CN111643492A - N-香草基酰胺衍生物在抗拉沙病毒感染及其引起的疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了N‑香草基酰胺衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗拉沙病毒感染以及预防或治疗拉沙病毒感染引起的疾病的药物中的应用。本发明包含N‑香草基酰胺衍生物及其药学上可接受的盐在抗拉沙病毒感染以及预防或治疗拉沙病毒感染引起的疾病中的应用或与其他抗病毒药物的联合应用。

Description

N-香草基酰胺衍生物在抗拉沙病毒感染及其引起的疾病中的 应用

技术领域

本发明是关于N-香草基酰胺衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗拉沙病毒感染以及预防或治疗拉沙病毒感染引起的疾病的药物中的应用，属于医药技术领域。本发明包含N-香草基酰胺衍生物与其药学上可接受的盐在抗拉沙病毒感染及预防或治疗拉沙病毒感染引起的疾病的药物中的单独或联合应用。

背景技术

拉沙病毒(Lassa virus,LASV)是一种有囊膜的单负链RNA病毒，属沙粒病毒科(Arenaviridae)哺乳类沙粒病毒属(Mammarenavirus)，为生物安全4级病原(BSL-4)。沙粒病毒基因组为双义编码RNA,包括S和L两条链，L编码基质蛋白Z和病毒RNA聚合酶L；S编码包膜糖蛋白GP和核蛋白NP，其中包膜糖蛋白GP是唯一负责病毒进入宿主的病毒蛋白[GuntherS,Lenz O.Lassa virus.Crit Rev Clin Lab Sci,2004,41:339-390.]。

啮齿类动物是拉沙病毒的天然宿主，它们可携带拉沙病毒，但自身通常无病理表现。拉沙病毒可通过带毒小鼠或其排泄物，在动物和人间进行传播；拉沙病毒还可通过感染者的血液、体液或其排泄物在人和人间进行传播[Günther S,Lenz O.Lassa virus.Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.2004,41(4):339–390；Yun NE,Walker DH.Pathogenesis of Lassafever.Viruses,2012,4(10):2031-2048]。

拉沙病毒感染后潜伏期一般为7～21天，患者在感染早期多出现发烧、头痛、结膜炎、恶心、呕吐和腹泻等流感样症状。在感染晚期会出现黏膜出血、休克及多器官系统功能衰竭,部分患者可伴随神经系统病变[Yun NE,Walker DH.Pathogenesis of Lassafever.Viruses,2012,4(10):2031-2048]。

拉沙病毒感染人所致的拉沙出血热流行程度广、危害性大，在西非每年感染者达30万人，致死率15％～30％[Coyle AL.Lassa Fever.Nursing.2016,46(7):69-70；Houlihan C,Behrens R.Lassa fever.BMJ 2017,358:j2986]。目前尚无拉沙病毒疫苗和特效药，在疫区一般采用隔离患者的方法控制疫情扩散。利巴韦林(Ribavirin)是广谱抗病毒药物，也是目前唯一用于治疗拉沙病毒出血热的药物，但其效果有限且副作用显著[Charrel RN,Coutard B,Baronti C,Canard B,Nougairede A,et al.Arenaviruses andhantaviruses:from epidemiology and genomics to antivirals.Antivir.Res.2011,90:102–114]。

拉沙病毒进入宿主是病毒感染的第一步，阻断病毒的进入可有效抑制病毒感染。宿主细胞的α-DG、LAMP1和拉沙病毒包膜糖蛋白GP在病毒的进入过程中发挥了重要作用[LiS,Sun Z,Pryce R,et al.Acidic pH-Induced Conformations and LAMP1Binding of theLassa Virus Glycoprotein Spike.PLoS Pathog.2016,12,e1005418；Günther S,LenzO.Lassa virus.Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.2004,41(4):339–390]。目前虽有如ST-193和PF-429242等抗拉沙病毒活性的化合物报道，但这些皆处于临床前研究阶段[Larson RA,DaiD,Hosack VT,et al.Identification of a broad-spectrum arenavirus entryinhibitor.J Virol 2008,82(21):10768-10775；Hay BA,Abrams B,Zumbrunn AY,Valentine JJ,Warren LC,et al.Aminopyrrolidineamide inhibitors of site-1protease.Bioorg.Med.Chem.Lett.2007.17(16),4411–4414.]，因此，研究和开发治疗拉沙出血热的药物迫在眉睫。

本发明是基于应用拉沙病毒感染模型对800个天然产物进行普筛，发现N-香草基酰胺衍生物可阻断拉沙病毒感染宿主细胞。

N-香草基酰胺衍生物是一类含香草胺结构的生物碱，广泛存在于茄科植物中[Nilius B,Appendino G.Spices:the savory and beneficial science ofpungency.Rev Physiol Biochem Pharmacol.2013,164:1-76.]。已有研究显示，N-香草基酰胺衍生物有一定生物活性，如抗氧化、保护心血管、止痒、对多因素所致疼痛的镇痛作用，等[Ma L,Zhong J,Zhao Z,Luo Z,Ma S,et al.Activation of TRPV1reduces vascularlipid accumulation and attenuates atherosclerosis.Cardiovasc Res.2011,92(3):504-513；Attal N,Bouhassira D.Pharmacotherapy of neuropathic pain:which drugs,which treatment algorithms？Pain.2015,156Suppl 1:S104-S114]。有报道显示，N-香草基酰胺衍生物的镇痛活性可用于缓解病毒感染所致疼痛。如潜伏于神经节的疱疹病毒被激活所致的末梢神经痛是一种多发疾病，顺式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺和反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺的镇痛活性可用于缓解带状疱疹引起的疱疹后神经痛[BourneN,Bernstein DI,Stanberry LR.Civamide for treatment of primary or recurrentexperimental genital herpes.Antimicrob Agents Chemother.1999,43(11):2685-2688]；同样，艾滋病患者也通常会出现末梢神经痛，有临床试验显示，单次在疼痛部位外敷反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺后，有一定的止痛效果[Simpson DM,Estanislao L,Brown SJ,Sampson J.J Pain Symptom Manage.2008,35(3):299-306；Simpson DM,BrownS,Tobias J,et al.Neurology.2008,70(24):2305-2313]。还有报道显示，当给予新生小鼠反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺后，小鼠的感觉神经元的数量减少，因而可降低疱疹病毒KJ502株致新生小鼠的死亡率[Ljungdahl A,Kristensson K,Lundberg JM,Lycke E,Svennerholm B,Ziegler R.J Neurol Sci.1986,72(2-3):223-230]。N-香草基酰胺衍生物在上述病毒感染所致疾病中的应用，都是基于此类化合物通过损伤/减少感觉神经元数量达到的止痛作用，而非通过抑制/杀伤病毒起效。

本发明涉及的拉沙病毒属沙粒病毒科，是一类单负链RNA病毒，是一种急性感染、高致死性的病毒，与疱疹病毒和人类免疫缺陷病毒的基因组、感染特性和临床表现均不相同，也不涉及感染所致神经末梢痛的临床适应症。同时本发明就是针对拉沙病毒感染的第一步，即病毒的进入环节发现拉沙病毒抑制剂，不涉及病毒感染的其他环节，如转录、翻译、组装、出芽，即复制和成熟过程。本发明是关于N-香草基酰胺衍生物阻断拉沙病毒感染宿主细胞的活性发现及基于该活性将此类化合物用于制备抗拉沙病毒感染及其所致疾病药物的应用。。因此，本发明和现有技术有明显的不同，而且通过现有技术公开的内容不能显而易见得到该类化合物可以抗拉沙病毒的进入，进一步抗拉沙病毒感染。

发明内容

本发明解决的技术问题是，提供N-香草基酰胺衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗拉沙病毒感染以及预防或治疗拉沙病毒感染引起的疾病的药物中的应用

具体而言，为解决本发明的技术问题，采用如下技术方案：

本发明技术方案的一方面提供了如结构式(I)所示的N-香草基酰胺衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗拉沙病毒感染以及预防或治疗拉沙病毒感染引起的疾病的药物中的应用；

式(I)中R可选自C1-C12的烷基或C1-C12的烯基，优选地，R选自C5-C11的烷基或C5-C11的烯基。进一步，R优选自C8、C9、C10的烷基或C8、C9、C10的烯基。

最优选的N-香草基酰胺衍生物选自：

反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺

顺式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺

8-甲基-N-香草基-壬酰胺

9-甲基-N-香草基-6-癸酰胺

N-香草基壬酰胺。

所述的疾病包括病毒性出血热。

其中所述的盐选自有机酸根或无机酸根。其中，所述的有机盐包括磺酸盐、羧酸盐、氨基酸盐以及脂肪酸盐，无机盐包括盐酸盐、溴酸盐、碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐和硝酸盐。

所述的磺酸盐包括含1-15个碳原子的烷基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、邻甲苯磺酸盐、间甲苯磺酸盐；羧酸盐包括酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、枸橼酸盐、苹果酸盐、肉桂酸盐、苯甲酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、戊二酸盐、己二酸盐、双羟萘酸盐及乳酸盐；氨基酸盐包括谷氨酸盐、天冬氨酸盐；脂肪酸盐包括含2-18个碳原子的长链脂肪酸盐。

本发明技术方案的第二方面是提供了一种药物组合物在制备抗拉沙病毒感染的药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物包含结构式(I)所示的N-香草基酰胺衍生物及其药学上可接受的盐作为有效成分以及药学上可接受的载体或赋形剂，

式(I)中R可选自C1-C12的烷基或C1-C12的烯基，优选地，R选自C5-C11的烷基或C5-C11的烯基。进一步，R优选自C8、C9、C10的烷基或C8、C9、C10的烯基。

最优选的，所述的N-香草基酰胺衍生物选自：

反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺

顺式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺

8-甲基-N-香草基-壬酰胺

9-甲基-N-香草基-6-癸酰胺

N-香草基壬酰胺。

进一步的，第二方面所述的药物组合物还含有其它的抗病毒药。

所述的疾病包括病毒性出血热。

该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

本发明的发明人发现N-香草基酰胺衍生物可阻断拉沙病毒感染宿主细胞。还可以和其他的抗病毒药物进行联合用药。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

有益技术效果

拉沙病毒感染所致的拉沙出血热发病快、致死率高，目前尚无疫苗或特效药物。本发明针对拉沙病毒进入宿主细胞是病毒感染的第一步，从800个天然产物中发现广泛存在于茄科植物中的N-香草基酰胺衍生物，可阻断拉沙病毒的进入过程。本发明将有助于缓解拉沙病毒感染疫情，作为疾病预防及治疗的潜在新手段。

附图说明

图1.LASV-GP/HIV-luc病毒和VSV-G/HIV-luc重组病毒感染模型。

图2.N-香草基酰胺衍生物阻断拉沙重组病毒感染活性

图3.N-香草基酰胺衍生物对HIV-1复制的影响

图4.N-香草基酰胺衍生物对细胞增殖的影响

具体实施方式

实施例1.筛选模型的原理

拉沙病毒进入宿主细胞是病毒感染的第一步，抑制病毒的进入就可有效阻断病毒感染。拉沙病毒包膜表面的糖蛋白(Glycoprotein，GP)是拉沙病毒进入过程的关键蛋白。

本发明采用重组病毒技术，将表达拉沙病毒GP基因(LASV-GP，基因登录号NP_694870.1)的质粒或水泡性口膜炎病毒外壳蛋白(vesicular stomatitis virusglycoprotein,VSV-G)的质粒，分别与表达HIV-1核心基因的质粒(pNL4-3-Luc-R-E^-)共转染至293T细胞。细胞表达的LASV-GP与HIV-1核心可组装成拉沙重组病毒(LASV-GP/HIV-luc)、细胞表达的VSV-G与HIV-1核心可组装成VSV-G/HIV-luc重组病毒[曹颖莉，郭颖.应用假病毒技术研究HIV-1复制抑制剂.药学学报，2008，43:253-258；Zhang X,Tang K,Guo J,Chen Q,Guo Y.Establishment of evaluation system for a cell-based arenavirusentry inhibitor,Acta Pharmaceutica Sinica,2018,53(5):735-742.]。该重组病毒的特点是将HIV基因组中env、vpr和nef基因敲除，因此重组病毒颗粒仅能单次感染细胞并且在细胞内能复制，不具有再次包装和繁殖的能力，可在常规实验室进行操作；在nef基因处引入表达荧光素酶基因，因此被感染的细胞会表达荧光素酶，通过检测细胞内相对荧光素酶活性(RLUs)就可标示细胞被病毒感染的程度。模型构建结果见图1。

实施例2.实验方法和结果

重组病毒制备[曹颖莉，郭颖.应用假病毒技术研究HIV-1复制抑制剂.药学学报，2008，43:253-258；Zhang X,Tang K,Guo J,Chen Q,Guo Y.Establishment of evaluationsystem for a cell-based arenavirus entry inhibitor,Acta Pharmaceutica Sinica,2018,53(5):735-742.]：将表达HIV-1核心基因的质粒(pNL4-3-Luc-R^-E^-)分别与表达拉沙病毒GP基因的质粒或VSV-G质粒共转染至293T细胞，转染后48h收集上清，上清液经0.45μm滤膜过滤，该上清中含有拉沙重组病毒或VSV-G/HIV-luc重组病毒，可用于感染。

感染[曹颖莉，郭颖.应用假病毒技术研究HIV-1复制抑制剂.药学学报，2008，43:253-258；Zhang X,Tang K,Guo J,Chen Q,Guo Y.Establishment of evaluation systemfor a cell-based arenavirus entry inhibitor,Acta Pharmaceutica Sinica,2018,53(5):735-742.]：感染前一天，按每孔6×10⁴个细胞的密度将293细胞接种到24孔板上。用DMSO溶解阳性对照化合物或待筛选化合物，感染前15分钟加入细胞培养液中，以DMSO溶剂作空白对照。加入适宜稀释度的LASV-GP/HIV-luc或VSV-G/HIV-luc重组病毒。感染48小时后，弃去上清，然后向被感染的细胞每孔加入50μL细胞裂解液(Promega)裂解细胞，将30μL荧光素酶底物(Promega)与20μL细胞裂解液混合后用FB15荧光检测器(Sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，其活性的强弱反映了病毒的感染的水平。

结果显示，N-香草基酰胺衍生物可有效阻断拉沙重组病毒对宿主细胞的感染(结果见表1、量效曲线见图2)，而对HIV-1的复制无显著影响(结果见表2、量效曲线见图3)。

表1 N-香草基酰胺衍生物可阻断拉沙重组病毒感染宿主细胞

表2 N-香草基酰胺衍生物对HIV-1复制的影响

实施例3.检测化合物对细胞增殖的影响

将HEK293T细胞按8000个/孔密度接种至96孔板,每孔100μL细胞液，37℃，5％CO₂培养24h。次日将不同浓度的受试化合物加至细胞，以等量DMSO(0.1％v/v)作为溶剂对照。继续培养48h后,每孔加入CellTiter-Glo试剂100μL,振荡混匀2min,室温孵育10min，测定各孔中的RLUs[Tang K,He S,Zhang X,et al.Tangeretin,an extract from Citruspeels,blocks cellular entry of arenaviruses that cause viral hemorrhagicfever.Antiviral Res.2018,160:87-93.]。以DMSO溶剂孔RLUs值为100％,计算加药孔的细胞存活率。实验结果表明N-香草基酰胺衍生物，在其半数有效浓度浓度下对HEK293T细胞的增殖没有影响(结果见表3、量效曲线见图4)。综上所述，认为N-香草基酰胺衍生物可有效阻断拉沙重组病毒对宿主细胞的感染。

表3 N-香草基酰胺衍生物对HEK293T细胞增殖的影响

Claims (12)

1.如结构式(I)所示的N-香草基酰胺衍生物及其药学上可接受的盐在制备抗拉沙病毒感染以及预防或治疗拉沙病毒感染引起的疾病的药物中的应用，

式(I)中R选自C1-C12的烷基或C1-C12的烯基。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，

式(I)中，R选自C5-C11的烷基或C5-C11的烯基。

3.根据权利要求2的应用，其特征在于，

式(I)中，R选自C8、C9、C10的烷基或C8、C9、C10的烯基。

4.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的N-香草基酰胺衍生物选自：

反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺

顺式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺

8-甲基-N-香草基-壬酰胺

9-甲基-N-香草基-6-癸酰胺

N-香草基壬酰胺。

5.根据权利要求1-4任一项的应用，其特征在于，所述的疾病包括病毒性出血热。

6.根据权利要求1-4任一项的应用，其特征在于，所述的盐包括药学上可接受的有机盐或无机盐，其中，所述的有机盐包括磺酸盐、羧酸盐、氨基酸盐以及脂肪酸盐，无机盐包括盐酸盐、溴酸盐、碘酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐和硝酸盐。

7.根据权利要求6的应用，其特征在于，所述的磺酸盐包括含1-15个碳原子的烷基磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐、邻甲苯磺酸盐、间甲苯磺酸盐；羧酸盐包括酒石酸盐、马来酸盐、富马酸盐、枸橼酸盐、苹果酸盐、肉桂酸盐、苯甲酸盐、丙二酸盐、丁二酸盐、戊二酸盐、己二酸盐、双羟萘酸盐及乳酸盐；氨基酸盐包括谷氨酸盐、天冬氨酸盐；脂肪酸盐包括含2-18个碳原子的长链脂肪酸盐。

8.一种药物组合物在制备抗拉沙病毒感染以及预防或治疗拉沙病毒感染引起的疾病的药物中的应用，其特征在于，所述的药物组合物包含结构式(I)所示的N-香草基酰胺衍生物及其药学上可接受的盐作为有效成分以及药学上可接受的载体或赋形剂，

式(I)中R选自C1-C12的烷基或C1-C12的烯基。

9.根据权利要求8的应用，其特征在于，

式(I)中，R选自C5-C11的烷基或C5-C11的烯基。

10.根据权利要求9的应用，其特征在于，

式(I)中，R选自C8、C9、C10的烷基或C8、C9、C10的烯基。

11.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述的N-香草基酰胺衍生物选自：

反式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺

顺式-8-甲基-N-香草基-6-壬烯酰胺

8-甲基-N-香草基-壬酰胺

9-甲基-N-香草基-6-癸酰胺

N-香草基壬酰胺。

12.根据权利要求8的应用，其特征在于，所述的药物组合物还含有其它的抗病毒药。

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