CN111616050B - 一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，属于植物繁殖技术领域。本发明提供的提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法以成年高产脂马尾松优树为研究对象，从无菌离体生根的角度，从生根培养基、培养方法、培养条件进行了系统的调整与优化，完成了高产脂马尾松从优选→繁殖→利用的全部过程；该方法利用缩节胺、多效唑及活性赤霉素进行不同生根阶段萜烯组分的生物合成调控，实现了高产脂马尾松生根能力的改善；且首次根据马尾松生根过程中关键二萜烯物质的作用机制，联合使用亚硒酸钠、还原型谷胱甘肽、海藻糖作为自由基清除剂和膜系统稳定剂，显著提升高产脂马尾松生根的稳定性。
Description
技术领域
本发明涉及一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，属于植物繁殖技术领域。
背景技术
松属(Pinus)树种是世界上分布范围最广的针叶树种，马尾松(Pinus massonianaLamb.)作为我国南方生态建设和脂材两用的主要造林树种，利用价值高，推广应用前景广阔。马尾松林木遗传分化差异大，家系遗传力低，人工林质量整体偏差，行业竞争力弱。通过选优进行无性系育林是提高林分生产力，促进马尾松产业发展的有效途径。从松脂化学组分来看，主要为单萜、倍半萜、二萜等萜烯物质。其中，二萜烯类物质占松脂总量的70％左右，研究发现，二萜烯物质具有明显的细胞毒性。马尾松属诱生根原基树种，在不定根形成过程中，易受内源生理代谢组分的影响，从而影响其生根稳定性，不定根发生困难。目前，有关马尾松生根的方法，主要是通过调整生长素、矿质营养元素的配比来促进其生根。
受繁殖材料老化、二萜烯含量高等生理特性的影响，以成年优选单株作为外植体来源的马尾松生根能力差异显著，生根稳定性差，育苗成本高昂，严重阻碍了马尾松良种产业化的发展进程，无性育林困难。目前，以马尾松成年植株离体再生成功的报道仍鲜少见，而以高产脂马尾松优树作为外植体，进行离体生根培养从而获取无菌组培苗的相关文献尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，包括如下步骤：
(1)继代芽的培养：采集成年马尾松高产脂优株的当年新梢进行嫁接，对嫁接苗进行截顶促萌处理，然后以幼化萌芽条为外植体进行无菌接种、初始芽诱导和继代增殖培养，获得马尾松继代芽；
(2)生根预处理：无菌条件下，截取步骤(1)所述的马尾松继代芽的顶芽转入培养基Ⅰ中，于弱光条件下培养；
(3)生根诱导：将步骤(2)生根预处理后的材料，放置在光照条件下培养；
(4)根系伸长：在步骤(3)完成后，将继代芽转入培养基Ⅱ中，于光照条件下培养，获得马尾松生根苗。
本发明以优选的成年高产脂马尾松为研究对象，通过茎芽离体培养获取继代芽作为生根材料，根据高产脂马尾松生根过程中关键二萜烯组分的代谢途径及作用机理，进行生根培养基、培养条件、培养方法的调整与优化，从而解决高产脂马尾松优树生根困难的问题。利用本发明技术方案，优选成年高产脂马尾松继代芽生根率达90％以上，根数5～8条，移栽成活率达98％以上，出圃时间为4～6个月，以满足规模化生产的需求。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，步骤(1)中，所述嫁接为本砧嫁接，所述继代增殖培养的时间为1.5～2年。
本发明所述的马尾松继代芽顶叶呈针簇状，叶片颜色为浅绿色，针叶细长，无双针叶，叶节间疏。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，步骤(2)中，所述弱光条件下培养的温度为8～14℃，所述弱光条件下培养的光照强度为0～5μmol·m-2·s-1，所述弱光条件下培养的时间为5～7d。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述培养基Ⅰ的原料组成包括缩节胺、多效唑、α-萘乙酸、亚硒酸钠、还原型谷胱甘肽、海藻糖、蔗糖和改良MS培养基。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述培养基Ⅰ的各原料含量为：缩节胺(DPC)15μmol·L-1、多效唑(PAC)3μmol·L-1、α-萘乙酸(NAA)2.5μmol·L-1、亚硒酸钠(Na2SeO3)20～30mg·L-1、还原型谷胱甘肽(GSH)25mg·L-1、海藻糖3g·L-1、蔗糖10g·L-1和1/2改良MS培养基。
本发明提供的提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，针对成年高产脂马尾松萜烯物质代谢旺盛、繁殖材料生理老化等特性，根据马尾松生根过程中关键二萜烯物质的合成代谢途径，利用缩节胺、多效唑及活性赤霉素进行不同生根阶段萜烯组分的生物合成调控，实现了高产脂马尾松生根能力的改善。首次根据马尾松生根过程中关键二萜烯物质的作用机制，联合使用亚硒酸钠、还原型谷胱甘肽、海藻糖作为自由基清除剂和膜系统稳定剂，显著提升了高产脂马尾松生根稳定性。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，步骤(3)中，所述光照条件下培养的温度为20℃，所述光照条件下培养的光照强度为10～20μmol·m-2·s-1，所述光照条件下培养的时间为10d。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，步骤(4)中，所述光照条件下培养的温度为26℃；所述培养基Ⅱ的原料组成包括GA1(赤霉素)、GA3(赤霉素)、GA4(赤霉素)、吲哚乙酸、吲哚丁酸、抗坏血酸、维生素、蔗糖和改良MS培养基。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述培养基Ⅱ各原料含量为：GA112μmol·L-1、GA3 10μmol·L-1、GA4 8μmol·L-1、吲哚乙酸(IAA)8-12μmol·L-1、吲哚丁酸(IBA)5-15μmol·L-1、抗坏血酸(AA)1mg·L-1、维生素E(VE)4mg·L-1、蔗糖25-30g·L-1和1/2改良MS培养基。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述改良MS培养基的原料组成包括KNO3、NH4Cl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、K2SO4、NaH2PO4·2H2、FeSO4·7H2O、Na2EDTA、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O、KI、CoCl2·6H2O、维生素B1、维生素B6、烟酸和肌醇。
作为本发明所述的方法的优选实施方式，所述MS培养基的各原料含量为：KNO3909.90mg·L-1、NH4Cl 53.49mg·L-1、CaCl2·2H2O 73.51mg·L-1、MgSO4·7H2O 123.24mg·L-1、K2SO4 130.68mg·L-1、NaH2PO4·2H2O 234.02mg·L-1、FeSO4·7H2O 15mg·L-1、Na2EDTA20mg·L-1、MnSO4·H2O 30mg·L-1、ZnSO4·7H2O 2mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.2mg·L-1、H3BO310mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.2mg·L-1、KI 0.5mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.13mg·L-1、维生素B11.0mg·L-1、维生素B6 0.5mg·L-1、烟酸0.5mg·L-1、肌醇500mg·L-1。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供的提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法以成年高产脂马尾松优树为研究对象，从无菌离体生根的角度，从生根培养基、培养方法、培养条件进行了系统的调整与优化，完成了高产脂马尾松从优选→繁殖→利用的全部过程。
(2)针对成年高产脂马尾松萜烯物质代谢旺盛、繁殖材料生理老化等特性，根据马尾松生根过程中关键二萜烯物质的合成代谢途径，本发明提供的提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，利用缩节胺、多效唑及活性赤霉素进行不同生根阶段萜烯组分的生物合成调控，实现了高产脂马尾松生根能力的改善。
(3)本发明提供的提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，首次根据马尾松生根过程中关键二萜烯物质的作用机制，联合使用亚硒酸钠、还原型谷胱甘肽、海藻糖作为自由基清除剂和膜系统稳定剂，显著提升了高产脂马尾松生根的稳定性。
附图说明
图1为本发明所述的高产脂马尾松成年优株与相同遗传基础来源的种子作为初始材料，获得继代芽生根能力比较结果图；
图2为在连续继代中马尾松高产脂成年优株继代芽的生根能力变化结果图；
图3为利用本发明提供的提供的提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法进行生根诱导的健壮马尾松继代芽结果图；
图4为本发明所述的高产脂马尾松优株继代芽生根预处理培养条件正交设计效应曲线图；
图5为本发明所述的高产脂马尾松优株继代芽不定根诱导培养条件正交设计效应曲线图；
图6为本发明所述的高产脂马尾松优株继代芽生根培养条件正交设计效应曲线图；
图7为本发明所述的高产脂马尾松优株继代芽生根诱导生根剂正交设计效应曲线图；
图8为本发明所述的高产脂马尾松优株继代芽根系表达生根剂正交设计效应曲线图；
图9为利用本发明提供的提供的提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法对马尾松继代芽生根诱导的结果图；
图10应用本发明提供的提供的提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，培养的待出圃马尾松组培苗图；
图11应用本发明提供的提供的提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，规模化培育的马尾松组培苗；
图12应用本发明提供的提供的提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，在广西派阳山林场营建的马尾松无性试验林。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
桐棉松是马尾松国家优良地理种源，是马尾松育种骨干资源，属广西的地方特色优势品种。在优选种质资源的基础上，通过无性快繁技术实现种苗良种化，是解决当前马尾松人工林遗传分化差异大、林分生产力整体水平不高、产业发展缓慢的有效途径。
本发明的实施例均以优选的25～30年生广西桐棉松优良林分中高产脂优株GLM-28、GLM-56、GLM-120为研究对象。
实施例1
本实施例为马尾松继代芽培养筛选
本实施例按照本发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法中的步骤(1)进行继代芽的培养：采集当年新梢的成年马尾松高产脂优株，进行本砧嫁接，对嫁接苗进行截顶促萌处理，然后以幼化萌芽条为外植体按照常规方法进行无菌接种、初始芽诱导和继代增殖培养1.5～2年，获得马尾松继代芽。然后将获得马尾松继代单芽进行生根诱导培养，以相同遗传基础来源的种子作为初始材料获取的继代芽作为参照，利用常规方法进行继代1～5次继代芽的不定根诱导。马尾松继代芽培养筛选的结果如图1和图2所示。
马尾松继代芽培养筛选结果：根据图1可知，种子来源继代芽生根能力维持在90％以上，其中继代5次时生根率达99.8％。3个高产脂优株(高产脂优株GLM-28、GLM-56、GLM-120)继代芽在继代5次时，生根率仅为21.3％～42.1％，但与继代1～2次时的生根率为0相比，继代5次时生根率显著提升，这说明了繁殖材料越幼化，马尾松生根能力越强。
连续继代能幼化繁殖材料，但过多继代会导致繁殖材料生根能力下降。由图2可知，3个优株(高产脂优株GLM-28、GLM-56、GLM-120)继代芽均表现为继代15～20次(约1.5～2年)后，继代芽生根率最高，在继代30次时生根率显著下降，约为3.5％～14.5％。由此说明了以继代1.5～2年、继代周期35～40d的继代芽是本发明提供的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法中，推荐的最佳生根材料。
实施例2
本实施例为马尾松芽苗生长的基本培养基(MS培养基)的筛选
实验方法：整体上，从高产脂马尾松继代芽苗生长形态来看，黄褐化严重、根茎愈伤化程度明显、叶茎颜色为深绿，茎节间短，芽苗生理活性差。根据高产脂马尾松芽苗的生长形态特征，本发明对现在技术中的基本培养基(MS培养基)进行了调整(见表1)，其中，本发明的MS培养基为改良组，现有技术的MS培养基为对照组。
表1培养高产脂马尾松的基本培养基的组成成分
表1中，改良组和对照组相比，N元素尤其是铵态氮用量明显减少，避免马尾松芽苗徒长而引起的水渍黄褐化问题；Ca元素量的减少，减轻马尾松继代芽在生根培养中的老化程度；Mg元素量的降低，减弱马尾松生根时根茎基部愈伤化程度，提高根系质量。利用本实施例调整后的基本培养基(MS培养基)对高产脂马尾松进行培养，其结果如图3所示，图3显示本发明调整后的MS培养基，培养高产脂马尾松，其芽苗生长健壮，可用于高产脂马尾松成年优株继代芽的生根培养。
实施例3
本实施例为本发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法中的马尾松生根预处理。
本实施例按照本发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法中的步骤(2)生根预处理：无菌条件下，截取步骤(1)所述的马尾松继代芽的顶芽转入培养基Ⅰ中，于弱光条件下培养。即：以实施例1获得的继代1.5～2年的马尾松高产脂优株GLM-28、GLM-56、GLM-120继代芽为生根材料，接种在1/2改良MS(表1中培养高产脂马尾松MS培养基)+1.0mg/L IAA+0.5mg/L IBA+20g/L蔗糖培养基中，对温度(2～26℃)、光照强度(0～20μmol/m2s)、天数(1～9d)等生根预处理方法进行筛选，生根预处理培养条件因素水平表如表2。
高产脂马尾松优株继代芽生根预处理培养条件的筛选进行25种实验条件的设置，其极差分析如表3所示，其正交设计效应曲线如图4所示。
表2生根预处理培养条件因素水平表
表3高产脂马尾松优株继代芽生根预处理培养条件极差分析
注：表3中kij，i＝1,2,3，分别代表GLM-28、GLM-56和GLM-120三个基因型；j＝1,2,3,4,5，代表5个水平，kij表示各对应列因素第i个基因型第j水平指标值(愈合率)之和的平均值；Ri，i＝1,2,3，i代表意义同上，Ri值为对应列中kij的各个平均值中的最大值减去最小值之差，即极差。
由表3正交设计极差分析结果可知，温度对高产脂马尾松优株继代芽生根预处理的继代芽茎基部愈合率影响最大，其次是光强与处理天数。
由图4的高产脂马尾松优株继代芽生根预处理培养条件正交设计效应曲线测定表明，高产脂马尾松优株继代芽生根预处理各因素相对应的适应条件为：预处理温度8～14℃、光照强度0～5μmol/m2s、处理天数5～7d。
实施例4
本实施例为本发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法中的马尾松生根诱导。
本实施例按照本发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法中的步骤(3)生根诱导：以愈合良好的GLM-28、GLM-56、GLM-120继代芽，在不同温度(2～26℃)、光照强度(0～20μmol/m2s)的培养条件下，处理5～25d，观察不定根诱导率的变化，生根诱导培养条件因素水平表如表4所示。
高产脂马尾松优株继代芽不定根诱导培养条件的筛选进行25种实验条件的设置，其极差分析如表5所示，其正交设计效应曲线如图5所示。
表4生根诱导培养条件因素水平表
表5高产脂马尾松优株继代芽不定根诱导培养条件正交设计极差分析
注：表5中kij，i＝1,2,3，分别代表GLM-28、GLM-56和GLM-120三个基因型；j＝1,2,3,4,5，代表5个水平，kij表示各对应列因素第i个基因型第j水平指标值(诱导率)之和的平均值；Ri，i＝1,2,3，i代表意义同上，Ri值为对应列中kij的各个平均值中的最大值减去最小值之差，即极差。
由表5正交设计极差分析结果表明，温度对高产脂马尾松优株继代芽不定根诱导率的影响仍然最大，光照强度与处理天数次之。
由图5的高产脂马尾松优株继代芽不定根诱导培养条件正交设计效应曲线可以看出，高产脂马尾松优株继代芽不定根诱导培养，各因素相对应的最适处理条件为：温度20℃、光照强度10～20μmol/m2s，培养天数10d。
实施例5
本实施例为本发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法中的马尾松根系伸长条件筛选。
本实施例按照本发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法中的步骤(4)根系伸长：将实施例4中的具有肉眼可见不定根(根长≧1mm)的继代芽转入1/2改良MS培养基(本申请培养基组分)+10mg/L抗坏血酸(AA)+20g/L蔗糖的培养基中，在不同温度(2～26℃)、光照强度(10～50μmol/m2s)的培养条件下，处理5～25d，促进不定根的形成，生根培养条件因素水平表如表6所示。
高产脂马尾松优株继代芽生根培养条件的筛选进行25种实验条件的设置，其极差分析如表7所示，其正交设计效应曲线如图6所示。
表6生根培养条件因素水平表
表7高产脂马尾松优株继代芽生根培养条件正交设计极差分析
注：表7中kij，i＝1,2,3，分别代表GLM-28、GLM-56和GLM-120三个基因型；j＝1,2,3,4,5，代表5个水平，kij表示各对应列因素第i个基因型第j水平指标值(生根率)之和的平均值；Ri，i＝1,2,3，i代表意义同上，Ri值为对应列中kij的各个平均值中的最大值减去最小值之差，即极差。
将不定根长度≧3mm以上芽苗计为生根苗。由表7可知，温度对高产脂马尾松优株继代芽不定根表达与形成的影响显著最高，约为60％～70％，其次为处理天数10％～24％，最后是光照强度9％～18％，仍然最大，光照强度与处理天数次之。
由图6的高产脂马尾松优株继代芽生根培养条件正交设计效应曲线图可以看出，最适的不定根形成的培养条件为：温度26℃，光照强度40μmol/m2s，培养时间10d。
实施例6
本实施例为本发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法中生根剂的筛选
实验方法：在生根材料、基本培养基与培养条件优选的基础上，整体上看高产脂马尾松继代芽生根率仍然偏低、根条数较少，根系质量差，生根效果不稳定，不能满足于生产上的需要。为进一步提升生根效果稳定性，针对高产脂马尾松继代芽生根过程中内源激素的变化与芽苗生理活性较差的特点，重点开展了生根激素[α-萘乙酸(NAA)、缩节胺(DPC)、多效唑(PAC)]、膜系统稳定剂[亚硒酸钠、还原型谷胱甘肽(GSH)、海藻糖]与碳源(蔗糖)联合处理的高产脂马尾松继代芽生根诱导试验，高产脂马尾松继代芽生根诱导生根剂因素水平表如表8。
将继代培养1.5～2年高产脂马尾松继代芽，接种到1～3μmol/L NAA+0～20μmol/LDPC+0～4μmol/L PAC+0～40mg/L亚硒酸钠+0～45mg/L GSH+0～7g/L海藻糖+5～25g/L蔗糖+1/2改良MS培养基(本发明所述的基本培养基)中，在8～14℃、0～5μmol/m2s弱光条件下培养5～7d，然后置于20℃、光照强度10～20μmol/m2s条件下培养10d，最后转入1/2改良MS培养基(同上)+10mg/L AA+20g/L蔗糖的培养基中，在26℃、光照强度40μmol/m2s条件下培养10d，促进根系表达。
高产脂马尾松优株继代芽生根诱导生根剂的筛选，设置了50个实验，其正交设计极差分析如表9所示，其正交设计效应曲线图如图7所示。
表8高产脂马尾松继代芽生根诱导生根剂因素水平表
表9高产脂马尾松优株继代芽生根诱导生根剂正交设计极差分析
注：表9中kij，i＝1,2,3，分别代表GLM-28、GLM-56和GLM-120三个基因型；j＝1,2,3,4,5，代表5个水平，kij表示各对应列因素第i个基因型第j水平指标值(生根率)之和的平均值；Ri，i＝1,2,3，i代表意义同上，Ri值为对应列中kij的各个平均值中的最大值减去最小值之差，即极差。表9中，NAA、DPC和PAC对应的单位为μmol/L，亚硒酸钠的单位为mg/L、GSH的单位mg/L、海藻糖的单位g/L，蔗糖的单位为g/L。GLM-28生根率、GLM-56生根率和GLM-120生根率单位为％。
由表9分析结果可知，DPC、PAC对高产脂马尾松继代芽生根率影响最为显著，其次是GSH，然后是NAA，最后是亚硒酸钠、海藻糖和蔗糖。
由图7高产脂马尾松优株继代芽生根诱导生根剂正交设计效应曲线对应的最适处理浓度为：DPC 15μmol/L、PAC 3μmol/L、NAA 2.5μmol/L、亚硒酸钠20～30mg/L、GSH 25mg/L、海藻糖3g/L、蔗糖10g/L。
实施例7
本实施例为本发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法中生根剂的筛选
实验方法：经过生根剂配方优选，以根长≧3mm的继代芽作为生根苗进行统计的生根率，较优选之前有了大幅提升，但整体上根条数约为1～3条，根系质量不高，在后期移栽和造林中，成活率不理想，蹲苗期长，早期生长缓慢。鉴于此，为进一步提高苗木根系质量，提升育苗效率，通过在培养基中添加促根激素[赤霉素(GAs)、吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)]、抗氧化剂[AA、维生素E(VE)]与碳源(蔗糖)的方法，促进生根苗根系伸长与表达。
以上述优选培养材料、生根剂和生根培养条件下获得的高产脂马尾松生根苗，转入0～18μmo/L GA1、0～15μmo/LGA3、0～12μmo/L GA4、0～12μmo/L IAA、0～15μmo/L IBA、1～7mg/L AA、0～6mg/L VE、25～40g/L蔗糖和1/2改良MS培养基(同上)中，在26℃、光照强度40μmol/m2s条件下培养10d，然后统计根长≧5mm的根条数，高产脂马尾松优株继代芽根系表达生根剂因素水平素如表10所示。
高产脂马尾松优株继代芽根系表达生根剂的筛选，设置了32个实验，其正交设计极差分析如表11所示，其正交设计效应曲线图如图8所示。
表10高产脂马尾松优株继代芽根系表达生根剂因素水平素
表11高产脂马尾松优株继代芽根系表达生根剂正交设计极差分析
注：表10中kij，i＝1,2,3，分别代表GLM-28、GLM-56和GLM-120三个基因型；j＝1,2,3,4，代表4个水平，kij表示各对应列因素第i个基因型第j水平指标值(根条数)之和的平均值；Ri，i＝1,2,3,i代表意义同上，Ri值为对应列中kij的各个平均值中的最大值减去最小值之差，即极差。
从表11中极差分析结果可知，GA1对高产脂马尾松继代芽根系表达的影响最为明显，显著高于其它因素，从供测3种基因型的高产脂马尾松继代芽根条数来看，GA1和GA4均是影响其根系表达最为重要的影响因素，而其它因素影响因基因型而异。按因素影响大小排序，GLM-28为：GA1>GA4>VE>GA3>IAA>IBA>蔗糖>AA；GLM-56为：GA1>GA4>VE≈蔗糖>GA3>AA>IAA>IBA；GLM-120为：GA1>GA4>GA3>VE>IAA>蔗糖>IBA>IAA。这说明，材料不同，促进高产脂马尾松继代芽根系表达的生根剂配方也不同，需要根据生根情况进行调整。
由图8可知，整体上最适的促进高产脂马尾松继代芽根系伸长与表达的生根条件为：GA1 12μmol/L、GA3 10μmol/L、GA4 8μmol/L、IAA 8～12μmol/L、IBA 5～15μmol/L、AA1mg/L、VE 4mg/L、蔗糖25～30g/L。
实施例8
经过对培养材料、培养方法与生根剂配方等全面、系统地优选，利用本发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，对马尾松进行继代芽生根培养，获得了根系质量好、生根效果稳定的高产脂马尾松优株生根苗，如图9所示。发明所述的一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法已成功地运用到了生产中，实现了规模化的高产脂马尾松优质壮苗的无性繁育与利用，如图10～12所示，推广应用潜力巨大，生态、经济与社会效益显著。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (2)
1.一种提升高产脂马尾松优树继代芽生根稳定性的方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）继代芽的培养：采集成年马尾松高产脂优株的当年新梢进行嫁接，对嫁接苗进行截顶促萌处理，然后以幼化萌芽条为外植体进行无菌接种、初始芽诱导和继代增殖培养，获得马尾松继代芽，所述继代增殖培养的时间为1.5~2年；
（2）生根预处理：无菌条件下，截取步骤（1）所述的马尾松继代芽的顶芽转入培养基Ⅰ中，于弱光条件下培养，所述弱光条件下培养的温度为8~14℃，所述弱光条件下培养的光照强度为0~5 μmol·m-2·s-1，所述弱光条件下培养的时间为5~7d；所述培养基Ⅰ的原料组成包括缩节胺、多效唑、α-萘乙酸、亚硒酸钠、还原型谷胱甘肽、海藻糖、蔗糖和改良MS培养基；
（3）生根诱导：将步骤（2）生根预处理后的材料，放置在光照条件下培养，所述光照条件下培养的温度为20℃，所述光照条件下培养的光照强度为10~20 μmol·m-2·s-1，所述光照条件下培养的时间为10d；
（4）根系伸长：在步骤（3）完成后，将继代芽转入培养基Ⅱ中，于光照条件下培养，获得马尾松生根苗，所述光照条件下培养的温度为26℃，所述光照条件下培养的光照强度为40μmol·m-2·s-1，所述光照条件下培养的时间为10d，所述培养基Ⅱ的原料组成包括GA1、GA3、GA4、吲哚乙酸、吲哚丁酸、抗坏血酸、维生素、蔗糖和改良MS培养基；
所述改良MS培养基的原料组成包括KNO3、NH4Cl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、K2SO4、NaH2PO4·2H2O、FeSO4·7H2O、Na2EDTA、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O、KI、CoCl2·6H2O、维生素B1、维生素B6、烟酸和肌醇，所述改良MS培养基的各原料含量为：KNO3 909.90 mg·L-1、NH4Cl 53.49 mg·L-1、CaCl2·2H2O 73.51 mg·L-1、MgSO4·7H2O 123.24 mg·L-1、K2SO4 130.68 mg·L-1、NaH2PO4·2H2O 234.02 mg·L-1、FeSO4·7H2O 15 mg·L-1、Na2EDTA 20 mg·L-1、MnSO4·H2O 30 mg·L-1、ZnSO4·7H2O 2mg·L-1、CuSO4·5H2O 0.2 mg·L-1、H3BO3 10 mg·L-1、Na2MoO4·2H2O 0.2 mg·L-1、KI 0.5mg·L-1、CoCl2·6H2O 0.13 mg·L-1、维生素B1 1.0 mg·L-1、维生素B6 0.5 mg·L-1、烟酸0.5 mg·L-1、肌醇500 mg·L-1；
所述培养基Ⅰ的各原料含量为：缩节胺15 µmol·L-1、多效唑3 µmol·L-1、α-萘乙酸2.5µmol·L-1、亚硒酸钠20~30 mg·L-1、还原型谷胱甘肽25 mg·L-1、海藻糖3 g·L-1、蔗糖10g·L-1和1/2改良MS培养基；1/2改良MS培养基原料组成包括KNO3、NH4Cl、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、K2SO4、NaH2PO4·2H2O、FeSO4·7H2O、Na2EDTA、MnSO4·H2O、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、H3BO3、Na2MoO4·2H2O、KI、CoCl2·6H2O、维生素B1、维生素B6、烟酸和肌醇，1/2改良MS培养基的各原料含量为所述改良MS培养基的二分之一；
所述培养基Ⅱ各原料含量为：GA1 12 µmol·L-1、GA3 10 µmol·L-1、GA4 8 µmol·L-1、吲哚乙酸8~12 µmol·L-1、吲哚丁酸5~15 µmol·L-1、抗坏血酸1 mg·L-1、维生素E 4 mg·L-1、蔗糖25~30 g·L-1和1/2改良MS培养基。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述嫁接为本砧嫁接。
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