CN111621425B - 侧耳木霉菌株zj-03在玉米精深加工中的应用 - Google Patents

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Abstract

侧耳木霉菌株ZJ‑03在玉米精深加工中的应用，涉及食品加工技术领域。本发明的目的是要解决如何利用侧耳木霉产具有高酶活的脂肪酶的问题。方法：将侧耳木霉ZJ‑03孢子接种于PDA平板培养基中，置于霉菌培养箱中培养，将活化后的侧耳木霉ZJ‑03菌种孢子取下，打散摇匀，得到侧耳木霉ZJ‑03孢子悬液；将固体培养料干基装入容器中，接种侧耳木霉ZJ‑03孢子悬液，发酵室内培养，得到侧耳木霉固体发酵料；将侧耳木霉固体发酵料静止浸提，得到浸提固液混合物；将浸提固液混合物粗过滤、离心，取上清液，得到脂肪酶。本发明可获得侧耳木霉菌株ZJ‑03在玉米精深加工中的应用。

Description

侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用
技术领域
本发明涉及食品加工技术领域，具体涉及侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用。
背景技术
脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，其催化天然底物油脂水解，生成游离脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯；另外，脂肪酶也催化其它酯水解、酯基转移且具有对映选择性。脂肪酶以其特殊的化学和生物转化作用，被广泛应用于制药、食品、洗涤和有机合成等行业。
目前生产上常采用液体深层培养法生产脂肪酶，作为节约生产成本的固态发酵技术在脂肪酶生产中也有较多成功实例。液体深层培养易于控制，不易染杂菌，生产效率高，但分离纯化成本高，且会产生大量污水。与液体发酵相比，固体发酵生产脂肪酶具有以下优点：(1)培养基简单且来源广泛；(2)投资少、能耗低、技术较简单；(3)产物的产率较高；(4)基质含水量低，可大大减少生物反应器的体积，不需要废水处理，环境污染较少，后处理加工方便；(5)发酵过程一般不需要严格的无菌操作；(6)通气一般可由气体扩散或间歇通风完成，不需要连续通风，空气一般也不需严格的无菌空气。
近年来利用农产品加工副产物进行固态发酵生产脂肪酶越来越受到人们的重视。这些农产品加工副产物不仅来源广泛，价格低廉，而且利用这些材料还能解决它们废弃造成的环境污染和高值化利用问题。但基质的组成、含水量以及湿度、温度、通气量和培养基组成是影响固态发酵生产胞外脂肪酶的主要因素。其中，采用侧耳木霉发酵应用于玉米精深加工中产脂肪酶，还未见报道；并且，如何产出具有高酶活的脂肪酶，成为食品加工行业内的技术难题。
发明内容
本发明的目的是要解决如何利用侧耳木霉产具有高酶活的脂肪酶的问题，而提供侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用。
侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，按以下步骤完成：
一、在无菌条件下，将侧耳木霉ZJ-03孢子接种于PDA平板培养基中，然后置于霉菌培养箱中培养，得到活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子；将活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子取下，并打散摇匀，得到浓度为1×107个/mL～1.2×107个/mL的侧耳木霉ZJ-03孢子悬液；
二、将玉米皮粉和玉米胚芽粕粉加入到营养液中，充分搅拌后灭菌，然后在无菌条件下，接种步骤一得到的侧耳木霉ZJ-03孢子悬液，接种量为0.5％～1.5％；接种后置于消毒后的发酵室内，在33℃～35℃下继续培养90h～100h，得到侧耳木霉固体发酵料；将侧耳木霉固体发酵料浸提，得到浸提固液混合物；将浸提固液混合物进行粗过滤、离心，取上清液，得到脂肪酶。
本发明的有益效果：
一、本发明侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，实现侧耳木霉ZJ-03菌株以玉米皮、玉米胚芽粕和玉米胚芽油为固态发酵主要基质和诱导物生长，并在生长期诱导产生脂肪酶，培养基简单且来源广泛、投资少、能耗低、技术较简单，方法具有可行性，其中，玉米皮和玉米胚芽粕以往均作为家禽和家畜的饲料添加物，或直接丢弃，附加值不高；本发明将玉米皮和玉米胚芽粕为固态发酵主要基质，不仅增加了玉米皮和玉米胚芽粕的附加值，还为玉米精深加工的及脂肪酶的制备探索出了一条新途径。
二、本发明所产脂肪酶的酶活为364IU/g侧耳木霉固体发酵料，而现有以其他含纤维物质作为固态发酵基质，诱导侧耳木霉发酵产脂肪酶，本发明所产脂肪酶的酶活为现有所产脂肪酶的酶活的3倍～5倍；现有以玉米皮和玉米胚芽粕作为固态发酵基质，诱导哈茨木霉、长枝木霉、黑曲霉、米曲霉、脉孢霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等发酵产脂肪酶，本发明所产脂肪酶的酶活比现有所产脂肪酶的酶活高30％以上。
本发明可获得侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用。
附图说明
图1为实施例一侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用的工艺流程图；
图2为平板培养基定性检测脂肪酶溶圈的正面图；
图3为平板培养基定性检测脂肪酶溶圈的反面图；
图4为活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子；
图5为侧耳木霉固体发酵料的示意图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，按以下步骤完成：
一、在无菌条件下，将侧耳木霉ZJ-03孢子接种于PDA平板培养基中，然后置于霉菌培养箱中培养，得到活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子；将活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子取下，并打散摇匀，得到浓度为1×107个/mL～1.2×107个/mL的侧耳木霉ZJ-03孢子悬液；
二、将玉米皮粉和玉米胚芽粕粉加入到营养液中，充分搅拌后灭菌，然后在无菌条件下，接种步骤一得到的侧耳木霉ZJ-03孢子悬液，接种量为0.5％～1.5％；接种后置于消毒后的发酵室内，在33℃～35℃下继续培养90h～100h，得到侧耳木霉固体发酵料；将侧耳木霉固体发酵料浸提，得到浸提固液混合物；将浸提固液混合物进行粗过滤、离心，取上清液，得到脂肪酶。
本实施方式的有益效果：
一、本实施方式侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，实现侧耳木霉ZJ-03 菌株以玉米皮、玉米胚芽粕和玉米胚芽油为固态发酵主要基质和诱导物生长，并在生长期诱导产生脂肪酶，培养基简单且来源广泛、投资少、能耗低、技术较简单，方法具有可行性，其中，玉米皮和玉米胚芽粕以往均作为家禽和家畜的饲料添加物，或直接丢弃，附加值不高；本实施方式将玉米皮和玉米胚芽粕为固态发酵主要基质，不仅增加了玉米皮和玉米胚芽粕的附加值，还为玉米精深加工的及脂肪酶的制备探索出了一条新途径。
二、本发明所产脂肪酶的酶活为364IU/g侧耳木霉固体发酵料，而现有以其他含纤维物质作为固态发酵基质，诱导侧耳木霉发酵产脂肪酶，本发明所产脂肪酶的酶活为现有所产脂肪酶的酶活的3倍～5倍；现有以玉米皮和玉米胚芽粕作为固态发酵基质，诱导哈茨木霉、长枝木霉、黑曲霉、米曲霉、脉孢霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等发酵产脂肪酶，本发明所产脂肪酶的酶活比现有所产脂肪酶的酶活高30％以上。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同点是：步骤一中所述的培养：在 28℃～32℃下培养至侧耳木霉ZJ-03孢子成熟；步骤二中所述的灭菌：充分搅拌后装入容器中，在121℃下灭菌1.5h；步骤二中所述的浸提：将侧耳木霉固体发酵料加入到纯水中，在33℃～35℃下静止浸提4h～6h；步骤二中所述的离心：将浸提固液混合物在 3000r/min～4000r/min的条件下离心10min～20min。
其他步骤与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同点是：步骤一中所述在无菌条件下，将侧耳木霉ZJ-03孢子接种于PDA平板培养基中，然后置于霉菌培养箱中，在30℃下培养至侧耳木霉ZJ-03孢子成熟，得到活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子。
其他步骤与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同点是：步骤二中所述的玉米皮粉按以下步骤制备：将玉米皮粉碎，过40目筛，取筛下物，得到玉米皮粉；玉米胚芽粕粉按以下步骤制备：将玉米胚芽粕粉碎，过40目筛，取筛下物，得到玉米胚芽粕粉。
其他步骤与具体实施方式一至三相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同点是：步骤二中所述的营养液按以下步骤制备：将葡萄糖母液、苏氨酸母液和玉米胚芽油加入到蒸馏水中，混合均匀，得到营养液，所述葡萄糖母液的质量、苏氨酸母液的质量和玉米胚芽油的体积与蒸馏水的体积的比为(0.5g～1g)：(0.5g～1g)：(0.5mL～1mL)：100mL。
其他步骤与具体实施方式一至四相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同点是：步骤二中所述侧耳木霉ZJ-03孢子悬液的接种量为1％。
其他步骤与具体实施方式一至五相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同点是：步骤二中所述接种后置于消毒后的发酵室内，在33℃下继续培养96h，得到侧耳木霉固体发酵料。
其他步骤与具体实施方式一至六相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同点是：步骤二中所述将侧耳木霉固体发酵料加入到纯水中，在33℃下静止浸提4h，得到浸提固液混合物。
其他步骤与具体实施方式一至七相同。
具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式一至八之一不同点是：步骤二中所述玉米皮粉与玉米胚芽粕粉的质量比为(7～7.5):3，玉米皮粉和玉米胚芽粕粉的总质量与营养液的体积的比为1:(1.6～2)，侧耳木霉固体发酵料的质量与纯水的体积的比为1g：(4mL～6mL)。
其他步骤与具体实施方式一至八相同。
具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式一至九之一不同点是：所述玉米皮粉与玉米胚芽粕粉的质量比为7:3，玉米皮粉和玉米胚芽粕粉的总质量与营养液的体积的比为 1:1.8，侧耳木霉固体发酵料的质量与纯水的体积的比为1g：4mL。
其他步骤与具体实施方式一至九相同。
采用以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：1、侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，按以下步骤完成：
一、侧耳木霉菌ZJ-03产脂肪酶的定性检测：
(一)定性方法：
透明圈法来定性侧耳木霉菌产脂肪酶，直观、简便、快捷。
(二)具体操作：
产脂肪酶定性平板培养基：将5g蔗糖、2g蛋白胨、0.5g NaCl、2g琼脂和0.5g玉米胚芽油加入到100mL蒸馏水中，并将pH调节至7.0，然后再121℃下灭菌15min，得到纯化好的侧耳木霉菌平板培养基。
利用直径为0.5mm打孔器将纯化好的侧耳木霉菌平板培养基进行打孔，将一片侧耳木霉菌片接种至侧耳木霉菌平板培养基中央，置于培养箱中，在33℃下培养3d～7d。每天观察菌落生长状况和水解圈的生成情况。图2为平板培养基定性检测脂肪酶溶圈的正面图，图3为平板培养基定性检测脂肪酶溶圈的反面图；如图2～图3所示，侧耳木霉菌平板培养基出现了溶圈的情况，说明培养基中的玉米胚芽油被脂肪酶水解，进而形成溶圈，因此可以证明，侧耳木霉菌ZJ-03产脂肪酶。
二、在无菌条件下，将侧耳木霉ZJ-03孢子接种于PDA平板培养基中，然后置于霉菌培养箱中，在30℃下培养至侧耳木霉ZJ-03孢子成熟，得到活化后的侧耳木霉ZJ-03 菌种孢子，图4为活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子；用适量无菌水将PDA平板培养基上的活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子进行冲洗并取下，并用灭菌的玻璃珠打散摇匀，经血球板计数，得到浓度为1×107个/mL的侧耳木霉ZJ-03孢子悬液；所述侧耳木霉(Trichodermapleuroticola)ZJ-03，从平菇菌包中分离，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.60689。
三、原料的预处理：
玉米皮的预处理：将玉米皮粉碎，过40目筛，取筛下物，得到玉米皮粉。
玉米胚芽粕的预处理：将玉米胚芽粕粉碎，过40目筛，取筛下物，得到玉米胚芽粕粉。
营养液的制备：将0.5g葡萄糖母液、0.5g苏氨酸母液和0.5mL玉米胚芽油加入到100mL蒸馏水中，混合均匀，得到营养液。
以上玉米皮、玉米胚芽粕、葡萄糖母液、苏氨酸母液和玉米胚芽油均购买自齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司。
四、将玉米皮粉和玉米胚芽粕粉加入到营养液中，充分搅拌均匀后装入聚丙烯长方体浅盘中(52cm×36cm×7cm)中，聚丙烯长方体浅盘中的料层高度为1.5cm，并在121℃灭菌 1.5h。然后在无菌条件下，接种步骤二得到的侧耳木霉ZJ-03孢子悬液，接种量为1％(v/m，即侧耳木霉ZJ-03孢子悬液的体积与固体培养料干基的质量比)；接种后置于消毒后的相对湿度80％的发酵室内的培养架上，在33℃下培养96h，得到侧耳木霉固体发酵料；发酵室内配备冷暖空调、加湿器和全自动温湿度计，图5为侧耳木霉固体发酵料的示意图；发酵结束后，将侧耳木霉固体发酵料加入到纯水中，在33℃下静止浸提4h，得到浸提固液混合物；利用4层纱布对浸提固液混合物进行粗过滤，去除孢子及固形物，再在 3000r/min的条件下离心15min，取上清液，得到脂肪酶；所述玉米皮粉与玉米胚芽粕粉的质量比为7:3，玉米皮粉和玉米胚芽粕粉的总质量与营养液的体积的比为1:1.8，侧耳木霉固体发酵料的质量与纯水的体积的比为1g：4mL。
五、脂肪酶活力测定方法：
参照QB1805.4-93方法进行测定，将1mL适当稀释酶液加入到4mLPVA橄榄油乳化液和1.5mL磷酸盐缓冲液组成的反应体系中，在40℃下振荡反应15min，乙醇终止反应后，再用浓度为0.05mol/L的NaOH溶液进行滴定，并以灭活酶液为空白对照，每分钟释放1μmoL的游离脂肪酸的酶量定义为一个活力单位；测定结果显示，步骤四中的脂肪酶的酶活为364IU/g侧耳木霉固体发酵料。随后，又做了几组对比试验，对比试验1：以其他含纤维物质作为固态发酵基质，诱导侧耳木霉发酵产脂肪酶，试验结果显示：本实施例所产脂肪酶的酶活为对比试验1所产脂肪酶的酶活的3倍～5倍；对比试验2：以玉米皮和玉米胚芽粕作为固态发酵基质，诱导哈茨木霉、长枝木霉、黑曲霉、米曲霉、脉孢霉、枯草芽孢杆菌和乳酸菌等发酵产脂肪酶，试验结果显示：本实施例所产脂肪酶的酶活比对比试验2所产脂肪酶的酶活高30％以上。

Claims (8)

1.侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，其特征在于按以下步骤完成：
一、在无菌条件下，将侧耳木霉ZJ-03孢子接种于PDA平板培养基中，然后置于霉菌培养箱中培养，得到活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子；将活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子取下，并打散摇匀，得到浓度为1×107个/mL～1.2×107个/mL的侧耳木霉ZJ-03孢子悬液；所述侧耳木霉菌株ZJ-03为侧耳木霉(Trichoderma pleuroticola)ZJ-03，保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC NO.60689；
二、将玉米皮粉和玉米胚芽粕粉加入到营养液中，充分搅拌后灭菌，然后在无菌条件下，接种步骤一得到的侧耳木霉ZJ-03孢子悬液，接种量为0.5％～1.5％，所述营养液按以下步骤制备：将葡萄糖母液、苏氨酸母液和玉米胚芽油加入到蒸馏水中，混合均匀，得到营养液，所述葡萄糖母液的质量、苏氨酸母液的质量和玉米胚芽油的体积与蒸馏水的体积的比为(0.5g～1g)：(0.5g～1g)：(0.5mL～1mL)：100mL；接种后置于消毒后的发酵室内，在33℃～35℃下继续培养90h～100h，得到侧耳木霉固体发酵料；将侧耳木霉固体发酵料浸提，得到浸提固液混合物，所述浸提为：将侧耳木霉固体发酵料加入到纯水中，在33℃～35℃下静止浸提4h～6h；所述玉米皮粉与玉米胚芽粕粉的质量比为(7～7.5):3，玉米皮粉和玉米胚芽粕粉的总质量与营养液的体积的比为1:(1.6～2)，侧耳木霉固体发酵料的质量与纯水的体积的比为1g：(4mL～6mL)；将浸提固液混合物进行粗过滤、离心，取上清液，得到脂肪酶。
2.根据权利要求1所述的侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，其特征在于步骤一中所述的培养：在28℃～32℃下培养至侧耳木霉ZJ-03孢子成熟；步骤二中所述的灭菌：充分搅拌后装入容器中，在121℃下灭菌1.5h；步骤二中所述的离心：将浸提固液混合物在3000r/min～4000r/min的条件下离心10min～20min。
3.根据权利要求1或2所述的侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，其特征在于步骤一中所述在无菌条件下，将侧耳木霉ZJ-03孢子接种于PDA平板培养基中，然后置于霉菌培养箱中，在30℃下培养至侧耳木霉ZJ-03孢子成熟，得到活化后的侧耳木霉ZJ-03菌种孢子。
4.根据权利要求1所述的侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，其特征在于步骤二中所述的玉米皮粉按以下步骤制备：将玉米皮粉碎，过40目筛，取筛下物，得到玉米皮粉；玉米胚芽粕粉按以下步骤制备：将玉米胚芽粕粉碎，过40目筛，取筛下物，得到玉米胚芽粕粉。
5.根据权利要求1所述的侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，其特征在于步骤二中所述侧耳木霉ZJ-03孢子悬液的接种量为1％。
6.根据权利要求1所述的侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，其特征在于步骤二中所述接种后置于消毒后的发酵室内，在33℃下继续培养96h，得到侧耳木霉固体发酵料。
7.根据权利要求1所述的侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，其特征在于步骤二中所述将侧耳木霉固体发酵料加入到纯水中，在33℃下静止浸提4h，得到浸提固液混合物。
8.根据权利要求1所述的侧耳木霉菌株ZJ-03在玉米精深加工中的应用，其特征在于所述玉米皮粉与玉米胚芽粕粉的质量比为7:3，玉米皮粉和玉米胚芽粕粉的总质量与营养液的体积的比为1:1.8，侧耳木霉固体发酵料的质量与纯水的体积的比为1g：4mL。
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