CN111607609A

CN111607609A - 调控水稻种子粒型的hdt701及其应用

Info

Publication number: CN111607609A
Application number: CN201910141057.6A
Authority: CN
Inventors: 薛红卫; 姚娜
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2019-02-26
Filing date: 2019-02-26
Publication date: 2020-09-01
Anticipated expiration: 2039-02-26
Also published as: CN111607609B

Abstract

本发明涉及调控水稻种子粒型的HDT701及其应用。本发明揭示了HDT701基因可以调节水稻的粒型或产量性状，可以将HDT701基因单独或与其它基因联合应用于水稻的分子培育中，选育出具有特定株型的植物品种。

Description

调控水稻种子粒型的HDT701及其应用

技术领域

本发明属于植物学和基因工程领域，更具体地，本发明涉及调控水稻种子粒型的HDT701及其应用。

背景技术

禾本科植物(作物)，尤其是水稻，为重要的粮食作物。水稻等作物的株型是决定其产量的核心因素之一。水稻株型的形成主要取决于植株高度、叶倾角以及分蘖角度等因素。在水稻育种中，株型的改良对水稻产量的提高发挥了重要作用，并一直是品种选育的重要指标。

水稻株型、粒型改良对提高水稻单产具有重要的作用。迄今为止水稻株型改良主要经历过半矮化育种及理想株型育种两个阶段。1968年澳大利亚Donald首次提出“作物理想株型”概念，指出所谓作物理想株型就是在现有生理学和形态学知识基础之上，将一系列有利于作物光合，生长及产量的优良形态性状聚合而形成的理想植株。日本学者提出了水稻“理想株型”的理论和一些具体株型指标，并由此发展为基于优良植株形态选种而不是仅仅基于产量选种的水稻理想株型育种。中国学者提出并完善了理想株型与杂种优势利用相结合的水稻超高产育种理论，并培育出了一系列高产优质的水稻品种。

近些年来，随着水稻功能基因组学的发展，科学家们相继克隆鉴定了一些控制水稻株型的重要基因，为应用于水稻超高产育种奠定了坚实的理论基础。现有技术中，已经发现一些调控水稻株高，分蘖，叶倾角的基因，比如但不限于LC1，SLR1，MOC1。

尽管已经发现了一些对于调控水稻株型、粒型有用的基因，但是本领域仍然需要进行进一步的探索，以进一步促进水稻的改良，或者通过多基因联合调控的方式来实现调控和改良。

发明内容

本发明的目的在于提供调控水稻种子粒型的HDT701及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种调节水稻性状的方法，包括调节水稻中HDT701的表达。

在另一优选例中，所述方法包括：下调HDT701的表达，从而：增加种子粒长，降低种子粒宽，减少分蘖数，增加每穗粒数，延迟抽穗和开花时间。

在另一优选例中，所述下调HDT701的表达包括：在植物中敲除或沉默HDT701基因，或抑制HDT701蛋白的活性；较佳地，包括：以特异性干扰HDT701基因表达的干扰分子来沉默HDT701，以基因编辑方法敲除HDT701基因，以同源重组方法敲除HDT701基因，或以反义的HDT701蛋白的编码基因下调HDT701的表达。

在另一优选例中，所述的干扰分子是以HDT701的编码基因或其转录本为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，或能表达或形成所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。

在另一优选例中，通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除HDT701的编码基因；较佳地，以sgRNA进行基因编辑，更佳地其靶向于hdt701序列的第二外显子(如CDS序列31-50/894bp)或其序列包括：SEQ ID NO:1。

在另一优选例中，通过RNAi的方法沉默HDT701基因；较佳地，所述RNAi的序列包括：SEQ ID NO:6所示的序列。

在另一优选例中，所述方法包括：上调HDT701的表达，从而增加种子粒长，降低种子粒宽，促进开花时间提前，降低种子萌发时根伸出的时间，促进旗叶和剑叶披垂。

在另一优选例中，所述上调HDT701的表达包括：将过量表达所述HDT701的过量表达分子(如表达构建物或表达载体)转入植物细胞、组织、器官或种子，从而上调HDT701的表达。

在另一优选例中，所述的HDT701选自下组：(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白；(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个(如1-20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个，如5个，3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上(较佳地85％以上；更佳地90％以上；更佳95％以上，如98％，99％)同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

在本发明的另一方面，提供一种HDT701蛋白或其编码基因或它们的上调剂的用途，用于调节水稻的性状，主要包括：增加种子粒长，降低种子粒宽，促进开花时间提前，降低种子萌发时根伸出的时间，促进旗叶和剑叶披垂。

在一个优选例中，所述的上调剂包括：过量表达所述HDT701的过量表达分子。

在本发明的另一方面，提供一种HDT701蛋白或其编码基因的下调剂的用途，用于调节水稻的性状，包括：增加种子粒长，降低种子粒宽，减少分蘖数，增加每穗粒数，延迟抽穗和开花时间。

在一个优选例中，所述下调剂包括：敲除或沉默HDT701基因或抑制HDT701蛋白活性的下调剂；较佳地，包括：特异性干扰HDT701基因表达的干扰分子，敲除HDT701基因的基因编辑试剂，基于同源重组的敲除HDT701基因的试剂。

在本发明的另一方面，提供一种HDT701蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴别水稻性状的分子标记，所述性状包括：粒长、粒宽、分蘖数、每穗粒数、抽穗时间、开花时间、种子萌发时根伸出时间、旗叶和剑叶披垂性。

在本发明的另一方面，提供一种sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸，所述的sgRNA靶向于HDT701基因，其靶向于hdt701序列的第二外显子(如CDS序列31-50/894bp)或其序列包括：SEQ ID NO:1。

在本发明的另一方面，提供一种RNAi试剂，所述的RNAi试剂靶向于HDT701基因，其序列包括：SEQ ID NO:6。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1、CRISPR-cas9载体系统。

图2、Ubi::RNAi-HDT701中间载体pMD 18-T。

图3、Pro_HDT701::HDT701^DNA骨架载体pCAMBIA 1301。

图4、CRIPSR-cas9敲除LOC_Os05g51830粒型改变。

A和B.ZH11和敲除材料的粒型，包括带颖壳的种子、糙米及精米。Bar分别为3.9mm和2.5mm。

C.HDT701的蛋白结构及CRIPSR-cas9对LOC_Os05g51830几种敲除方式。

图5、F2代水稻粒型。

A.F2代粒长，由上至下分别为ZH11、杂合体和纯合体所结种子。

B.F2代粒宽，由上至下分别为ZH11、杂合体和纯合体所结种子。Bar＝1cm。

C.对粒型数量的统计结果。

图6、RNAi材料粒型统计。

A.RNAi材料中载体插入检测，包括潮霉素和hdt701片段检测。

B.RNAi材料HDT701表达水平检测。

C.RNAi材料粒型。Bar＝1cm。

图7、Pro_HDT701::HDT701^DNA可回复突变体表型。

A.Pro_HDT701::HDT701^DNA回复突变体表型。Bar＝0.5cm。

B.突变体背景基因组检测。

C.Pro_HDT701::HDT701^DNA转化突变体载体检测。

D.Pro_HDT701::HDT701^DNA转化突变体中HDT701蛋白检测。

E.回复材料HDT701表达水平检测。

F～H.对回复材料的粒型统计。

图8、ZH11和hdt701农艺性状统计。

A.ZH11和hdt701株型。Bar＝7.6cm。

B.ZH11和hdt701穗型。Bar＝3cm。

C.ZH11和hdt701颖花和糙米粒型。Bar＝1cm。

D.水稻株高，P value＝0.053。

E.分蘖数，P value＝0.024。

F.穗长，P value＝0.497。

G.一级枝梗数，P value＝1.21×10-4。

H.二级枝梗数，P value＝0.241。

I.粒长，P value＝6.86×10-19。

J.粒宽，P value＝2.21×10-12。

K.长宽比，P value＝2.02×10-25。

L.每穗粒数，P value＝0.021。

M.结实率，P value＝0.018。

N.每穗实粒数，P value＝0.101。

O.千粒重，P value＝3.15×10-5。

P.单株产量，P value＝0.119。

图9、过表达材料种子粒型。

A.9个不同的过表达株系的粒型观察，其中line4、7、19、20、24和30种子明显变长变窄。Bar＝1cm。

B.对过表达株系HDT701表达水平检测。

图10、日本晴中HDT701对种子的粒型影响与ZH11相同。

A.日本晴中敲除HDT701，种子明显变长变窄。Bar＝0.5cm。

B.日本晴中降低HDT701表达水平，种子变长变窄。Bar＝0.5cm。

C.CRISPR-cas9对日本晴HDT701的五个株系的敲除方式。

D.日本晴中HDT701表达水平检测。

图11、HDT701影响水稻开花、叶披垂和种子萌发时根的伸长。

A.hdt701抽穗和开花时间延迟，而过表达株系开花时间则提前。Bar＝6cm。

B.hdt701旗叶披垂严重。Bar＝2.5cm。

C.hdt701种子萌发时根伸出较野生型慢。Bar＝8cm。

具体实施方式

本发明人经过深入的研究，发现HDT701基因可以调节水稻的粒型或产量性状。因此，可以将HDT701基因单独或与其它基因联合应用于水稻的分子培育中，选育出具有特定株型的植物品种。

如本文所用，所述的“植物”包括：水稻。

如本文所用，所述的“目标基因”是指植物基因组中需要进行敲除操作的感兴趣的基因，本发明中为HDT701基因。

如本文所用，所述的目标基因上的“靶序列”是指“目标基因”中的一个片段。例如，基于该目标基因上的“靶序列”设计的sgRNA可识别该“靶序列”，由此在该位置发生Cas9编码的蛋白的切割。所述的目标基因上的“靶位点”的长度通常为18-26个核苷酸。

如本文所用，所述的“sgRNA”即“单独导向RNA(Single-guide RNA，sgRNA)”或“单导向RNA”，其是基于“目标基因上的靶位点”设计，其包含的序列足以与内切核酸酶Cas9协同作用，引导发生Cas9介导的靶位点上DNA双链断裂。

如本文所用，所述的“同源物”包括HDT701在多个物种中的同源多肽(蛋白)或基因。

本发明所述的HDT701蛋白还包括HDT701蛋白的片段、衍生物、同源物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的HDT701蛋白相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白等。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种HDT701蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，HDT701蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白，其仍然能保持全长的HDT701蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长HDT701蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长HDT701蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“HDT701蛋白”指具有HDT701蛋白活性的SEQ ID NO:2序列的蛋白。该术语还包括具有与HDT701蛋白相同功能的、SEQ ID NO:2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括HDT701蛋白的活性片段和活性衍生物。

编码HDT701蛋白或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到本发明中。编码成熟HDT701蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO:1所示的序列基本上相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:2的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

术语“编码基因”可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

上述多核苷酸的变异体也是可用的，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。

应理解，虽然本发明的HDT701基因优选获自水稻，但是获自其它植物的与水稻HDT701基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因(如HDT701同源物)也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的HDT701蛋白的编码序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列。

包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或HDT701蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含HDT701蛋白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。包含上述的适当编码序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言性状发生改变的植物。

本发明提供了所述的HDT701蛋白或其编码基因的用途，用于调节(包括：上调或下调)水稻粒型或产量性状。在一种方式下，过表达正义HDT701蛋白可以：增加种子粒长，降低种子粒宽，促进开花时间提前，降低种子萌发时根伸出的时间，促进旗叶和剑叶披垂。在另一种方式下，敲除HDT701基因或沉默(如采用基因干扰的方法)HDT701基因(或基因片段)后可以：增加种子粒长，降低种子粒宽，减少分蘖数，增加每穗粒数，延迟抽穗和开花时间。因此，可基于HDT701蛋白对于植物性状的影响作用来改变植物，从而达到根据实际生产需要改良植物品质的目的。较佳地，所述的植物是水稻。

本发明还涉及HDT701蛋白或其编码基因的上调剂或下调剂(如基因敲除试剂，又如RNAi试剂，反义的HDT701基因，又如miRNA、shRNA)及其用途。由于HDT701的上调剂或下调剂可调节HDT701的表达和/或调节HDT701的活性等，因此，所述的HDT701的上调剂或下调剂也可通过对

HDT701的影响来调节植物性状，从而达到改良植物的目的。

任何可调节HDT701蛋白的活性、调节HDT701蛋白的稳定性、促进或抑制HDT701蛋白的表达、延长或减少HDT701蛋白有效作用时间、或促进或降低HDT701基因的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于调节水稻粒型或产量的有效物质。

本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中HDT701蛋白的表达。

一方面，本发明提供了一种增加种子粒长，降低种子粒宽，促进开花时间提前，降低种子萌发时根伸出的时间，促进旗叶和剑叶披垂的方法，所述的方法包括：使所述植物过量表达HDT701蛋白。

在得知了所述的HDT701蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调节所述的HDT701蛋白的表达。比如可通过一定的途径将携带HDT701编码基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的HDT701蛋白。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低HDT701蛋白的表达或使之缺失表达，比例利用基因编辑技术来敲除HDT701基因，又比如将携带反义HDT701基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达HDT701蛋白。

作为本发明的一种实施方式，将HDT701蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适当的载体中，将带有外源基因的重组载体导入到可表达所述HDT701蛋白的植物细胞中，使所述的植物细胞表达HDT701蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达HDT701蛋白的植物。优选的，利用农杆菌转化法将HDT701蛋白的编码基因转入植物中。

可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。其它增加HDT701表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强HDT701的表达。或者通过增强子来增强该HDT701基因的表达。

另一方面，本发明还提供了一种增加种子粒长，降低种子粒宽，减少分蘖数，增加每穗粒数，延迟抽穗和开花时间的方法，所述的方法包括：降低所述植物中HDT701蛋白的表达(包括使HDT701蛋白不表达或低表达)。

作为本发明的优选方式，通过敲除HDT701基因，从而下调植物中HDT701基因的表达。较佳地，采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除HDT701基因。

合适的sgRNA靶位点，会带来更高的基因编辑效率，所以在着手进行基因编辑前，设计并找到合适的靶位点较为重要。在设计特异性靶位点后，还需要进行体外细胞活性筛选，以获得有效的靶位点用于后续实验。

作为本发明的优选方式，敲除HDT701基因的方法包括：将sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸、Cas9mRNA或能形成所述Cas9mRNA的核酸共转入植物细胞中；获得转基因植物。

在确定了靶位点之后，可以采用已知的方法来使得sgRNA及Cas9被引入到细胞内。本发明的实施例中提供了一种较佳的sgRNA。

作为一种选择，所述的能形成所述sgRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，或所述的能形成所述Cas9mRNA的核酸为核酸构建体或表达载体，将这些表达载体导入到细胞内，从而在细胞内形成有活性的sgRNA及Cas9mRNA。此外，可以体外转录获得携带有启动子的Cas9mRNA以及携带有启动子的sgRNA。上述的方法可用于制备基因敲除植物，其中目标基因HDT701的基因功能消失。

其它的下调HDT701基因的方法也是可用的，优选地，包括：(1)将干扰HDT701表达的干扰分子或反义分子转入植物组织、器官或种子，获得转化入所述干扰分子或翻译分子的植物组织、器官或种子；和(2)将步骤(1)获得的转入了所述干扰分子或反义分子的植物组织、器官或种子再生成植物。本发明的实施例中提供了一种较佳的RNAi试剂。

另一种下调HDT701的方法是：使HDT701的编码基因完全缺失或缺失关键结构域的编码序列，或在HDT701的编码基因中插入外源片段，从而敲除HDT701的编码基因；例如，在HDT701的编码基因的第三个内含子中插入外源片段，从而敲除HDT701的编码基因。其它各种敲除HDT701的方式、手段均应被包含在本发明中。

本发明还提供了用于制备HDT701基因被敲除、从而株型发生改变的植物的试剂盒，所述的试剂盒中包含针对于HDT701基因的、应用于进行C-CRISPR方法操作的sgRNA及Cas 9mRNA或能够在体内或体外形成该sgRNA及Cas 9mRNA的试剂；或应用于干扰操作的RNAi试剂。

其它常用于进行转基因操作的试剂也可被包含在所述的试剂盒中，以方便本领域技术人员使用。此外，所述试剂盒中还可包含有指导本领域技术人员操作的使用说明书。

此外，本发明还涉及利用强HDT701蛋白或其编码基因作为一种基因转化植株后代的追踪标记。本发明还涉及利用强HDT701蛋白或其编码基因作为一种分子标记，通过检测植物中HDT701蛋白的表达情况，早期确定植物的粒型或产量性状；具体地，所述粒型或产量性状为：粒长、粒宽、分蘖数、每穗粒数、抽穗时间、开花时间、种子萌发时根伸出时间、旗叶和剑叶披垂性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

1、序列信息

HDT701编码序列：(SEQ ID NO:1)

ATGGAGTTCTGGGGTCTTGAAGTCAAGCCTGGACAGACTGTCAAATGTGAGCCTGAAGATGAACGCTTTTTGCACCTTTCTCAGGCTGCTCTTGGGGAATCAAAGAAAGGATCTGACAATGCAGTAATGTATGTTAAAACTGATGATCAAAAGCTAGTCATTGGAACCCTCTCAGCTGACAAGTTCCCTCAAATCCAGTTTGATTTGGTCTTTGACAAAGAGTTTGAGCTGTCACACACTTCAAAGACTGCTAGTGTGTTCTTTTCTGGCTACAAAGTTTCCCAGCCGGCTGAGGAAGATGAAATGGATTTTGATTCTGAAGAAGTTGAAGATGAAGAGGAGGAAGAAAAGATCATTCCAGCTCCCAGGGCAAATGGCAAAGTTGAAGGGAAGGAAAATGAGCAGAAAAAACAAGGCAAGACAGATTCTTCAGCTTCAAAATCAAAGGCTGCAGTGAATGACGATGATGATGATGATGACAGTGATGAGGATGATTCTGAGGACGAAGATCTTTCTCCTGAGGATGATGATGATGA TTCTTCTGAGGATGATTCCAGCGAAGATGATGAGGATGAGAGTGACGAGGAAGAtACTCCCAAGAAGCCAGAGACTGGAAAGAGGAAAGTAGCTGAAATTGTGTTGAAGACACCTTCGTCTGATAAGAAAGCAAAGATTGCTACACCGTCAGGCCAGAAGACAGGTGACAAGAAGGGTGTCCATGTAGCAACTCCACATCCGGCAAAGCAGGCTAGCAAGACCCCCGTGAATGACAAGTCAAAGGAGAAGTCCCCAAAATCCGGTGGTGGGTCAATTTCTTGCAAGTCATGCAGCAAGACGTTCAACAGTGAAATGGCTCTGCAATCTCACTCGAAGGCCAAGCACCCCGCCAAGTGA

HDT701氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

MEFWGLEVKPGQTVKCEPEDERFLHLSQAALGESKKGSDNAVMYVKTDDQKLVIGTLSADKFPQIQFDLVFDKEFELSHTSKTASVFFSGYKVSQPAEEDEMDFDSEEVEDEEEEEKIIPAPRANGKVEGKENEQKKQGKTDSSASKSKAAVNDDDDDDDSDEDDSEDEDLSPEDDDDDSSEDDSSEDDEDESDEEDTPKKPETGKRKVAEIVLKTPSSDKKAKIATPSGQKTGDKKGVHVATPHPAKQASKTPVNDKSKEKSPKSGGGSISCKSCSKTFNSEMALQSHSKAKHPAK

2、CRSIPR-cas9敲除载体构建

首先，设计sgRNA序列为GGACAGACTGTCAAATGTGA(SEQ ID NO:3)。其靶向于hdt701序列的第二外显子(CDS序列31-50/894bp)的位置。

将该序列连入CRISPR-cas9载体系统(载体图谱如图1A，获自北京大学)。主要步骤包括：

BsaⅠ(Eco31Ⅰ)酶切Fast AP去磷中间载体pOs-sgRNA(图1B)后回收；对BsaⅠ粘性末端的PAM序列PNK(NEB)加入磷酸基团，体系内含有100μM PAM F primer和100μM PAM Rprimer各1μl、PNK 1μl、PNK buffer(可用T4ligase buffer代替)及ddH₂O 6μl，37℃下30min加磷酸基团，95℃下5min将酶失活，随后逐步降温至25℃，使PAM序列双链配对。连接pOs-sgRNA及含粘性末端的配对PAM序列，体系含有酶切后中间载体1μl、磷酸后粘性配对PAM序列1μl(1:200稀释)、T4DNA ligase(NEB)1μl、T4DNA ligase buffer1μl及ddH₂O 6μl，22℃连接1h。转化DH5αE.Coli菌株，卡那霉素LB固体培养基筛选，并用M13F primer及PAM RPrimer聚合酶链式反应检测。对正确的菌落扩繁提取质粒，并进行LR(invitrogen，lot1835504)反应，5μl反应体系中含有LRR酶1μl、PH 8.0的1×TE buffer 2μl、最终载体150ng及含PAM序列的中间载体50-150ng，25℃下反应1h，随后加入蛋白酶K，10min失活LRR酶。转化DH5αE.Coli菌株，壮观霉素LB固体培养基筛选，并用U3primer及PAM R Primer聚合酶链式反应检测。

PAM F:GGCAAAAACCTCCAAAATCAACTCCAA(SEQ ID NO:4)

PAM R:AAACTTGGAGTTGATTTTGGAGGTTTT(SEQ ID NO:5)

M13F:CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC(SEQ ID NO:6)

U3:AGCACAGGACAGGCGTCTTCT(SEQ ID NO:7)

载体转化植物：正确的载体转化农杆菌EHA105，随后利用农杆菌侵染植物的特性，使含有CRISPR载体的农杆菌将质粒同源重组如水稻幼胚愈伤组织，同时利用载体上含有标签基因可在含潮霉素的培养基上生长，筛选出含有潮霉素抗性基因和CRISPR载体的愈伤细胞，愈伤细胞具有全能性，可分化生长为完整的水稻幼苗。

3、Ubi::RNAi-HDT701降低HDT701基因表达

首先，设计RNAi序列为(SEQ ID NO:8)：

TTTCTCAGGCTGCTCTTGGGGAATCAAAGAAAGGATCTGACAATGCAGTAATGTATGTTAAAACTGATGATCAAAAGCTAGTCATTGGAACCCTCTCAGCTGACAAGTTCCCTCAAATCCAGTTTGATTTGGTCTTTGACAAAGAGTTTGAGCTGTCACACACTTCAAAGACTGCTAGTGTGTTCTTTTCTGGCTACAAAGTTTCCCAGCCGGCTGAGGAAGATGAAATGGATTTTGATTCTGAAGAAGTTGAAGATGAAGAGGAGGAAGAAAAGATCATTCCAGCTCCCAGGGCAAATGGCAAAGTTGAAGGGAAGGAAAATGAGCAGAAAAA。

其靶向于hdt701序列的第二至第六外显子(CDS序列77-410/894bp)的位置。

Ubi::RNAi-HDT701具体构建过程如下：以RNAi引物合成后，PCR扩增含有酶切接头的CDS片段。正确的序列以HindⅢ/SalⅠ双酶切连入pMD18-T；鉴定正确后以KpnⅠ/BamHⅠ双酶切再次连入pMD18-T(图2)。随后HindⅢ/BamHⅠ双酶切含有反向互补CDS序列的pMD18-T，并消化粘性末端。RNAi最终载体pUN1301是以酶切连接的方式将Ubi插入pCAMBIA1301多克隆位点HindⅢ/BamHⅠ。SmaⅠ单酶切pUN1301，并用FAST AP去掉磷酸基团。将消化后的反向互补CDS序列连入酶切好的pUN1301。Ubi primer和BamHⅠSalⅠ-RNAI R primer检测pUN1301是否插入HDT701的CDS片段。

KpnⅠHindⅢ-RNAi F:ggggtaccaagcttTTTCTCAGGCTGCTCTTG(SEQ ID NO:9)

BamHⅠSalⅠ-RNAi R:cgggatccgtcgacATGAGCAGAAAAAAC(SEQ ID NO:10)

Ubi:TGCAGCAGCTATATGTGGATTT(SEQ ID NO:11)

Real time PCR F:TTCTGAAGAAGTTGAAGATGAAGAG(SEQ ID NO:12)

Real time PCR R:CCTCAGAAGAATCATCATCATCATCCT(SEQ ID NO:13)

将正确构建的载体转化农杆菌EHA105，并感染野生型ZH11。检测T₀代载体插入和表达水平，松江大田重点观察表达水平下降的T₀代所得T₁代水稻材料表型。

4、Pro_HDT701::HDT701^DNA互补或过表达载体的构建

具体构建过程如下：构建pUN1301-3×Flag载体，该载体酶切连接的方式将Ubi插入pCAMBIA 1301(图3)多克隆位点HindⅢ/BamHⅠ，并将3×Flag肽段插入KpnⅠ/SacⅠ酶切位点，获得pUN1301-3×Flag。随后以HDT701启动子替换pUN1301-3×Flag载体中的Ubi，并将HDT701^DNA以BamHⅠ/SmaⅠ酶切连入含有启动子的载体。

多克隆位点及3×Flag序列(SEQ ID NO:14)：

其中双下划线为BamHⅠ酶切位点，黑色框内为SmaⅠ酶切位点，波浪线为Kpn1酶切位点，虚线下划线为3×Flag序列。其中BamHⅠ和KpnⅠ不会导致移码突变。

HindⅢ-Pro_HDT701F：aagcttTTATGTGTTTATGAACCGCCT(SEQ ID NO:15)

BamHⅠ-Pro_HDT701R：ggatccCATCGGAATCGGCGGCGGCG(SEQ ID NO:16)

BamHⅠ-HDT701^DNA F：ggatccATGGAGTTCTGGGGTAATCTCCTCC(SEQ ID NO:17)

SmaⅠ-HDT701^DNA R：cccgggtcCTTGGCGGGGTGCTTGG(SEQ ID NO:18)

Pro_HDT701::HDT701^DNA既可用于回复突变体hdt701表型，又可转化野生型ZH11，从而观察过表达材料的表型。

实施例1、敲除hdt701调节水稻粒型

本发明人对水稻的表观调控基因hdt701进行CRISPR-cas9基因敲除实验，以ZH11为出发植株，共得到5种纯合体突变体(hdt701-1～hdt701-5；图4C)。

在人工气候室、上海松江大田和海南陵水基地环境下，对突变体进行粒型观察，发现突变体的粒型改变，表现为：粒长增加，粒宽减少。如图4A～B所示。

由于上述五种突变位点均为同一个靶位点，所以为了排除脱靶效应，本发明人利用孟德尔遗传定律验证该表型是否为HDT701单基因突变导致。将已筛除载体插入的纯合突变体与ZH11正反交，观察F1所结种子与ZH11相同，说明HDT701无印记效应。F1代自交后，对F2代表型和基因型统计发现，符合HDT701单基因隐性突变。如图5A～C所示。

比对发现，ZH11和日本晴的HDT701基因存在单碱基序列多样性，因此本发明人同样对日本晴进行CRISPR-cas9敲除。结果如图10A和C。可见单碱基序列的差异，并不会对HDT701影响粒型发育造成影响，对日本晴的CRISPR改造呈现与ZH11同样的结果。

实施例2、干扰hdt701调节水稻粒型

本发明人还构建Ubi::RNAi-HDT701载体，转化ZH11水稻幼胚愈伤组织后，对稳定遗传的T2代转基因株系进行插入鉴定、RNA水平检测及粒型观察与统计。

如图6A，RNAi质粒构建成功。

如图6B，获得三株RNAi植株RNAi-1、RNAi-11、RNAi-19，其hdt701的相对表达显著性下降。

如图6C，与ZH11野生型相比，RNAi植株的后代的种子粒型发生改变，表现为：粒长增加，粒宽减少。

本发明人同样对日本晴进行RNAi。结果如图10B和D。可见单碱基序列的差异，并不会对HDT701影响粒型发育造成影响，对日本晴的RNAi改造呈现与ZH11同样的结果。

实施例3、HDT701在水稻粒型调控上的功能

为了进一步确认HDT701在水稻粒型调控上的功能，本发明人构建了Pro_HDT701::HDT701^DNA转化hdt701突变体，获得的转化植株包括C-5、C-6、C-12、C18、C-20、C-24。突变体背景基因组检测如图7B。Pro_HDT701::HDT701^DNA转化突变体载体检测如图7C。Pro_HDT701::HDT701^DNA转化突变体中HDT701蛋白检测如图7D。回复材料HDT701表达水平检测如图7E。

如图7A，发现hdt701粒型发生了有效的回复，互补植株的种子长度降低，宽度增加。对回复材料的粒型统计如图7F～H。

上述结果确证，由HDT701的突变导致了种子变长和变窄的表型。

实施例4、HDT701对产量的影响作用

除了粒型方面的观察，本发明人对突变体的产量也进行了统计。决定水稻产量有三个要素：千粒重、每穗粒数及有效分蘖数。

统计发现，突变体hdt701的千粒重和有效分蘖数明显减少，每穗粒数有增多，单株产量存在明显减少。同时，一级枝梗数有显著增多。如图8A～P。

因此，hdt701在广谱抗病性提高的同时，产量明显减少。

实施例5、HDT701过表达的性状变化

突变体hdt701种子变长变窄，且对产量性状的各项指标影响较大，产量减少严重。因此，本发明人构建了Pro_HDT701::HDT701^DNA过表达载体转化野生型ZH11，来观察HDT701过表达对水稻粒型和产量等的影响。获得的过表达转化植株包括OVER-4、OVER-5、OVER-7、OVER-15、OVER-17、OVER-19、OVER-20、OVER-24、OVER-30。对过表达株系HDT701表达水平检测如图9B。

如图9A，9个不同的过表达株系的粒型观察，其中OVER-4、OVER-7、OVER-19、OVER-20、OVER-24和OVER-30种子明显变长变窄。

除对粒型的影响外，hdt701抽穗和开花时间延迟，而过表达株系开花时间提前；种子萌发时根伸出较野生型慢；旗叶和剑叶披垂严重。如图11。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 调控水稻种子粒型的HDT701及其应用

<130> 190115

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 894

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa )

<400> 1

atggagttct ggggtcttga agtcaagcct ggacagactg tcaaatgtga gcctgaagat 60

gaacgctttt tgcacctttc tcaggctgct cttggggaat caaagaaagg atctgacaat 120

gcagtaatgt atgttaaaac tgatgatcaa aagctagtca ttggaaccct ctcagctgac 180

aagttccctc aaatccagtt tgatttggtc tttgacaaag agtttgagct gtcacacact 240

tcaaagactg ctagtgtgtt cttttctggc tacaaagttt cccagccggc tgaggaagat 300

gaaatggatt ttgattctga agaagttgaa gatgaagagg aggaagaaaa gatcattcca 360

gctcccaggg caaatggcaa agttgaaggg aaggaaaatg agcagaaaaa acaaggcaag 420

acagattctt cagcttcaaa atcaaaggct gcagtgaatg acgatgatga tgatgatgac 480

agtgatgagg atgattctga ggacgaagat ctttctcctg aggatgatga tgatgattct 540

tctgaggatg attccagcga agatgatgag gatgagagtg acgaggaaga tactcccaag 600

aagccagaga ctggaaagag gaaagtagct gaaattgtgt tgaagacacc ttcgtctgat 660

aagaaagcaa agattgctac accgtcaggc cagaagacag gtgacaagaa gggtgtccat 720

gtagcaactc cacatccggc aaagcaggct agcaagaccc ccgtgaatga caagtcaaag 780

gagaagtccc caaaatccgg tggtgggtca atttcttgca agtcatgcag caagacgttc 840

aacagtgaaa tggctctgca atctcactcg aaggccaagc accccgccaa gtga 894

<210> 2

<211> 297

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa )

<400> 2

Met Glu Phe Trp Gly Leu Glu Val Lys Pro Gly Gln Thr Val Lys Cys

1 5 10 15

Glu Pro Glu Asp Glu Arg Phe Leu His Leu Ser Gln Ala Ala Leu Gly

20 25 30

Glu Ser Lys Lys Gly Ser Asp Asn Ala Val Met Tyr Val Lys Thr Asp

35 40 45

Asp Gln Lys Leu Val Ile Gly Thr Leu Ser Ala Asp Lys Phe Pro Gln

50 55 60

Ile Gln Phe Asp Leu Val Phe Asp Lys Glu Phe Glu Leu Ser His Thr

65 70 75 80

Ser Lys Thr Ala Ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr Lys Val Ser Gln Pro

85 90 95

Ala Glu Glu Asp Glu Met Asp Phe Asp Ser Glu Glu Val Glu Asp Glu

100 105 110

Glu Glu Glu Glu Lys Ile Ile Pro Ala Pro Arg Ala Asn Gly Lys Val

115 120 125

Glu Gly Lys Glu Asn Glu Gln Lys Lys Gln Gly Lys Thr Asp Ser Ser

130 135 140

Ala Ser Lys Ser Lys Ala Ala Val Asn Asp Asp Asp Asp Asp Asp Asp

145 150 155 160

Ser Asp Glu Asp Asp Ser Glu Asp Glu Asp Leu Ser Pro Glu Asp Asp

165 170 175

Asp Asp Asp Ser Ser Glu Asp Asp Ser Ser Glu Asp Asp Glu Asp Glu

180 185 190

Ser Asp Glu Glu Asp Thr Pro Lys Lys Pro Glu Thr Gly Lys Arg Lys

195 200 205

Val Ala Glu Ile Val Leu Lys Thr Pro Ser Ser Asp Lys Lys Ala Lys

210 215 220

Ile Ala Thr Pro Ser Gly Gln Lys Thr Gly Asp Lys Lys Gly Val His

225 230 235 240

Val Ala Thr Pro His Pro Ala Lys Gln Ala Ser Lys Thr Pro Val Asn

245 250 255

Asp Lys Ser Lys Glu Lys Ser Pro Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Ser

260 265 270

Cys Lys Ser Cys Ser Lys Thr Phe Asn Ser Glu Met Ala Leu Gln Ser

275 280 285

His Ser Lys Ala Lys His Pro Ala Lys

290 295

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 用于敲除的序列(sgRNA)

<400> 3

ggacagactg tcaaatgtga 20

<210> 4

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 4

ggcaaaaacc tccaaaatca actccaa 27

<210> 5

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 5

aaacttggag ttgattttgg aggtttt 27

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 6

cgccagggtt ttcccagtca cgac 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 7

agcacaggac aggcgtcttc t 21

<210> 8

<211> 334

<212> DNA

<213> 干扰序列(RNAi)

<400> 8

tttctcaggc tgctcttggg gaatcaaaga aaggatctga caatgcagta atgtatgtta 60

aaactgatga tcaaaagcta gtcattggaa ccctctcagc tgacaagttc cctcaaatcc 120

agtttgattt ggtctttgac aaagagtttg agctgtcaca cacttcaaag actgctagtg 180

tgttcttttc tggctacaaa gtttcccagc cggctgagga agatgaaatg gattttgatt 240

ctgaagaagt tgaagatgaa gaggaggaag aaaagatcat tccagctccc agggcaaatg 300

gcaaagttga agggaaggaa aatgagcaga aaaa 334

<210> 9

<211> 32

<212> DNA

<213> 干扰序列(RNAi)

<400> 9

ggggtaccaa gctttttctc aggctgctct tg 32

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> 干扰序列(RNAi)

<400> 10

cgggatccgt cgacatgagc agaaaaaac 29

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 干扰序列(RNAi)

<400> 11

tgcagcagct atatgtggat tt 22

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 干扰序列(RNAi)

<400> 12

ttctgaagaa gttgaagatg aagag 25

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> 干扰序列(RNAi)

<400> 13

cctcagaaga atcatcatca tcatcct 27

<210> 14

<211> 165

<212> DNA

<213> 多克隆位点及3×Flag序列(Multiplecloningsites and 3×Flag)

<400> 14

cgctatttat ttgcttggta ctgtttcttt tgtcgatgct caccctgttg tttggtgtta 60

cttctgcagg tcgactctag aggatccccg ggtaccgact acaaagacca tgatggagac 120

tataaggatc acgacatcga ttacaaggac gatgacgata agtga 165

<210> 15

<211> 27

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 15

aagcttttat gtgtttatga accgcct 27

<210> 16

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 16

ggatcccatc ggaatcggcg gcggcg 26

<210> 17

<211> 31

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 17

ggatccatgg agttctgggg taatctcctc c 31

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物(Primer)

<400> 18

cccgggtcct tggcggggtg cttgg 25

Claims

1.一种调节水稻性状的方法，其特征在于，所述方法包括：调节水稻中HDT701的表达。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：下调HDT701的表达，从而：增加种子粒长，降低种子粒宽，减少分蘖数，增加每穗粒数，延迟抽穗和开花时间。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述下调HDT701的表达包括：在水稻中敲除或沉默HDT701基因，或抑制HDT701蛋白的活性；较佳地，包括：以特异性干扰HDT701基因表达的干扰分子来沉默HDT701，以基因编辑方法敲除HDT701基因，以同源重组方法敲除HDT701基因，或以反义的HDT701蛋白的编码基因下调HDT701的表达。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，通过采用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑，从而敲除HDT701的编码基因；较佳地，以sgRNA进行基因编辑，更佳地其靶向于hdt701序列的第二外显子或其序列包括：SEQ ID NO:1；或

通过RNAi的方法沉默HDT701基因；较佳地，所述RNAi的序列包括：SEQ ID NO:6所示的序列。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：上调HDT701的表达，从而增加种子粒长，降低种子粒宽，促进开花时间提前，降低种子萌发时根伸出的时间，促进旗叶和剑叶披垂。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上调HDT701的表达包括：将过量表达所述HDT701的过量表达分子转入水稻细胞、组织、器官或种子，从而上调HDT701的表达。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的HDT701选自下组：

(a)如SEQ ID NO:2氨基酸序列的蛋白；

(b)将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白；或

(c)与(a)限定的蛋白序列有80％以上同源性且具有(a)蛋白功能的由(a)衍生的蛋白。

8.一种HDT701蛋白或其编码基因或它们的上调剂的用途，用于调节水稻的性状，包括：增加种子粒长，降低种子粒宽，促进开花时间提前，降低种子萌发时根伸出的时间，促进旗叶和剑叶披垂。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的上调剂包括：过量表达所述HDT701的过量表达分子。

10.一种HDT701蛋白或其编码基因的下调剂的用途，用于调节水稻的性状，包括：增加种子粒长，降低种子粒宽，减少分蘖数，增加每穗粒数，延迟抽穗和开花时间。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述下调剂包括：敲除或沉默HDT701基因或抑制HDT701蛋白活性的下调剂；较佳地，包括：特异性干扰HDT701基因表达的干扰分子，敲除HDT701基因的基因编辑试剂，基于同源重组的敲除HDT701基因的试剂。

12.一种HDT701蛋白或其编码基因用途，用于作为鉴别水稻性状的分子标记，所述性状包括：粒长、粒宽、分蘖数、每穗粒数、抽穗时间、开花时间、种子萌发时根伸出时间、旗叶和剑叶披垂性。

13.一种sgRNA或能形成所述sgRNA的核酸，其特征在于，所述的sgRNA靶向于HDT701基因，其靶向于hdt701序列的第二外显子或其序列包括：SEQ ID NO:1。

14.一种RNAi试剂，其特征在于，所述的RNAi试剂靶向于HDT701基因，其序列包括：SEQID NO:6。