CN111647555A - 一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其包括：向干细胞中加入基础培养基，离心，重悬细胞沉淀，将细胞接种到培养瓶中并培养72h；再利用由基础培养基、血清替代物和其他添加剂制成的培养液对培养72h后的脂肪间充质干细胞进行传代培养，培养72h；将培养瓶转移至生物安全柜，收集上清液；超滤浓缩，得一级浓缩液；利用30%的蔗糖密度梯度对一级浓缩液进行离心，收集浓缩液。本发明方法能有效降低细胞在培养过程中受到细菌感染的可能性，同时还能促进干细胞增殖并分泌外泌体。

Description

一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法

技术领域

本发明涉及间充质干细胞分泌体的技术领域，尤其涉及一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法。

背景技术

外泌体是一种由多种细胞在正常或病理状态下分泌的微小囊泡，直径在30-150nm，具有脂质双层膜结构。有研究表明干细胞来源的分泌体与靶细胞通过膜融合或者内吞作用后可将生物活性物质转运至靶细胞，介导细胞间通讯并影响靶细胞功能，另外分泌体还具有抑制炎症反应、免疫调节、血管生成、参与组织修复的功能。与干细胞相比，干细胞外泌体更稳定，更安全，保存更方便。

现有申请公布号为CN109880797A的中国专利公开了一种制备间充质干细胞外泌体的方法，其包括：1)脐带间充质干细胞的培养：采集新生儿脐带清洗后剥出华通胶剪至小块，铺于培养瓶中，置于培养箱中培养，8-24h内添加完全培养基覆盖组织块培养，培养至第五天半换液，此后每隔2-3天换液，细胞融合度达到70-80％时，吸出组织块加到一个新的培养瓶中，补加培养基，待细胞从组织块周围爬出，融合度达到70％-80％时进行传代，记为P1，持续传代操作，获得二次贴壁细胞的P2代到P5代；2)脐带间充质干细胞的鉴定：收集步骤1)获得的脐带间充质干细胞的二次贴壁细胞的P2代到P5代用PBS漂洗，离心去上清液，加入PBS重悬后分装，分别加入PE标记的鼠抗人CD34，CD44，CD45，CD73，CD90，CD105和同型对照，鉴定细胞表型；3)脐带间充质干细胞来源的外泌体的制备：选择步骤1)中制备的生长状态良好的脐带间充质干细胞用含8-12％去除外泌体的FBS的完全培养基培养，细胞的融合度达到70-80％时更换新的含8-12％去除外泌体的FBS的完全培养基继续培养40-56h，收集培养上清液；将上述上清液离心，去除细胞碎片获得上清液A；将上清液A继续离心去除完整细胞和死细胞，获得上清液B；将上清液B继续离心去除沉淀获得上清液C；0 .22μm滤器过滤上清液C，获得上清液D；将上清液D放入超速离心机离心，弃上清，用预冷的PBS清洗获得的沉淀E；将沉淀E放入超速离心机离心弃上清，沉淀用预冷的PBS重悬，获得人脐带间充质干细胞外泌体重悬液标记后储存。其中完全培养基为去除自身携带的外泌体的胎牛血清。

上述公开专利中的培养基中含有胎牛血清，胎牛血清容易被细菌和支原体感染，继而会感染干细胞，另外在细胞培养的过程中，即使工作人员参照实验规则小心操作，以及实验设备都做到精准的清洁消毒，但实验过程中，仍存在细胞受到细菌污染而停止增殖或分泌外泌体的情况，从而导致制得的外泌体具有较低的含量和纯度。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其具有有效降低细胞在培养过程中受到细菌感染的可能性、同时还能促进干细胞增殖并分泌外泌体的优势。

本发明的上述发明目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，包括以下步骤：

S1：脂肪间充质干细胞的复苏：将冷冻保存的脂肪间充质干细胞放入35℃-40℃水浴锅中融化，加入基础培养基，离心，倒弃上清液，重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种到培养瓶中并将培养瓶放入C0₂培养箱中培养72h；

S2：脂肪间充质干细胞的传代培养：利用由基础培养基、血清替代物和其他添加剂制成的培养液对步骤S1中复苏后的脂肪间充质干细胞进行传代培养，培养72h；

S3：脂肪间充质干细胞外泌体的收获：将步骤S2中的培养瓶转移至生物安全柜，收集上清液；超滤浓缩，得初级浓缩液；利用30%的蔗糖密度梯度对初级浓缩液进行离心，收集浓缩液，即得脂肪间充质干细胞外泌体。

通过采用上述技术方案，利用血清替代物代替胎牛血清，降低了因血清而引起干细胞受到细菌感染的可能性。另外，利用其他添加剂增强培养液的抗菌性能，使得干细胞能够正常增殖，还能够促进干细胞的增殖，促进干细胞分泌更多的外泌体。另外，通过对含有干细胞外泌体的上清液进行离心和浓缩，使得制得的干细胞外泌体具有较高的含量和纯度。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述步骤S1中细胞的接种量为1.0*10⁶-1.4*10⁶个/瓶。

通过采用上述技术方案，在培养瓶中接种特定数量的细胞，有利于培养瓶中的细胞在特定时间内能够传代一定的次数，从而确保细胞的活力以及各种状态，进一步有利于细胞分泌外泌体。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述步骤S2中细胞的接种量为1.3*10⁶-1.7*10⁶个/瓶。

通过采用上述技术方案，在培养瓶中接种特定数量的细胞，有利于培养瓶中的细胞在特定时间内能够传代一定的次数，从而确保细胞的活力以及各种状态，进一步有利于细胞分泌外泌体。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述其他添加剂包括抗菌剂，所述抗菌剂包括以下占基础培养基体积百分比的组分：

茴香提取物0.02%-0.05%；

丁香提取物0.01%-0.04%；

金银花提取物0.03%-0.06%；

鱼腥草提取物0.02%-0.05%；

黄岑提取物0.04%-0.09%。

通过采用上述技术方案，利用茴香提取物、丁香提取物、金银花提取物、鱼腥草提取物和黄岑提取物的协同作用，使得制得的培养液具有较优的抗菌性能，使其能够抑制多种细菌的生长繁殖，防止间充质干细胞在培养过程中因细菌污染而降低增殖速度和分泌外泌体速度的情况发生。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述抗菌剂包括以下占基础培养基体积百分比的组分：

茴香提取物0.03%-0.04%；

丁香提取物0.02%-0.03%；

金银花提取物0.04%-0.05%；

鱼腥草提取物0.03%-0.04%；

黄岑提取物0.06%-0.08%。

通过采用上述技术方案，上述掺量的茴香提取物、丁香提取物、金银花提取物、鱼腥草提取物和黄岑提取物具有较优的协同作用，使得基础培养基具有较优的抗菌性能。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述其他添加剂包括增殖辅助剂，所述增殖辅助剂包括以下占基础培养基体积百分比的组分：

葛根提取物0.02%-0.08%；

维生素E 0.2%-0.7%。

通过采用上述技术方案，利用葛根提取物和维生素E的协同作用，使得制得的培养液能够促进干细胞的增殖，促进干细胞分泌外泌体。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述增殖辅助剂包括以下占基础培养基体积百分比的组分：

葛根提取物0.04%-0.06%；

维生素E 0.5%-0.6%。

通过采用上述技术方案，上述掺量的葛根提取物和维生素E具有较优的协同作用，能够更好的促进脂肪间充质干细胞增殖和分泌外泌体。

本发明在一较佳示例中可以进一步配置为：所述抗菌剂和/或增殖辅助剂经100℃的流通蒸气加热30min-45min后再加入到基础培养基中。

通过采用上述技术方案，将抗菌剂和增殖辅助剂经蒸气灭菌后再添加到培养液中，降低抗菌剂和增殖辅助剂将细菌带入到基础培养基中的可能性，使得脂肪间充质干细胞能够较好的增殖和分泌外泌体。

综上所述，本发明包括以下至少一种有益技术效果：

1.通过对脂肪间充质干细胞进行传代培养和对上清液的过滤浓缩，使得制得的外泌体具有较高的纯度和含量。

2.通过在基础培养基中添加抗菌剂，降低细菌污染脂肪间充质干细胞的可能性，使得脂肪间充质干细胞能够有效的增殖和分泌外泌体；

3.通过在基础培养基中添加增殖辅助剂，使得脂肪间充质干细胞能够保持较好的活性，利于脂肪间充质干细胞增殖和分泌外泌体。

具体实施方式

溶液的配制：

溶液C：将经100℃的流通蒸气加热40min后的茴香提取物、丁香提取物、金银花提取物、鱼腥草提取物、黄岑提取物加入到基础培养基中，搅拌速度200r/min，搅拌35min；保持持续搅拌的状态下，再将经100℃的流通蒸气加热40min后的葛根提取物、维生素E加入到基础培养基中，搅拌20min；将血清替代物加入到基础培养基中，搅拌10min，即得溶液C。将溶液C置于紫外线下照射30min，待用。

溶液D：将30ml生理盐水加入到20ml0.25%胰酶中，搅拌混匀，即得溶液D。

各实施例中茴香提取物、丁香提取物、金银花提取物、鱼腥草提取物、黄岑提取物、葛根提取物、维生素E占基础培养基的体积比如表一所示：

对照例一

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例不添加茴香提取物、丁香提取物、金银花提取物、鱼腥草提取物和黄岑提取物。

对照例二

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例不添加茴香提取物，同时另外添加与茴香提取物等量的丁香提取物。

对照例三

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例不添加丁香提取物，同时另外添加与丁香提取物的金银花提取物。

对照例四

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例不添加金银花提取物，同时另外添加与金银花提取物的鱼腥草提取物。

对照例五

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例不添加鱼腥草提取物，同时另外添加与鱼腥草提取物的黄岑提取物。

对照例六

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例不添加黄岑提取物，同时另外添加与黄岑提取物的茴香提取物。

对照例七

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例不添加葛根提取物和维生素E。

对照例八

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例不添加葛根提取物，同时另外添加与葛根提取物等量的维生素E。

对照例九

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例不添加维生素E，同时另外添加与维生素E等量的葛根提取物。

对照例十

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例中步骤S2中细胞的接种量为1.1*10⁶个/瓶。

对照例十一

本对照例与实施例二的区别在于，本对照例中步骤S2中细胞的接种量为1.7*10⁶个/瓶。

对照例十二

以对比文件（CN109880797A）公开的制备外泌体的方法制备间充质干细胞外泌体。

实施例一至实施例五、对照例一至对照例九中脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法均采用以下制备方法：

S1、脂肪间充质干细胞的复苏

（1）向5根15ml离心管A中分别倒入基础培养基10ml，预热到37℃，静置待用；

（2）从液氮罐中取出装有脂肪间充质干细胞的冻存管快速放入37℃水浴锅中，摇动冻存管使得冻存液快速融化；用5ml移液管将脂肪间充质干细胞全部转移到离心管A中，并用1ml基础培养基冲洗冻存管，冲洗液倒入离心管A中；

（3）放入离心机，300g离心5min，吸弃上清液，震散细胞沉淀，向离心管A中加入基础培养基，定容至10ml，颠倒混匀；放入离心机，300g离心5min，吸弃上清液，震散细胞沉淀；

（4）向离心管A中加入5ml溶液C，颠倒混匀，用5ml移液管吸取0.5ml细胞悬液进行细胞计数；

（5）准备5个T-175培养瓶A，分别加入28ml溶液C；从（4）中的离心管A中取细胞悬液接种到T-175培养瓶A中，细胞接种量为1.2*10⁶个/瓶；

（6）从5个T-175培养瓶中分别吸取2ml细胞悬液，加入到5ml离心管B中，制成2ml检样，送至质检部以检查是否有微生物污染；

（7）将T-175培养瓶A放入CO₂培养箱中培养72h。

S2、脂肪间充质干细胞的传代培养

（1）S1中T-175培养瓶A中的细胞汇合度达到80%以上时，从培养箱中取出S1中的T-175培养瓶A，转移至生物安全柜，平稳叠放；将T-175培养瓶A中的上清液移到无菌血清瓶A中，从无菌血清瓶A中吸取上清液4ml，加入到5ml离心管C中，制成4ml检样，送至质检部以检查是否有微生物污染；

（2）分别向5个T-175培养瓶A中加入10ml生理盐水，晃动瓶身，润洗瓶底，吸弃洗液；

（3）用25ml移液管吸取溶液D，按照5ml/瓶量沿T-175培养瓶A非细胞面内壁加入，迅速晃动瓶身，充分浸润细胞面后，平放瓶身；

（4）显微镜下观察T-175培养瓶A中的细胞变圆后，竖立瓶身，用25ml移液管吸取溶液C，按照5ml/瓶量沿T-175培养瓶A非细胞面内壁加入，晃动瓶身，均匀浸润细胞面，终止消化；

（5）用25ml移液管将5个T-175培养瓶A中的细胞悬液吸出分别平均汇集至5根50ml离心管D中；

（6）将（5）中的离心管D放入离心机，300g离心5min，吸弃上清液，震散细胞沉淀；向离心管D中倒入基础培养基，定容至50ml，颠倒混匀；放入离心机，300g离心5min，吸弃上清液，震散细胞沉淀；

（7）并管：取（6）中的其中一根离心管D，用25ml移液管加入20ml基础培养基，晃动管身，重悬细胞沉淀，转移至一根250ml的离心管E中，重复转移，直至将所有细胞并入离心管E中；

（8）洗管：重复（7）操作，将清洗液汇集至离心管E中；

（9）向离心管E中倒入溶液C，定容到200ml，颠倒混匀；吸取0.5ml细胞悬液进行细胞计数；可根据细胞计数结果，继续向离心管E中倒入溶液C，调整细胞密度为1*10⁶个/ml；

（10）用25ml移液管吸取溶液C，按照28ml/瓶量加入5个T-175培养瓶B中，平稳叠放，待用；

（11）用5ml移液管吸取（9）中的细胞悬液，按照1.5ml/瓶量接种至（10）中的T-175培养瓶B中，细胞接种量为1.5*10⁶个/瓶；

（12）随机选取（11）中的3个T-175培养瓶B，用5ml移液管从每个T-175培养瓶B中分别吸取0.5ml细胞悬液，分别加入离心管F中，制成1.5ml检样，送至质检部以检查是否有微生物污染；

（13）将（11）中的T-175培养瓶B放入CO₂培养箱中培养72h。

S3、脂肪间充质干细胞外泌体的收获

（1）S2中T-175培养瓶B中的细胞汇合度达到80%以上时，从CO₂培养箱中取出S2中的T-175培养瓶B，转移至生物安全柜，平稳叠放，用25ml移液管将T-175培养瓶B中的上清液移到无菌血清瓶B，从无菌血清瓶B中吸取上清液4ml；加入到5ml离心管G中，制成4ml检样，送至质检部以检查是否有微生物污染；

（2）对步骤（1）中的上清液利用超滤膜进行超滤浓缩，1000g离心16min，得到初级浓缩液；

（3）利用30%的蔗糖密度垫对（2）中的初级浓缩液进行进一步离心，在4℃温下90000g密度梯度离心130min，收集底部缓冲垫；

（4）对（3）中的缓冲垫利用200μL PBS溶液洗涤，收集浓缩液，即得到脂肪间充质干细胞外泌体。

注：除了离心操作，步骤S1、步骤S2和步骤S3均在生物安全柜内进行。

针对各实施例和各对照例进行细胞数和细胞活性的测定，试验过程如下：

（1）选择各实施例和各对照例中的T-175培养瓶B各五瓶，分为五组，每组含各实施例和各对照例各一瓶，作上标记；

（2）在细胞培养24h后将第一组T-175培养瓶B中的细胞收获，48h后将第二组T-175培养瓶B中的细胞收获，72h后将第三组T-175培养瓶B中的细胞收获，96h后将第四组T-175培养瓶B中的细胞收获，120h后将第五组T-175培养瓶B中的细胞收获；

（3）利用贝克曼库尔特细胞存活率分析仪Vi-CELLXR对步骤（2）中T-175培养瓶B中的细胞进行计数并分析存活率，根据各实施例和各对照例中五瓶T-175培养瓶B中的细胞数判断各实施例和各对照例中细胞停止扩增的时间，并记录停止扩增时T-175培养瓶B中细胞的存活率；

（4）收集各实施例和各对照例在步骤S3中的（8）中的外泌体100μl，利用BCA蛋白定量法定量测定100ml上清液中的外泌体，结果如表二：

表二：各实施例中T-175培养瓶B中的细胞数及存活率

由表二可知，与对照例十二相比，实施例一至实施例三中细胞的扩增持续时间和细胞存活率均优于对照例十二，表明本发明中公开的溶液C一定程度上可降低细胞被污染的可能性，有利于细胞保持一定的活性、保持持续的增殖和对外泌体的分泌。

与实施例四和实施例五相比，实施例一至实施例三中细胞的扩增倍数、存活率以及外泌体的含量均优于实施例四和实施例五，表明参照本发明公开的各组分的配比进行配置溶液C，一定程度上可增强细胞的扩增速度、有利于细胞分泌外泌体。

与对照例十和对照例十一相比，实施例二中细胞的扩增倍数、存活率和外泌体的含量均优于对照例十和对照例十一，表明本发明中公开的细胞接种量为最优选接种量，使得细胞能够保持一定的传代次数和较好的活性，有利于细胞增殖和分泌外泌体。

与对照例一至对照例六相比，实施例一至实施例三中细胞的扩增倍数、细胞存活率和外泌体含量均大于对照例一至对照例六，且对照例一中的细胞于72h就已停止扩增，表明本发明添加的茴香提取物、丁香提取物、金银花提取物、鱼腥草提取物和黄岑提取物具有协同作用，一定程度上可增强溶液C的抗菌性，从而可降低细胞被污染的可能性，有利于细胞增殖和分泌外泌体，使得值得的外泌体具有较高的含量和纯度。

与对照例七至对照例九相比，实施例一至实施例三中细胞的扩增倍数大于对照例七，表明本发明添加的葛根提取物、维生素E具有协同作用，一定程度上可促进细胞的增殖，有利于细胞分泌外泌体，使得值得的外泌体具有较高的含量和纯度。

与对照例一至对照例十一相比，实施例一至实施例三中细胞的扩增倍数、细胞存活率以及外泌体的含量大于对照例一至对照例十一，表明茴香提取物、丁香提取物、金银花提取物、鱼腥草提取物、黄岑提取物、葛根提取物和维生素E具有协同作用，共同促进细胞的增殖和分泌外泌体，使得值得的外泌体具有较高的含量和纯度。

本具体实施方式的实施例均为本发明的较佳实施例，并非依此限制本发明的保护范围，故：凡依本发明的结构、形状、原理所做的等效变化，均应涵盖于本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1：脂肪间充质干细胞的复苏：将冷冻保存的脂肪间充质干细胞放入35℃-40℃水浴锅中融化，加入基础培养基，离心，倒弃上清液，重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种到培养瓶中并将培养瓶放入C0₂培养箱中培养72h；

S2：脂肪间充质干细胞的传代培养：利用由基础培养基、血清替代物和其他添加剂制成的培养液对步骤S1中复苏后的脂肪间充质干细胞进行传代培养，培养72h；

S3：脂肪间充质干细胞外泌体的收获：将步骤S2中的培养瓶转移至生物安全柜，收集上清液；超滤浓缩，得初级浓缩液；利用30%的蔗糖密度梯度对初级浓缩液进行离心，收集浓缩液，即得脂肪间充质干细胞外泌体。

2.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S1中细胞的接种量为1.0*10⁶-1.4*10⁶个/瓶。

3.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中细胞的接种量为1.3*10⁶-1.7*10⁶个/瓶。

4.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述其他添加剂包括抗菌剂，所述抗菌剂包括以下占基础培养基体积百分比的组分：

茴香提取物0.02%-0.05%；

丁香提取物0.01%-0.04%；

金银花提取物0.03%-0.06%；

鱼腥草提取物0.02%-0.05%；

黄岑提取物0.04%-0.09%。

5.根据权利要求4所述的一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述抗菌剂包括以下占基础培养基体积百分比的组分：

茴香提取物0.03%-0.04%；

丁香提取物0.02%-0.03%；

金银花提取物0.04%-0.05%；

鱼腥草提取物0.03%-0.04%；

黄岑提取物0.06%-0.08%。

6.根据权利要求1所述的一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述其他添加剂包括增殖辅助剂，所述增殖辅助剂包括以下占基础培养基体积百分比的组分：

葛根提取物0.02%-0.08%；

维生素E 0.2%-0.7%。

7.根据权利要求6所述的一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述增殖辅助剂包括以下占基础培养基体积百分比的组分：

葛根提取物0.04%-0.06%；

维生素E 0.5%-0.6%。

8.根据权利要求5和/或7所述的一种人脂肪间充质干细胞外泌体的制备方法，其特征在于：所述抗菌剂和/或增殖辅助剂经100℃的流通蒸气加热30min-45min后再加入到基础培养基中。