检测采用AB 5600Triple TOF质谱仪与Analyst TF 1.7,AB Sciex控制软件。

9.根据权利要求3至7任一所述的检测系统，其特征在于，所述数据处理装置采用MS-DIALver.3.98软件。

10.根据权利要求9所述的检测系统，其特征在于，所述MS-DIAL ver.3.98软件的设置参数为：

峰匹配：MS1容忍偏差：0.015Da(道尔顿)，保留时间容忍偏差：0.3min；

峰鉴定：精确质量容忍偏差(MS1):0.01Da(MS2):0.05Da；

鉴定评分阈值：60％。

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