CN112098529A - 用于检测活动性肺结核疗效的粪便代谢物及其检测系统 - Google Patents
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Abstract
本发明基于粪便LC‑MS代谢组学技术判断待测活动性肺结核患者经过抗结核药物标准治疗6个月后是否治愈的方法。本发明的方法是对待测患者粪便进行LC‑MS检测，分别得到14种差异代谢物的相对表达量，再根据这些差异代谢物的相对表达量大小判断待测患者是否被治愈。与传统方法相比，本发明的方法具有非侵入、样本处理简单、样本无破坏性、进样量少、重复性较好、成本低等优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物标志物技术领域，更具体地，涉及用于检测活动性肺结核疗效的粪便代谢物及其检测系统。
背景技术
结核病(Tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的一种广泛存在且在许多情况下可致命的慢性传染病，可侵袭累及许多脏器，其中肺部感染占绝大部分。尽管结核的发病率近年来在缓慢下降，但在2018年，全球范围内仍有约1000万例新患病例，死亡人数170万人左右。结核病已成为威胁人类健康的全球性问题，并成为某些发展中国家和地区，尤其是艾滋病高发区人群死亡的首要原因。
结核病的早期诊断和及时的抗结核治疗对于有效控制结核病的进展和结核分枝杆菌的传播具有重要意义。目前诊断结核感染的方法有限,主要包括痰涂片、痰细菌液体培养、结核分枝杆菌素皮肤实验(TST)、放射性X光片、血清学抗体抗原免疫检测以及核酸扩增试验(NAATs)如聚合酶链反应(PCR)、实时PCR、环介导等温扩增(LAMP)等。其中，病原学检测是肺结核诊断金标准，然而存在较多不足。例如痰涂片染色镜检虽然简单易行，但是大多数情况下，结核病人痰里面并不一定有结核分枝杆菌，因此镜检检出率较低。另外，液体培养法能略提高阳性率，但耗时太长(需2-6周)，且需要专门的生物安全三级实验室。在免疫学诊断方面,结核分枝杆菌素皮肤实验(TST)所使用的结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(PPD)中含有许多分枝杆菌种类(包括致病性分枝杆菌、环境分枝杆菌和BCG)所共有的抗原分子，因此PPD诊断结核病的特异性差,不能准确区分PPD实验结果阳性究竟是因为BCG接种、接触环境中多种非结核分枝杆菌后的致敏还是真正的结核分枝杆菌感染所致。其他免疫学诊断技术,例如T-SPOT.TB试剂盒和QuantiFERON-TB Gold试剂盒虽然精确度有所提高，但是操作复杂、价格昂贵、成本极高，严重地制约了其用于数以百万计的活动性结核患者以及数以亿计的结核潜伏感染人群进行大规模结核筛查与诊断。在PCR方面，最新的基于实时PCR的xpertMTB/RIF技术敏感性比涂片镜检显著提高，但其高昂的费用以及在利福平耐药低流行地区存在较高的假阳性限制了它的广泛应用。因此目前仍需寻找一种可以提前准确预测或者筛查结核病的检测方法，以提前做出预防和治疗，避免错过最佳治疗时机。
基因的表达通过转录和翻译过程得以实现，最终结果表现在生物体或细胞的代谢水平及相关的终代谢产物上。代谢组学(Metabonomics)研究的是细胞或生物体在应对各种体内外或细胞内外刺激因素时产生的内源性代谢物的变化，然后可以通过处于代谢循环通路上的某些关键化合物的定性和定量分析，来预测或解释说明由该刺激引起的细胞或生物体变化是定位于何种通路。代谢组学以生物系统中的代谢产物(主要针对相对分子质量1000以下的小分子)为分析对象：常见的生物样本包括生物体液(尿液、血清、血浆、脑脊液、汗液等)、个体动物或人体组织(肿瘤、肝脏、炎症组织等)和细胞及粪便等。通常以高通量的现代仪器分析方法为手段，分为质谱和核磁共振两大类。
核磁共振(Nuclear magnetic resonance，NMR)技术的特点是对样本的需求量少、样品前处理较简单。NMR技术最大的劣势在于较低的灵敏度、分辨率不足、高丰度分析物经常会掩盖低丰度的分析物。相对于NMR技术的缺点如低分辨率、检测动态范围小等，质谱具有相对较高的灵敏度和专一性，可以实现对多个样品快速分析与鉴定。现在开展的代谢组学实验应用最广泛的仪器平台是气相色谱-质谱连用(Gas Chromatography-MassSpectrometry，GC-MS)和液相色谱-质谱连用(Liquid Chromatography-MassSpectrometry，LC-MS)。GC-MS更适合分析小分子、热不敏感、可挥发、能气化的化合物。且具有较高的分辨率和灵敏度；并且有可利用的较为经济的统一规范的质谱数据库。相对于GC-MS，LC-MS更偏向分析较高极性、更高相对分子质量和对热敏感的化合物，且无需像GC-MS一样做复杂的化学衍生化等样品前处理。LC-MS更适用于复杂生物样本中代谢产物的检测与潜在的生物标记物的鉴定。
发明内容
本发明第一个方面的目的在于提供定量粪便中代谢物的试剂在制备活动性肺结核疗效评价试剂中的应用。
本发明第二个方面的目的在于提供一种用于检测活动性肺结核的检测系统。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供定量粪便中代谢物的试剂在制备活动性肺结核疗效评价试剂中的应用，所述粪便代谢物选自11,14-trans-Eicosadienoic acid 11,14-反式二十碳二烯酸、Kynurenic acid犬尿酸、Ethylrhoeagenine乙基罗依菌素、Sulfanilamide磺胺、L-Glutamic acid L-谷氨酸、4-Acetamidoantipyrine 4-乙酰氨基安替比林、L-Alanine L-丙氨酸、Oxindole 2-吲哚酮、2-Mercaptobenzothiazole 2-巯基苯并噻唑、Cysteine半胱氨酸、Methionine甲硫氨酸、Benzophenone二苯甲酮、Polanrazine B_120170波兰拉津B、N-Cyclohexylformamide N-环己基甲酰胺的至少一种。
根据本发明第一个方面所述的应用，所述粪便代谢物由11,14-trans-Eicosadienoic acid11,14-反式二十碳二烯酸、Kynurenic acid犬尿酸、Ethylrhoeagenine乙基罗依菌素、Sulfanilamide磺胺、L-Glutamic acid L-谷氨酸、4-Acetamidoantipyrine 4-乙酰氨基安替比林、L-Alanine L-丙氨酸、Oxindole 2-吲哚酮、2-Mercaptobenzothiazole 2-巯基苯并噻唑、Cysteine半胱氨酸、Methionine甲硫氨酸、Benzophenone二苯甲酮、Polanrazine B_120170波兰拉津B和N-Cyclohexylformamide N-环己基甲酰胺组成。
本发明的第二个方面，提供一种用于检测活动性肺结核疗效的检测系统，所述检测系统包括参数采集设备和数据处理装置；所述参数采集设备定量采集本发明第一个方面所述的粪便代谢物的相对表达量。
根据本发明第二个方面所述的检测系统，所述粪便代谢物的相对表达量采用液相色谱-质谱连用的方法获得。
根据本发明第二个方面所述的检测系统，所述粪便代谢物的相对表达量通过以下步骤获得：
S1.液相色谱-质谱代谢组学检测样本中本发明第一个方面所述的粪便代谢物的相对表达量，采集对应数据；
S2.对步骤S1中采集的数据进行处理分析，根据分析结果，判断样品来源的活动性肺结核是否治愈。
根据本发明第二个方面所述的检测系统，步骤S1中所述液相色谱-质谱代谢组学检测中，质谱检测的条件为轰击能量：30eV，8张二级谱图每50ms；ESI离子源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：650℃，喷雾电压：5000V。
根据本发明第二个方面所述的检测系统，步骤S2中所述判断样品来源的活动性肺结核是否治愈的方法为：
当样本中本发明第一个方面所述的粪便代谢物的相对表达量<2X经抗结核药物治疗6个月的结核病患者组的平均值且其相对表达量均≥2X结核菌潜伏的健康人组的平均值，则说明样本的来源患有活动性肺结核；
否则，说明样本来源的活动性肺结核未治愈。
所述抗结核治疗药物治疗的具体情况为：使用一线药物利福平(Rifampin)、异烟肼(Isonizid)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide)、乙胺丁醇(Ethambutol)联合治疗两个月，后继续服用异烟肼和利福平4个月。
根据本发明第二个方面所述的检测系统，步骤S1所述液相色谱-质谱代谢组学检测采用AB 5600Triple TOF质谱仪与Analyst TF 1.7,AB Sciex控制软件。
根据本发明第二个方面所述的检测系统，所述数据处理装置采用MS-DIALver.3.98软件。
根据本发明第二个方面所述的检测系统，所述MS-DIAL ver.3.98软件的设置参数为：
峰匹配：MS1容忍偏差：0.015Da(道尔顿)，保留时间容忍偏差：0.3min；
峰鉴定：精确质量容忍偏差(MS1):0.01Da(MS2):0.05Da；
鉴定评分阈值：60％。
本发明的有益效果是：
本发明基于粪便LC-MS代谢组学技术判断待测活动性肺结核患者经过一线抗结核药物标准治疗6个月后是否治愈的方法。本发明的方法是对待测患者粪便进行LC-MS检测，分别得到14种差异代谢物的相对表达量，再根据这些差异代谢物的相对表达量大小判断待测患者是否被治愈。与传统方法相比，本发明的方法具有非侵入、样本处理简单、样本无破坏性、进样量少、准确性高、重复性较好、成本低等优点。
附图说明
图1：感染MTB的健康人(LTBI)组和初诊未治疗活动性肺结核患者(ATB)组的多元化统计学分析。(A)PCA模型的得分图；(B)OrthoPLSDA模型得分图。分析数据使用MetaboAnalyst 4.0。
图2：初诊未治疗活动性肺结核患者(ATB)组和初诊为结核病且仅经过常规抗结核药物治疗2个月的结核病患者(T2)组的多元化统计学分析。(A)PCA模型的得分图；(B)OrthoPLSDA模型得分图。分析数据使用MetaboAnalyst 4.0。
图3：初诊未治疗活动性肺结核患者(ATB)组和初诊为结核病且仅经过常规抗结核药物治疗6个月且治愈的结核病患者(T6)组的多元化统计学分析。(A)PCA模型的得分图；(B)OrthoPLSDA模型得分图。分析数据使用MetaboAnalyst 4.0。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
表1下述实施例中实验设备
表2下述实施例中实验试剂
| 试剂 | 生产商 |
| 乙腈(Acetonitrile) | Merck(Darmstadt,Germany) |
| 甲醇(Methanol) | Merck(Darmstadt,Germany) |
| 甲酸(Formic acid) | CNW(Shanghai,China) |
| 超纯水(Ultrapure water) | Merck(Darmstadt,Germany) |
实施例1
一种用于检测活动性肺结核疗效的检测系统，包括参数采集设备和具有如下数据处理功能的数据处理装置：
将利用LC-MS检测的待测患者粪便的结果进行分析，根据如下标准输出结论：若待测患者粪便中14个差异代谢物中的一种或多种的相对表达量<T6组平均值且其相对表达量均≥LTBI组平均值，则表明待测患者已治愈或候选为治愈；上述14个差异代谢物包括11,14-trans-Eicosadienoic acid 11,14-反式二十碳二烯酸、Kynurenic acid犬尿酸、Ethylrhoeagenine乙基罗依菌素、Sulfanilamide磺胺、L-Glutamic acid L-谷氨酸、4-Acetamidoantipyrine 4-乙酰氨基安替比林、L-Alanine L-丙氨酸、Oxindole 2-吲哚酮、2-Mercaptobenzothiazole 2-巯基苯并噻唑、Cysteine半胱氨酸、Methionine甲硫氨酸、Benzophenone二苯甲酮、Polanrazine B_120170波兰拉津B和N-Cyclohexylformamide N-环己基甲酰胺。
所述参数采集设备包括检测待测患者粪便中14种差异代谢物的相对表达量时使用的设备和/或试剂。14个差异代谢物包括11,14-trans-Eicosadienoic acid 11,14-反式二十碳二烯酸、Kynurenic acid犬尿酸、Ethylrhoeagenine乙基罗依菌素、Sulfanilamide磺胺、L-Glutamic acid L-谷氨酸、4-Acetamidoantipyrine 4-乙酰氨基安替比林、L-Alanine L-丙氨酸、Oxindole 2-吲哚酮、2-Mercaptobenzothiazole 2-巯基苯并噻唑、Cysteine半胱氨酸、Methionine甲硫氨酸、Benzophenone二苯甲酮、Polanrazine B_120170波兰拉津B和N-Cyclohexylformamide N-环己基甲酰胺。
所述检测系统的使用方法，包括如下步骤：
(1)对初诊未治疗活动性肺结核患者(ATB)和初诊为结核病且仅经过常规抗结核药物治疗2个月的结核病患者(T2)、初诊为结核病且仅经过常规抗结核药物治疗6个月的结核病患者(T6)和三个Mtb潜伏健康人(LTBI)进行LC-MS代谢组学检测，分别得到14个差异代谢物包括11,14-trans-Eicosadienoic acid 11,14-反式二十碳二烯酸、Kynurenic acid犬尿酸、Ethylrhoeagenine乙基罗依菌素、Sulfanilamide磺胺、L-Glutamic acid L-谷氨酸、4-Acetamidoantipyrine 4-乙酰氨基安替比林、L-Alanine L-丙氨酸、Oxindole 2-吲哚酮、2-Mercaptobenzothiazole 2-巯基苯并噻唑、Cysteine半胱氨酸、Methionine甲硫氨酸、Benzophenone二苯甲酮、Polanrazine B_120170波兰拉津B和N-CyclohexylformamideN-环己基甲酰胺的相对表达量。
(2)根据所述相对表达量，按照如下方法评价待测患者治疗效果：若对待测患者粪便中14个差异代谢物中的一种或多种的相对表达量均<T6组平均值且其相对表达量均≥LTBI组平均值，则表明待测患者已治愈或候选为治愈；否则，所述待测患者为完成疗程或治疗失败。
上述系统或方法中，所述相对表达量通过如下方法获得：对待测患者粪便进行LC-MS代谢组学检测，使用MS-DIAL ver.3.98软件对转换后abf文件进行峰寻找、峰对齐等数据处理，同时基于一级与二级图谱搜索自主整合Metlint和MoNA的数据库，得到13种差异代谢物的鉴定结果(表1)及峰下面积；根据对应的平均保留时间和平均Mz的每种脂质的峰下面积，分别计算得到其相对表达量。
上述系统或方法中，所述LC-MS代谢组学检测采用AB 5600Triple TOF质谱仪在控制软件(Analyst TF 1.7,AB Sciex)控制下基于IDA功能进行待测患者粪便样本一级、二级质谱数据的采集，观测粪便中的小分子。在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。轰击能量：30eV，8张二级谱图每50ms。ESI离子源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：650℃，喷雾电压：5000V。
实施例2一种基于粪便LC-MS技术判断活动性肺结核的方法
1.研究对象纳入及分组
纳入人群来自于深圳慢病院，年龄18-60岁，且作息、饮食规律，不酗酒嗜烟。具体分组如下：
(1)感染结核菌的健康组(LTBI)(29人)
PPD皮试检查为阳性的人群并且γ干扰素释放试验阳性，但无任何结核病及相关分枝杆菌病症状及体征，无法确诊为肺结核的群体，包括与排菌病人密切接触者、结核病防治临床与实验室医师等高危人群。
(2)初诊为结核病且未进行治疗的患者组(37人)
依据肺结核诊断标准(WS288-2008)标准，经过临床、实验室及影像学检查确诊为肺结核的患者。初治肺结核病患者指初次发现,并未接受任何抗结核药物治疗，或发现肺结核后虽经不规则、不合理抗结核治疗，但疗程不超过1个月的病人；复发肺结核患者即为指初治失败或治疗的病人再次复发的病人(去除查出肺结核后接受不规则、不合理化疗已经超过1个月这一类患者)。
(3)常规抗结核药物治疗的肺结核病患者组(32人)初诊为结核病且仅经过常规抗结核药物治疗2个月的结核病患者。
常规抗结核治疗药物治疗的具体情况为：使用一线药物利福平(Rifampin)、异烟肼(Isonizid)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide)、乙胺丁醇(Ethambutol)联合治疗两个月，后继续服用异烟肼和利福平4个月。
(4)常规抗结核药物治疗的肺结核病患者组(24人)初诊为结核病且仅经过常规抗结核药物治疗6个月且其他临床症状表明治愈的结核病患者。疗效判定标准：影像学评价指标见2005年中华医学会编著的《临床诊疗指南.结核病分册》；细菌学检测结果评价参见《耐药结核病化学治疗指南》制定的标准。其中治愈指涂阳培阳肺结核患者完成规定的疗程，连续3次涂片结果阴性，并且至少一次痰培养阴转，在治疗末痰涂片阴性。
2.粪菌采集及保存
需用粪便采集管，粪菌样本量不少于5.0g，收集后需尽快(4小时内)保存于-20℃为佳，保存时间不大于7天(市慢病防治中心收集-86℃保存)。
3.粪便样本收集与处理
(1)样品前处理
1)取样品放置4℃解冻，称取50mg。
2)加入1000μl甲醇乙腈水溶(2:2:1V/V)，涡旋1min。
3)-20℃度放置60min。
4)17000g，4℃，离心15min,取200μl上清溶液真空抽干。
5)用200μl乙腈水溶液(1:1V/V)溶解,17000g，4℃，离心15min，取120μl上清上机。
6)每个样品取10μl混合，制成QC样品。
4.LC-MS检测和数据收集
(1)仪器参数设置
流动相条件：
1)柱温35℃，上样量5μl
2)正离子模式：A：0.1％甲酸水；B：0.1％甲酸乙腈
3)按照表3流动相洗脱梯度表洗脱
表3流动相洗脱梯度表
| Time(min) | Flow-rate(μl/min) | A％ | B％ |
| 0 | 300 | 95 | 5 |
| 8 | 300 | 80 | 30 |
| 25 | 300 | 5 | 95 |
| 26 | 300 | 5 | 95 |
| 29 | 300 | 95 | 5 |
| 37 | 300 | 95 | 5 |
4)质谱条件：
AB 5600Triple TOF质谱仪能够在控制软件(Analyst TF 1.7,AB Sciex)控制下基于IDA功能进行一级、二级质谱数据采集。在每个数据采集循环中，筛选出强度最强且大于100的分子离子进行采集对应的二级质谱数据。轰击能量：30eV，8张二级谱图每50ms。ESI离子源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：650℃，喷雾电压：5000V。
5.LC-MS结果鉴定及多元统计学分析
(1)转格式：数据首先使用Analysis Base File Converter转换为.abf格式
(2)使用MS-DIAL ver.3.98软件对转换后abf文件进行峰寻找、峰对齐等数据处理，同时基于一级与二级图谱搜索自主整合Metlint和MoNA的数据库，得到鉴定结果。
(3)MSDIAL软件设置参数：
峰匹配：MS1容忍偏差：0.015Da(道尔顿)，保留时间容忍偏差：0.3min；
峰鉴定：精确质量容忍偏差(MS1):0.01Da(MS2):0.05Da；
鉴定评分阈值：60％。
(4)对于MSDIAL对齐鉴定出来数据，通过控制QC样品指标CV值小30％，才进行统计分析，然后删除组内缺失值>50％的离子峰。采用TIC离子总和进行归一化，Logtransformation进行转换，应用MetaboAnalyst 4.0软件进行PCA分析。为强化组间差异，进一步采用Orthogonal signal correction-partial least squares discriminantanalysis(OrthoPLSDA)分析。分析结果以得分图(scores plot)的形式表示。
感染MTB的健康人(LTBI)组和初诊未治疗活动性肺结核患者(ATB)组的多元化统计学分析结果如图1所示。其中，图1A为PCA模型的得分图；图1B为OrthoPLSDA模型得分图。初诊未治疗活动性肺结核患者(ATB)组和初诊为结核病且仅经过常规抗结核药物治疗2个月的结核病患者(T2)组的多元化统计学分析结果如图2所示。其中图2A为PCA模型的得分图；图2B为OrthoPLSDA模型得分图。潜伏性健康人(LTBI)组和活动性肺结核患者(ATB)组的多元化统计学分析结果如图2所示。其中，图2A为PCA模型的得分图；图2B为OrthoPLSDA模型得分图。
6.差异代谢产物的鉴定
搜索满足VIP值>1、倍数变化>2和P值<0.05的代谢产物，最终鉴定得到13个差异代谢物，如表4所示。
表4.感染MTB的健康人(LTBI)组、初诊未治疗的活动性肺结核患者(ATB)、治疗2个月的肺结核患者(T2)和经6个月治疗治愈的肺结核患者(T6)粪便中的14种差异代谢物及其在粪便中的相对表达量
根据表4中的14个差异代谢物建立了如下评价待测活动性肺结核患者经过一线药物标准治疗6个月后是否治愈的方法：
对待测患者粪便进行LC-MS检测，分别得到以上14个差异代谢物的相对表达量；如一种或多种代谢物的相对表达量<2X经常规抗结核药物治疗6个月的结核病患者组的平均值且其相对表达量均≥2X结核菌潜伏的健康人组的平均值，则表明待测患者已治愈或候选为治愈。
T6组：初诊为结核病且仅经过常规抗结核药物治疗6个月的结核病患者；
LTBI组：结核菌潜伏的健康人组。
若对待测患者粪便中14个差异代谢物中的一种或多种的相对表达量均<T6组平均值且其相对表达量均≥LTBI组平均值，则表明待测患者已治愈或候选为治愈；否则，所述待测患者为完成疗程或治疗失败。
实施例3评价待测患者活动性肺结核患疗效的验证
常规留取3例活动性肺结核患者(ATB)、3例Mtb潜伏健康人、2例治疗2个月的肺结核患者(T2)和2例经6个月治疗治愈的肺结核患者(T6)的粪便(粪便来源于深圳慢病院，所有患者均经临床诊断确定，且患者和志愿者均知情)，按照实施例1中的基于粪便LC-MS代谢组学分析技术判断活动性肺结核患者的方法，分别得到14种差异代谢物的相对表达量。14个差异代谢物包括11,14-trans-Eicosadienoic acid 11,14-反式二十碳二烯酸、Kynurenic acid犬尿酸、Ethylrhoeagenine乙基罗依菌素、Sulfanilamide磺胺、L-Glutamic acid L-谷氨酸、4-Acetamidoantipyrine 4-乙酰氨基安替比林、L-Alanine L-丙氨酸、Oxindole 2-吲哚酮、2-Mercaptobenzothiazole 2-巯基苯并噻唑、Cysteine半胱氨酸、Methionine甲硫氨酸、Benzophenone二苯甲酮、Polanrazine B_120170波兰拉津B和N-Cyclohexylformamide N-环己基甲酰胺。
检测结果表明：如表5所示，活动性肺结核患者粪便14种差异代谢物中均有一种或多种代谢物的相对表达量均<2XT6组平均值且其差异代谢物的相对表达量≥2X LTBI组平均值。
表5 3例感染MTB的健康人(LTBI)组、3例初诊未治疗的活动性肺结核患者(ATB)、
2例治疗2个月的肺结核患者(T2)和2例经6个月治疗治愈的肺结核患者(T6)粪便中的14种差异代谢物及其在粪便中的相对表达量
上述检测结果均与实施例1中的评价待测活动性肺结核患者的治疗效果的方法中的表述一致，说明本发明的评价方法准确，可以用于判断待测患者是否治愈。说明本发明的检测待测患者活动性肺结核疗效的方法准确，可以用于评价待测样品来源的活动性肺结核是否治愈或候选为治愈。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.定量粪便中代谢物的试剂在制备活动性肺结核疗效评价试剂中的应用，所述粪便中代谢物选自11,14-trans-Eicosadienoic acid 11,14-反式二十碳二烯酸、Kynurenicacid犬尿酸、Ethylrhoeagenine乙基罗依菌素、Sulfanilamide磺胺、L-Glutamic acid L-谷氨酸、4-Acetamidoantipyrine 4-乙酰氨基安替比林、L-Alanine L-丙氨酸、Oxindole2-吲哚酮、2-Mercaptobenzothiazole 2-巯基苯并噻唑、Cysteine半胱氨酸、Methionine甲硫氨酸、Benzophenone二苯甲酮、Polanrazine B_120170波兰拉津B、N-Cyclohexylformamide N-环己基甲酰胺的至少一种。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述粪便中代谢物由11,14-trans-Eicosadienoic acid 11,14-反式二十碳二烯酸、Kynurenic acid犬尿酸、Ethylrhoeagenine乙基罗依菌素、Sulfanilamide磺胺、L-Glutamic acid L-谷氨酸、4-Acetamidoantipyrine 4-乙酰氨基安替比林、L-Alanine L-丙氨酸、Oxindole 2-吲哚酮、2-Mercaptobenzothiazole 2-巯基苯并噻唑、Cysteine半胱氨酸、Methionine甲硫氨酸、Benzophenone二苯甲酮、Polanrazine B_120170波兰拉津B和N-Cyclohexylformamide N-环己基甲酰胺组成。
3.一种用于检测活动性肺结核疗效的检测系统，其特征在于，所述检测系统包括参数采集设备和数据处理装置；其中，
所述参数采集设备定量采集权利要求1或2中所述粪便中代谢物的相对表达量；
所述数据处理装置基于参数采集设备获得的数据确定活动性肺结核疗效。
4.根据权利要求3所述的检测系统，其特征在于，所述粪便中代谢物的相对表达量采用液相色谱-质谱连用的方法获得。
5.根据权利要求4所述的检测系统，其特征在于，所述粪便中代谢物的相对表达量通过以下步骤获得：
S1.液相色谱-质谱代谢组学检测样本中权利要求1或2中所述粪便中代谢物的相对表达量，采集对应数据；
S2.对步骤S1中采集的数据进行处理分析，根据分析结果，判断样品来源的活动性肺结核是否治愈。
6.根据权利要求5所述的检测系统，其特征在于，步骤S1中所述液相色谱-质谱代谢组学检测中，质谱检测的条件为轰击能量：30eV，8张二级谱图每50ms；ESI离子源参数设置如下：雾化气压(GS1)：60Psi，辅助气压：60Psi，气帘气压：35Psi，温度：650℃，喷雾电压：5000V。
7.根据权利要求5所述的检测系统，其特征在于，步骤S2中所述判断样品来源的活动性肺结核是否治愈的方法为：
当样本中权利要求1或2中所述粪便代谢物的相对表达量<2X经抗结核药物治疗6个月的结核病患者组的平均值且其相对表达量均≥2X结核菌潜伏的健康人组的平均值，则说明样本的来源患有活动性肺结核；
否则，说明样本来源的活动性肺结核未治愈。
8.根据权利要求5至7任一所述的检测系统，其特征在于，步骤S1所述液相色谱-质谱代谢组学检测采用AB 5600Triple TOF质谱仪与Analyst TF 1.7,AB Sciex控制软件。
9.根据权利要求3至7任一所述的检测系统，其特征在于，所述数据处理装置采用MS-DIALver.3.98软件。
10.根据权利要求9所述的检测系统，其特征在于，所述MS-DIAL ver.3.98软件的设置参数为：
峰匹配：MS1容忍偏差：0.015Da(道尔顿)，保留时间容忍偏差：0.3min；
峰鉴定：精确质量容忍偏差(MS1):0.01Da(MS2):0.05Da；
鉴定评分阈值：60％。
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|---|---|---|---|---|
| WO2023035300A1 (zh) * | 2021-09-07 | 2023-03-16 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种阿尔兹海默症生物标志物及其筛选方法和应用 |
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