CN111632206A - 一种自抗凝且可显影的小口径人工血管支架及其制备方法 - Google Patents

一种自抗凝且可显影的小口径人工血管支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种自抗凝且可显影的小口径人工血管支架及其制备方法。具体提供了一种人工血管支架材料，它是以由造影剂与聚己内酯为核层原料、以抗凝剂与聚己内酯为壳层原料制得的核壳结构的纳米纤维制备而成的。利用该人工血管支架材料制得的小口径人工血管支架的孔径小于6mm，自抗凝性显著改善，血管长期通畅率显著提高，能够有效抑制血管吻合口形成血栓；同时，该小口径人工血管支架还具有优异的显影能力，便于手术后续监测血管支架的降解情况，对患者术后复查进行血管定位，避免复查过程中注射造影剂给人体带来不适。本发明提供的小口径人工血管支架在血管移植手术中具有良好的应用前景。

Description

一种自抗凝且可显影的小口径人工血管支架及其制备方法
技术领域
本发明属于血管支架领域，具体涉及一种自抗凝且可显影的小口径人工血管支架及其制备方法。
背景技术
心血管疾病是危害人类健康的常见疾病之一，患者出现由于外伤、动脉硬化和血管栓塞等原因引起的血管损伤。其中，冠心病是目前危害人类生命健康的主要心血管疾病之一，其发病率越来越高，并且患者出现年轻化趋势。冠心病又称冠状动脉粥样硬化性心脏病，是由于人体内心脏冠状动脉血管发生粥样硬化病变而导致血管内部狭窄，严重者全部堵塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死。目前，对于这类疾病的治疗方法主要采用药物治疗、手术治疗以及介入治疗，其中以介入治疗为主。介入治疗主要采用经皮冠状动脉腔内血管成形术(PTCA)介入治疗，将血管支架植入到狭窄部位，将支架撑开，用以支撑，使血液正常流通，以达到减少堵塞的目的。
目前，已经报道过的制备人工血管支架的方法很多，包括去细胞组织复合法、浸渍-沥滤法、混凝法、静电纺丝法等。其中，静电纺丝法是用高压电源将一种极性的电荷引入聚合物溶液或熔体中，当电场强度足够强大时，毛细管尖端的液滴克服表面张力形成射流，聚合物射流在从毛细喷头尖端射出至接收装置的过程中被拉伸，溶剂挥发后形成纳米级纤维，然后在接收装置中形成一定尺寸的产品。由于静电纺丝法制得的纤维直径可以从几十纳米到几微米，而且具有孔隙率高、比表面积大、孔径分布较宽的特点，因此适合用来制备小口径人工血管支架。
现在已经有多种可降解高分子材料被用于制备人工血管支架，主要分为两类:一类为可降解人工合成材料，如涤纶，膨化聚四氟乙烯，聚氨酯，PGA，PHA等；另一类为可降解天然生物材料，如胶原，透明质酸，丝素蛋白，壳聚糖，细菌纤维素等。这些材料合成的人工血管支架多为大口径(孔径大于6mm)人工血管支架，在针对大口径血管的手术治疗以及介入治疗中已取得了显著成效，但是，在针对小口径血管(孔径小于6mm，如四肢动脉血管、冠状动脉血管等)方面，还存在很多严重的问题，一直未获得满意的临床效果。
在临床应用中，小口径人工血管支架存在的主要问题是血液与管腔接触时易引发血小板聚集，血管吻合口易形成血栓，危及手术安全及患者生命安全，并降低血管的长期通畅率。此外，手术之后通常需要对患者进行术后复查，监测人工血管在体内的情况，而血管是软组织，一般位于人体较深的位置，普通的CT成像或核磁共振成像对小口径人工血管支架的显影能力较差。
因此，亟需制备出一种能够有效抑制血管吻合口血小板聚集、抑制血栓形成，同时具有优异的显影能力的小口径人工血管支架。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自抗凝性更佳、长期通畅率更高、显影能力更优异的小口径人工血管支架。
本发明提供了一种人工血管支架材料，它是由以造影剂与聚己内酯为核层原料、以抗凝剂与聚己内酯为壳层原料制得的核壳结构的纳米纤维制备而成的。
进一步地，所述造影剂为磁共振造影剂或CT造影剂，优选为Gd基造影剂、Fe基造影剂或Mn基造影剂；
和/或，所述抗凝剂选自壳聚糖或其衍生物、抑肽酶或前列腺素类物质。
进一步地，所述Mn基造影剂为氧化锰，所述氧化锰优选为氧化锰纳米颗粒；
和/或，所述壳聚糖衍生物为羧化壳聚糖，所述羧化壳聚糖的粘度优选为10～80mPa·s；
和/或，所述聚己内酯的分子量为60000～10000，优选为80000。
进一步地，所述氧化锰纳米颗粒是高锰酸钾和葡萄糖发生氧化还原反应后得到的，所述高锰酸钾和葡萄糖的质量比优选为376:28。
进一步地，所述核层原料中，造影剂与聚己内酯的质量比为1：(5～25)，优选为1:(10～20)；
所述壳层原料中，所述抗凝剂与聚己内酯的质量比为4：(5～25)，优选为4:(10～20)；
所述核层原料中的聚己内酯与壳层原料中的聚己内酯质量比为1：(0.8～1.2)，优选为1:1。
本发明还提供了一种小口径人工血管支架，所述小口径人工血管支架是由上述人工血管支架材料制得的；
优选的，所述小口径人工血管支架的孔径小于6mm，优选为2mm。
本发明还提供了上述小口径人工血管支架的制备方法，所述方法为：将上述核层原料与有机溶剂混合所得液体作为核层纺丝液，将壳层原料与有机溶剂混合所得液体作为壳层纺丝液，通过静电纺丝设备进行静电纺丝，即得。
进一步地，所述核层纺丝液中，有机溶剂为氯仿和甲醇的混合溶液，优选为氯仿和甲醇体积比为4:1的混合溶液；核层原料与有机溶剂的质量体积比为(10～12)：100g/mL，优选为11:100g/mL；
和/或，所述壳层纺丝液中，有机溶剂为三氟乙酸，壳层原料与有机溶剂的质量体积比为(12～16):100g/mL，优选为14:100g/mL。
进一步地，所述静电纺丝设备为同轴静电纺丝设备，包括推注装置、喷射装置和接收装置，喷射装置包括针筒和同轴针头；
所述静电纺丝设备的工作温度为25～40℃，优选为35℃；工作湿度为30～50％，优选为40％；工作电压为负压-2.00V，正压+25.00V；所述静电纺丝时间为4～8小时，优选为6小时；
所述静电纺丝设备推注核层纺丝液的推注速度为0.008mL/min，采用的同轴针头型号为22号；
所述静电纺丝设备推注壳层纺丝液的推注速度为0.010mL/min，采用的同轴针头型号为17号；
所述静电纺丝设备的接收装置为直径6mm的金属杆，优选为直径2mm的金属杆；所述接收装置与同轴针头的距离为15cm。
本发明还提供了上述人工血管支架材料在制备小口径人工血管支架中的用途。
本发明以氧化锰纳米颗粒和PCL为核层原料、以羧化壳聚糖与PCL为壳层原料，通过同轴静电纺丝的方法制得了孔径小于6mm小口径人工血管支架，该小口径人工血管支架的自抗凝性显著改善，血管长期通畅率显著提高，能够有效抑制血管吻合口形成血栓；同时，该小口径人工血管支架还具有优异的显影能力，便于手术后续监测血管支架的降解情况，对患者术后复查进行血管定位，避免复查过程中注射造影剂给人体带来不适。本发明提供的小口径人工血管支架在血管移植手术中具有良好的应用前景。
与现有技术报道的抗凝血功能化修饰的聚己内酯/壳聚糖复合小口径人工血管相比(Biomaterials 30(2009)2276–2283)，本发明提供的小口径人工血管支架原料中不含肝素，减少了原料种类，节约了成本。
本发明采用的原料生物相容性好，制备方法简单，条件温和，适合扩大化生产。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为本发明小口径人工血管支架的制备工艺示意图。
图2为同轴静电纺丝设备的图片。
图3为APTT和TT测试结果，其中，*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，***表示p＜0.005，****表示p＜0.001。
图4为血液长期通畅率测试操作方法示意图(A)，测试结果：PCL100％(B)、实施例1制得的人工血管支架(C)。
图5为Micro CT成像图：PCL100％(A)、实施例1制得的人工血管支架(B)。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
其中，聚己内酯(PCL)购买于Sigmae-Aldrich，分子量为80000。羧化壳聚糖购买于Aladin，粘度为10-80mPa·s。
实施例1本发明小口径人工血管支架的制备
1、合成氧化锰(BM)纳米颗粒
称取0.376g高锰酸钾、0.028g葡萄糖和30mL去离子水依次加入50mL烧杯中，快速搅拌20min后将烧杯置于70℃烘箱中保温6h。反应后自然冷却，洗涤沉淀至滤液为无色，所得滤饼自然干燥后研细，即得BM纳米颗粒。
2、制备小口径人工血管支架
采用同轴静电纺丝制备本发明的小口径人工血管支架，同轴静电纺丝设备如图2所示，设备包括推注装置、喷射装置和接收装置，喷射装置包括针筒和同轴针头。具体工艺如下(工艺示意图如图1所示)：
将PCL(1g)溶于氯仿和甲醇(4：1，v/v)混合溶液(10mL)中，得到PCL溶液，将BM纳米颗粒(0.1g)作为分散相加入到PCL溶液中，混合均匀，得到的共混物作为核层纺丝溶液；将PCL(1g)和CMC(0.4g)以三氟乙酸(TFA，10mL)为溶剂溶解，混合均匀，配制成壳层纺丝溶液；核层和壳层纺丝溶液分别搅拌12h。
在同轴静电纺丝设备中分别推注核层纺丝溶液、壳层纺丝溶液，由同轴针头喷出具有核壳结构的纳米纤维，然后在距离同轴针头15cm的接收装置(直径2mm的金属杆)中得到本发明的小口径人工血管支架：PCL/CMC4-PCL/BM1。该小口径人工血管支架的内径为2mm。
静电纺丝时，核层纺丝溶液推注速度为0.008mL/min，壳层纺丝溶液推注速度为0.010mL/mim；核层纺丝溶液采用的同轴针头型号为22号，壳层纺丝溶液采用的同轴针头型号为17号；纺丝环境为：温度35℃，湿度40％；纺丝设备的工作电压为负压-2.00V，正压+25.00V；接收装置的转速为2000r/min；纺丝时间为6h。
实施例2本发明小口径人工血管支架的制备
参照实施例1的方法，将CMC的用量更改为0.2g，其余条件均与实施例1相同，得到本发明的小口径人工血管支架：PCL/CMC2-PCL/BM1。
实施例3本发明小口径人工血管支架的制备
参照实施例1的方法，将BM纳米颗粒的用量更改为0.05g，其余条件均与实施例1相同，得到本发明的小口径人工血管支架:PCL/CMC4-PCL/BM0.5。
以下制备对照样品。
对照例1对照人工血管支架的制备
将PCL溶于氯仿和甲醇(4：1，v/v)混合溶液中，得到12％g/mL的PCL溶液。以该PCL溶液作为纺丝溶液，按照与实施例1相同的静电纺丝条件，得到纯PCL人工血管支架：PCL100％。
对照例2高CMC含量小口径人工血管支架的制备
参照实施例1的方法，将CMC的用量更改为1g，其余条件均与实施例1相同，得到高CMC含量小口径人工血管支架：PCL/CMC10-PCL/BM1。
静电纺丝过程中发现，纺丝溶液粘度过大，易在针头处形成很大的液滴，需要反复清理，在高压下无法稳定连续出丝，使得纺丝时间由原来的6h增加至12h，时间成本和人工成本大大增加，故本对照例中的纺丝溶液的可纺性比实施例1降低。
对照例3高BM含量小口径人工血管支架的制备
参照实施例1的方法，将BM纳米颗粒的用量更改为0.5g，其余条件均与实施例1相同，得到高BM含量小口径人工血管支架:PCL/CMC4-PCL/BM5。
静电纺丝过程中发现，由于BM纳米颗粒掺杂过多，针头易堵塞，需要反复清理疏通，在高压下核层溶液无法稳定连续出丝，使得纺丝时间由原来的6h增加至12h，时间成本和人工成本大大增加，故本对照例中的纺丝溶液的可纺性比实施例1降低。
以下通过实验例证明本发明小口径人工血管支架的有益效果。
实验例1本发明小口径人工血管支架的自抗凝性测试
1、实验方法
为了研究实施例1～3制得的小口径人工血管支架和对照例1制得的纯PCL人工血管支架的抗凝血性能，使用自动化血液凝固分析仪CA-50(Sysmex Corporation，Kobe，Japan)进行凝血时间测试。
(1)测试活化部分凝血活酶时间(APTT)：首先将待测样品在生理盐水中浸泡过夜。之后将生理盐水吸出，换成新鲜的生理盐水在37℃下孵化1小时。之后将生理盐水换成贫血小板血浆(platelet-poor plasma，PPP)，每个样品中加入200μL血浆，在37℃下孵化半小时。然后将50μL孵化过的PPP加入到样品杯中，随后加入50μL APTT试剂(西门子，使用前孵化10分钟)，并在37℃下孵化3分钟。然后加入50μL的CaCl2溶液(0.025mol/L)，之后测定APTT时间。
(2)测试凝血酶时间(TT)：其过程与APTT测试方法相似，区别仅在于将50μL APTT试剂替换为100μL TT试剂(西门子，使用前孵化15分钟)。
对于每个样品的APTT和TT测试均重复三次取平均值，以减少误差。
2、实验结果
根据APTT和TT来评价各人工血管支架的抗凝血活性。如图3所示，纯PCL人工血管支架(PCL100％)的TT和APTT与贫血小板血浆(PPP)几乎相同，说明PCL100％与血液成分之间基本没有吸附或反应。与PPP和PCL100％相比，本发明实施例制得的小口径人工血管支架的TT和APTT都提高了；特别是APTT，本发明实施例制得的小口径人工血管支架的APTT显著提高。
上述结果表明，本发明以氧化锰纳米颗粒和PCL为核层原料、以羧化壳聚糖与PCL为壳层原料制得的小口径人工血管支架能够显著延长凝血时间，有效防止血栓形成。
此外，与PCL/CMC2-PCL/BM1相比，PCL/CMC4-PCL/BM1和PCL/CMC4-PCL/BM0.5的APTT明显提高，说明在原料中适当增加CMC的含量，有利于增加小口径人工血管支架的抗凝血活性。
考虑到原料中CMC的含量太高，会影响纺丝溶液的可纺性(参见对照例2)，所以，只有在本发明特定比例范围的原料配比下，才能同时保证材料制备过程的可纺性和目标产品的自抗凝性。
实验例2本发明小口径人工血管支架的血液长期通畅率测试
1、实验方法
通过体外模拟血液循环，测试实施例1～3制得的小口径人工血管支架和对照例1制得的纯PCL人工血管支架的血液长期通畅率，评价其抗血栓形成的能力。具体操作如下：
将待测人工血管支架在PBS中预浸过夜。
采用含有柠檬酸钠的真空管(5mL,Terumo Co.)收集健康人体新鲜血液(健康人，25岁)，加入抗凝剂(血液：抗凝剂体积比＝1:9)，备用。
使用前，在全血中加入0.025mol/L CaCl2溶液，CaCl2溶液的添加量为全血的10％。将添加了CaCl2溶液的全血加入5ml注射器中，然后以1mL/min的速度泵入待测人工血管支架。用新鲜制备的戊二醛溶液(2.5wt.％)固定人工血管支架7天后，肉眼观察血管支架内腔。操作方法如图4A所示。
2、实验结果
固定7天后，肉眼观察血管支架内腔，纯PCL人工血管支架(PCL100％)通过全血循环后内腔有大量血栓形成(图4B)，而本发明实施例1～3制得的人工血管支架内腔均无明显血栓，其形成的血栓比PCL100％明显减少，其中，实施例1得的人工血管支架的测试结果如图4C所示。
上述结果表明，本发明以氧化锰纳米颗粒和PCL为核层原料、以羧化壳聚糖与PCL为壳层原料制得的小口径人工血管支架能够显著提高血液的长期通畅率，提高抗血栓形成能力。
实验例3本发明小口径人工血管支架的显影能力测试
1、实验方法
将实施例1～3制得的小口径人工血管支架和对照例1制得的纯PCL人工血管支架放置于小动物活体Micro CT成像仪(Quantum GX，美国PerkinElmer)中，扫描成像。
2、实验结果
结果显示，加入BM后，本发明实施例1～3制得的小口径人工血管支架比对照例1制得的纯PCL人工血管支架(PCL100％)的成像更清晰，具有增强的显影能力。PCL100％的Micro CT成像图如图5A所示，实施例1得到的人工血管支架的测试结果如图5B所示。
上述结果表明，本发明以氧化锰纳米颗粒和PCL为核层原料、以羧化壳聚糖与PCL为壳层原料制得的小口径人工血管支架能够显著提高其显影能力。
此外，考虑到原料中BM的含量太高，会影响纺丝溶液的可纺性(参见对照例3)，所以，只有在本发明特定比例范围的原料配比下，才能同时保证材料制备过程的可纺性和目标产品的显影能力。
综上，本发明以氧化锰纳米颗粒和PCL为核层原料、以羧化壳聚糖与PCL为壳层原料，通过同轴静电纺丝的方法制得了孔径小于6mm小口径人工血管支架，该小口径人工血管支架的自抗凝性显著改善，血管长期通畅率显著提高，能够有效抑制血管吻合口形成血栓；同时，该小口径人工血管支架还具有优异的显影能力，便于手术后续监测血管支架的降解情况，对患者术后复查进行血管定位，避免复查过程中注射造影剂给人体带来不适。本发明提供的小口径人工血管支架在血管移植手术中具有良好的应用前景。

Claims (10)

1.一种人工血管支架材料，其特征在于：它是由以造影剂与聚己内酯为核层原料、以抗凝剂与聚己内酯为壳层原料制得的核壳结构的纳米纤维制备而成的。
2.根据权利要求1所述的人工血管支架材料，其特征在于：所述造影剂为磁共振造影剂或CT造影剂，优选为Gd基造影剂、Fe基造影剂或Mn基造影剂；
和/或，所述抗凝剂选自壳聚糖或其衍生物、抑肽酶或前列腺素类物质。
3.根据权利要求2所述的人工血管支架材料，其特征在于：所述Mn基造影剂为氧化锰，所述氧化锰优选为氧化锰纳米颗粒；
和/或，所述壳聚糖衍生物为羧化壳聚糖，所述羧化壳聚糖的粘度优选为10～80mPa·s；
和/或，所述聚己内酯的分子量为60000～10000，优选为80000。
4.根据权利要求3所述的人工血管支架材料，其特征在于：所述氧化锰纳米颗粒是高锰酸钾和葡萄糖发生氧化还原反应后得到的，所述高锰酸钾和葡萄糖的质量比优选为376:28。
5.根据权利要求1～4任一项所述的人工血管支架材料，其特征在于：所述核层原料中，造影剂与聚己内酯的质量比为1：(5～25)，优选为1:(10～20)；
所述壳层原料中，所述抗凝剂与聚己内酯的质量比为4：(5～25)，优选为4:(10～20)；
所述核层原料中的聚己内酯与壳层原料中的聚己内酯质量比为1：(0.8～1.2)，优选为1:1。
6.一种小口径人工血管支架，其特征在于：所述小口径人工血管支架是由权利要求1～5任一项所述人工血管支架材料制得的；
优选的，所述小口径人工血管支架的孔径小于6mm，优选为2mm。
7.权利要求6所述小口径人工血管支架的制备方法，其特征在于：所述方法为：将权利要求1～5任一项所述核层原料与有机溶剂混合所得液体作为核层纺丝液，将壳层原料与有机溶剂混合所得液体作为壳层纺丝液，通过静电纺丝设备进行静电纺丝，即得。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述核层纺丝液中，有机溶剂为氯仿和甲醇的混合溶液，优选为氯仿和甲醇体积比为4:1的混合溶液；核层原料与有机溶剂的质量体积比为(10～12)：100g/mL，优选为11:100g/mL；
和/或，所述壳层纺丝液中，有机溶剂为三氟乙酸，壳层原料与有机溶剂的质量体积比为(12～16):100g/mL，优选为14:100g/mL。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述静电纺丝设备为同轴静电纺丝设备，包括推注装置、喷射装置和接收装置，喷射装置包括针筒和同轴针头；
所述静电纺丝设备的工作温度为25～40℃，优选为35℃；工作湿度为30～50％，优选为40％；工作电压为负压-2.00V，正压+25.00V；所述静电纺丝时间为4～8小时，优选为6小时；
所述静电纺丝设备推注核层纺丝液的推注速度为0.008mL/min，采用的同轴针头型号为22号；
所述静电纺丝设备推注壳层纺丝液的推注速度为0.010mL/min，采用的同轴针头型号为17号；
所述静电纺丝设备的接收装置为直径6mm的金属杆，优选为直径2mm的金属杆；所述接收装置与同轴针头的距离为15cm。
10.权利要求1～5任一项所述人工血管支架材料在制备小口径人工血管支架中的用途。
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