CN111596054A - 一种肿瘤标志物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肿瘤标志物。具体地，本发明一方面提供了一种确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的方法，包括检测该受试者的血液样本中Hsp90α的浓度，如果该浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中所述阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围内，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述阈值±15％范围内的数值均被视为具有等同判定意义。

Description

一种肿瘤标志物
相关申请
本申请是中国专利申请201410302717.1的分案申请。
技术领域
本发明涉及肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌等16种肿瘤的诊断、病情监测 和疗效评价等。更具体地说，本发明涉及通过热休克蛋白90α定量检测辅助诊 断肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌等肿瘤和进行病情监测和疗效评价的方法。
背景技术
热休克蛋白90α(Hsp90α)是一个含量丰富的细胞内伴侣蛋白。近年来研究 显示，Hsp90α可以被癌细胞特异性的分泌到细胞外，且与癌症的发生和发展密 切相关。本研究组已发现，分泌到胞外的Hsp90α可以在外周血中很方便的被定 量检测，其含量与肿瘤的负荷和恶性程度呈现一定的相关性，但并没有任何数据 能够指导该项指标在肿瘤临床中的应用。因此，如何将分泌型Hsp90α应用于肿 瘤临床实践是亟待解决的问题。
发明内容
本发明一方面提供了一种确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险 的方法，包括检测该受试者的血液样本中Hsp90α的浓度，如果该浓度达到或超 过预先设定的阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中所 述阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围内，例如所述阈值可以为50、53、56、 62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述阈值±15％范围内的数值 均被视为具有等同判定意义。
本领域技术人员可以理解，由于检测方法的局限性，要做到浓度测定结果完 全准确是相当困难的。根据本领域的惯常做法，上下偏差15％以内可以被认为 是合理误差。例如当所述阈值选定为50ng/ml时，如果受试者的测量值为43 ng/ml，也可以判定该受试者患有癌症，或者具有较高的罹患癌症的风险。
在本发明中，所述血液样本可以为血浆或血清样本。在本发明的优选实施方 案中，血浆样本是优选的，其测量精度更高。
所述Hsp90α的阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85 或117ng/ml。例如，在本发明一个具体实施方案中，针对肺癌的特别优选的阈 值是67.47ng/ml(可以四舍五入取67ng/ml)，此时对应的特异度为85％，灵 敏度为64％。在上述阈值±15％的范围内的数值均可视为等同的判定范围。
在本发明一个具体实施方案中，针对肺癌的一个优选的阈值是82ng/ml， 即Hsp90α的浓度为0-82ng/ml时被认为是正常值范围；在本发明一个优选实 施方案中，针对肺癌的一个特别优选的阈值是53ng/ml，即Hsp90α的浓度为 0-53ng/ml时被认为是正常值范围。同样的，在上述阈值±15％的范围内的数 值均可视为具有等同判定意义。所述血液样本优选为血浆样本。
本发明另一方面提供了一种用于对正在接受治疗的癌症患者进行病情监测 和/或疗效评价或者用于对候选治疗药物进行疗效评价的方法，包括在治疗前及 治疗后分别检测受试者的血液样本中Hsp90α的浓度，如果治疗后Hsp90α的浓 度相对于治疗前Hsp90α浓度增加的百分比达到或超过预先设定的阈值，则判定 该受试者病情进展和/或疗效较差，或者判定所述候选治疗药物疗效较差，其中 所述阈值选自10％到50％的范围内，例如所述阈值可以为34％，且所述阈值± 15％范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地，所述血液样本为血浆样 本。
此处所用的术语“治疗”应当做广义的理解。例如，在对肺癌患者进行治疗 时，可能涉及多个治疗周期，例如总共8个治疗周期。如果将整个治疗过程作为 一个整体来看，可以在第1个治疗周期开始前和第8个治疗周期结束后，分别 对Hsp90α的浓度进行检测，并据此判断整个治疗过程的效果。或者，也可以将 每个治疗周期视为一次“治疗”(例如出于获得更精确评估结果的目的)。例如， 可以在每个治疗周期开始前和结束后，均对Hsp90α的浓度进行检测，并据此判 断单个治疗周期的效果。或者，还可以进行更精确的评估。例如，在单个治疗周 期包括总共20天治疗的情况下，可以将每一天视为一次“治疗”，在当天的治疗开始前和当天的治疗结束后，分别对Hsp90α的浓度进行检测，从而判断当天 的治疗效果。本领域技术人员可以根据不同的评估要求，具体设定“治疗”的时 间跨度。
本发明还提供了确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的方法，包 括联合检测该受试者的血液样本中Hsp90α的浓度以及至少一种其他肿瘤标志 物的浓度，如果Hsp90α的浓度和所述至少一种其他肿瘤标志物的浓度达到或超 过预先设定的阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中 Hsp90α的阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围内，例如所述阈值可以为50、 53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述阈值±15％范围 内的数值均被视为具有等同判定意义。所述血液样本优选为血浆样本，所述至少 一种其他肿瘤标志物优选选自由癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段抗原21-1 (CYFRA21-1)、AFP、CA19-9、CA125、CA15-3、PSA和CA72-4构成的组。
根据本发明的优选实施方案，本发明方法中Hsp90α的浓度优选地采用 EDTA-K2作为抗凝剂进行检测。
本发明的方法适用的癌症种类包括：肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、 胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、 膀胱癌和前列腺癌。
本发明还提供了用于确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的试 剂盒，包括：任选的人分泌型Hsp90α、人分泌型Hsp90α单克隆抗体、检测试 剂以及说明书，其中所述说明书中标明了健康人血液样本中Hsp90α浓度的阈 值，如果受试者的血液样本中Hsp90α的浓度达到或超过所述阈值，则判定该受 试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中所述阈值选自50ng/ml到120 ng/ml的范围，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、 85或117ng/ml，且所述阈值±15％范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地，所述血液样本为血浆样本。
此处所用的术语“任选的”表示可以有，也可以没有。例如，“任选的人分 泌型Hsp90α”，是指本发明的试剂盒可以包括人分泌型Hsp90α，也可以不包括 人分泌型Hsp90α。例如，可以将人分泌型Hsp90α单独包装，并与试剂盒的主 体部分联合使用。优选地，出于方便使用的目的，本发明的试剂盒中包括人分泌 型Hsp90α，用作检测时的标准品。特别优选的是重组人分泌型Hsp90α。
根据本发明的优选实施方式，所述试剂盒中可以包括用于采集血液样本的容 器，并且该容器中包含EDTA-K2。在本发明的优选实施方案中，所述用于采集 血液样本的容器为包含EDTA-K2的采血管。
根据在本发明的具体实施方案，Hsp90α的浓度采用EDTA-K2作为抗凝剂 进行检测是优选的。
本发明的试剂盒适用的癌症种类包括：肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、胃 癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨 肉瘤、膀胱癌和前列腺癌。
本发明的实施例中还将Hsp90α定量检测在癌症辅助诊断和疗效监测中的有 效性研究方法应用于多种癌症，发现Hsp90α浓度在癌症诊断中的阈值范围对肺 癌、肝癌、结直肠癌和乳腺癌等同样适用，并提供了肿瘤标志物Hsp90α定量检 测用于肺癌、肝癌、结直肠癌和乳腺癌诊断的具体统计学参数。
本发明的实施例中根据不同人群的数据绘制相应的ROC曲线。根据本领域 公知技术，每一条ROC曲线都提供了一系列阈值及与之相对应的灵敏度和特异 度。因此，使用这些ROC曲线，本领域技术人员能很容易地查出选取任意阈值 (即cut-off值)时该项检测对疾病的识别能力，即诊断相应癌种的灵敏度、特 异度和符合率。例如：
当适应症为肝癌时，患者相对于健康人的cut-off值是52.79ng/ml时，灵敏 度、特异度和符合率分别是93.7％，85％和94.5％，当cut-off值是62.20ng/ml 时，灵敏度、特异度和符合率分别是91.4％，90％和92.2％；患者相对于非癌症 肝部相关疾病的cut-off值是63.66ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是 90.7％，90％和90.3％，当cut-off值是85.24ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率 分别是80.7％，95％和88.6％。
当适应症是结直肠癌时，患者相对于健康人及非癌症结直肠相关疾病组的 cut-off值是52.79ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是89.9％，85％和87％， 当cut-off值是62.20ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是83.4％，90％和 87％。
当适应症为乳腺癌时，患者相对于健康人的cut-off值是52.66ng/ml时，灵 敏度、特异度和符合率分别是65.6％，85％和73.85％，当cut-off值是61.92ng/ml 时，灵敏度、特异度和符合率分别是54.6％，90％和69.68％；患者相对于非癌症 乳腺相关疾病组的cut-off值是63.41ng/ml时，灵敏度、特异度和符合率分别是 52.4％，84.9％和68.29％，当cut-off值是72.21ng/ml时，灵敏度、特异度和符合 率分别是41.9％，90.1％和65.41％。
本领域技术人员可以理解，由于受试人群和瘤种的不同，cut-off值的选取及 其对应的灵敏度、特异度和符合率等参数会有所差别，但均包含在本发明限定的 阈值范围内。本领域技术人员可以根据实际使用需求，如对特定瘤种、灵敏度、 特异度等的要求，从本发明公开的ROC曲线或阈值范围内选取适当的优选阈值。
本发明还验证了肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌患者手术后血浆Hsp90α含 量比手术前显著降低，因此该项检测指标可以作为手术治疗效果评价的手段。同 时，临床获益的(CR+PR+SD)接受内科治疗的患者，在治疗后的检测值显著低 于治疗前，说明该项指标可以用于上述癌症的内科治疗疗效评价。
本发明的实施例中检测了胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素 瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌、前列腺癌等多种癌症患者血浆 Hsp90α含量，发现与健康人相比均显著升高(具有统计显著性)，并分别提供 了上述不同癌种患者血浆Hsp90α含量的平均参考值。这说明肿瘤标志物Hsp90α 可用于胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻 咽癌、骨肉瘤、膀胱癌、前列腺癌等多癌症的诊断。
附图说明
图1是Hsp90α检测结果的ROC曲线(基于所有检测Hsp90α的受试者)。
图2是Hsp90α检测结果的ROC曲线AUC 95％CI(0.788,0.829)。
图3是Hsp90α检测结果的ROC曲线AUC 95％CI(0.811,0.854)。
图4是Hsp90α检测结果的ROC曲线AUC 95％CI(0.804,0.850)。
图5是Hsp90α检测结果的ROC曲线AUC 95％CI(0.731,0.777)。
图6是根据斜率判定肿瘤增大的ROC曲线。
图7是根据变化百分比判定PD的ROC曲线。
图8是根据变化值判定PD的ROC曲线。
图9显示了EDTA-K2采血管样本和EDTA-K3采血管样本的对比。
图10是肝癌患者相对于健康人的ROC曲线。
图11是肝癌患者相对于非癌肝部相关疾病人群的ROC曲线。
图12是结直肠癌患者相对于健康人及非癌结直肠相关疾病的ROC曲线。
图13是乳腺癌患者相对于健康人的ROC曲线。
图14是乳腺癌患者相对于非癌乳腺相关疾病人群的ROC曲线。
图15是多种癌症患者血浆Hsp90α含量检测结果汇总。
图中，“ROC Curve for Model”表示针对模型的ROC曲线，“Area under theCurve”表示曲线下面积，“Specificity”表示特异度，“Sensitivity”表示灵敏度。
具体实施方式
本文所用的术语“血液样本”是指由受试者的血液获得的样本。考虑到细胞 内Hsp90α对检测的干扰，血液样本优选为血浆或血清样本，也可以是由血浆或 血清稀释后的样本。本领域技术人员可以理解，由于在成分上的区别，当采用受 试者的血浆样本和血清样本分别进行检测时，Hsp90α的浓度可能会略有不同。 出于便于定量和比较的目的，在本发明中血浆样本是优选的。
本文所用的术语“特异度”、“灵敏度”、“符合率”均与相对应的医学统 计学术语具有相同的含义。
“特异度”(specificity)是指诊断为“非癌症”的病例中经试剂盒检测为阴性 的比例。
“灵敏度”(sensitivity)是指病理学诊断为“癌症”的病例中，经试剂盒检测为 阳性的比例。
“符合率”(accuracy)是指真阳性样本量与真阴性样本量之和占总样本量的 比例，反映试剂盒检测结果与受试者是否罹患癌症的真实情况相符合的程度。
本文所用的术语“cut-off值”、“界值”“参考值”和“阈值”可以互换 使用，指的是用来判断检测结果的标准，即临界值，检测结果高于cut-off值即视 为阳性，低于cut-off值即视为阴性。
本文所用的术语“临床获益”，指经过某种治疗达到病情稳定或缓解的情况， 其中CR、PR和SD具有与实体瘤疗效评价标准(RECIST标准)中相应术语完全相 同的含义，即CR(Complete response)肿瘤完全缓解、PR(Partial response) 肿瘤部分缓解和SD(Stabledisease)疾病稳定。CR、PR和SD这三项指标作为临 床获益人群的界定，与此相反的是PD(Progressive disease)即疾病进展。
本文所用术语“非癌相关疾病”指经病理学诊断确诊为不是癌症但患有良 性相关疾病的患者，如在肺癌试验中指确诊为不是肺癌但患有肺炎、肺结核等肺 部良性相关疾病的患者，在肝癌试验中指确诊为不是肝癌但患有肝炎、肝硬化等 肝部良性相关疾病的患者，在结直肠癌试验中指确诊为不是结直肠癌但患有炎 症、结直肠息肉等结直肠良性相关疾病的患者，在乳腺癌试验中指确诊为不是肺、 乳腺癌癌但患有乳腺炎、乳腺增生等乳腺良性相关疾病的患者。
本文中所用的部分缩写及统计术语含义如下表所示：
Figure BDA0002455732490000051
Figure BDA0002455732490000061
实施例1
研究目的
通过以下三个方面的试验内容，评价Hsp90α定量检测试剂盒的临床使用范 围和临床性能。
1、对健康人群、肺癌患者、肺部非癌病变患者和其他恶性肿瘤患者的血浆 中的Hsp90α含量进行测定，检验Hsp90α试剂盒检测的临床准确性、特异性和 灵敏度，并利用ROC曲线确定合适的阳性参考值(cut-off值)；
2、对治疗期间的肺癌患者血浆中Hsp90α的含量进行动态监测，检验其浓 度变化与患者病情变化的相关性，即疗效监测的临床有效性；
3、分别对比Hsp90α与癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段抗原21-1 (CYFRA21-1)检测结果，作为临床试验的次要目的。
1.1样本的来源
选择对象范围为住院和门诊患者。选择对象的数量为不少于1100例血浆样 本和不少于150例的动态监测血浆样本，选择高值样本和低值样本所占比例符 合统计学要求。
1.1.1非动态监测样本的选择
研究对象包括：病例组和对照组，男女不限。
(1)病例组：病理学诊断方法新确诊为荷瘤的肺癌患者的样本，病例组血 浆样本应包括肺癌的不同类型和不同分期。
(2)对照组：经临床生化、影像或病理学方法证实为非肺癌的人群。对照 组应包括确定无明显疾病症状的健康人样本、确定无肺癌但有肺部其他病变的样 本(如肺结核、肺炎)、肺部良性肿瘤样本和其他恶性肿瘤样本。
健康人群定义：无任何已知的良性或恶性疾病、外表正常、无任何可见疾病 症状的人。
肺部病变患者：通过临床生化、影像以及病理等手段确诊患有肺部病变且该 病变不是癌症的患者。
1.1.2动态监测样本的选择
对至少150例规范的内科治疗方案和手术方案治疗的肺癌患者的随访监测 研究，以检验血浆中Hsp90α浓度的变化与患者病情变化的相关性。血浆样本的 收集时间点为：
(1)对12例肺癌手术患者采用多时间点监测，以检测Hsp90α在血浆中的 代谢情况。分别在治疗前，治疗后第1、3、7、14、21天收集患者血浆样本。
(2)对不少于38例手术治疗的肺癌患者进行动态监测：手术治疗前3天 内收集血浆样本1次，手术后3-7天内收集血浆样本1次、临床疗效评价(影像 学检查日期)前后3天内取样1次，共计至少3次。
(3)对不少于100例内科治疗的肺癌患者进行动态监测：治疗开始前收集 血浆样本1次，治疗开始后，在每个治疗周期结束后收集样本1次，收集至4 个治疗周期结束。如果在结束某个治疗周期后对患者例行临床疗效评价(影像学 检查)，则此时收集样本的时间为临床疗效评价(影像学检查日期)前后3天内。
符合动态监测收集方案的既往血样也可以用于本试验研究。
1.1.3样本剔除标准
(1)肺内肿瘤病灶正在进行放疗的患者的样本；
(2)动态监测中，妊娠、哺乳期或有生育能力但在试验期间未采取避孕措 施者的样本；
(3)动态监测中，治疗前血浆Hsp90α含量初始值低于cut-off的样本；
(4)患有其他癌症的患者。
1.2检测试剂盒仪器
研究产品：
热休克蛋白90α定量检测试剂盒(酶联免疫法)，
规格：96人份/盒。来源：烟台普罗吉生物科技发展公司，
批号：20111018、20120109、20120505，有效期：6个月，保存条件： 2-8℃。
对比产品：
因国内外尚无同类型产品注册上市，故只采用肺癌的病理学诊断和临床诊断 作为评价和验证考核方法。
本次试验中，设立癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白19片段抗原21-1 (CYFRA21-1)为本产品的参比试剂，侧面考察试剂盒的临床性能。
实施例2
2.主要结果概要
2.1非动态监测组
本研究非动态监测组共入组2036例(肺癌患者组:1046例、其他恶性肿瘤 组:37例、肺部非癌性病变组:344例、肺部良性肿瘤组:17例、健康人群组:592 例)，其中符合方案的病例有2036例，无剔除受试者。详细情况参见表8.1.1.1- 表8.1.1.2。各中心病例分布见详表8.1.1.3。
Hsp90α诊断性能评价
为评价Hsp90α诊断肺癌与非癌症性能，剔除患有恶性肿瘤的受试者，共计 1999例纳入分析，其中肺癌组1046例，非癌症组953例。两组受试者的人口 学信息及肺癌组基本诊断分类情况详见表8.1.1.1.1.1-表8.1.1.1.1.2。
两组Hsp90α的检测结果组间差异有统计学意义(P<0.0001)，详见表8.1.1.1.2.1。
Hsp90α诊断肺癌的ROC曲线下面积为0.8149，通过最大youden指数确定 最佳cut-off值为＞56.33ng/ml，对应灵敏度为72.18％，95％可信区间为(69.46％, 74.90％)，特异度为78.7％，95％可信区间为(76.10％,81.30％)。另外还分别 描述特异度为80％、85％、90％及95％时对应的灵敏度及其他诊断性能指标， 详见图1和表8.1.1.1.2.2-8.1.1.1.2.3。
此外，Hsp90α分别诊断肺腺癌、肺鳞癌、小细胞肺癌的ROC曲线与肺癌总 体的ROC曲线相似；单独对比肺癌与相关疾病，两组Hsp90α的检测结果组间 差异有统计学意义(P<0.0001)。
Hsp90α与CEA诊断性能及联合诊断评价
为评价两者诊断性能，采用Hsp90α与CEA检测结果均不为缺失的受试者 为评价人群，共计1056例纳入分析，其中肺癌组713例，非癌症组343例。以 Hsp90αcut-off值为＞56.33，CEA cut-off值为＞5，任意一个为阳性即判断为阳性 进行联合诊断评价，进一步提高了诊断灵敏度。
Hsp90α与CYFRA21-1诊断性能及联合诊断评价
为评价两者诊断性能，采用Hsp90α与CYFRA21-1检测结果均不为缺失的 受试者为评价人群，共计910例纳入分析，其中肺癌组660例，非癌症组250 例。以Hsp90αcut-off值为＞56.33，CYFRA21-1 cut-off值为＞5，任意一个为阳性 即判断为阳性进行联合诊断评价，进一步提高了诊断灵敏度。
2.2行外科手术组
共106例受试者入选本次评价，其中不低于cut-off值的有效受试者79例， 手术前后Hsp90α检测结果差异有统计学意义(P＝0.0062<0.01)，详见表8.2.2。
2.3内科动态组
本次评价共入选肺癌受试者202例，其中有效受试者169例。人口学及基 本资料详见表8.3.1.1。
分段评价
分段评价共获得284个有效统计单元，其中肿瘤缩小组69例，肿瘤不变组161例，肿瘤增大组54例，三组治疗第二周期Hsp90α检测值相对基线变化值 中位数分别为-48.64ng/ml、-8.51ng/ml、74.66ng/ml，三组间变化值经秩和检 验差异有统计学意义(P<0.0001)，组内治疗前后均有统计学意义，变化百分比 中位数分别为-41.09％、-9.46％、65.26％。
Hsp90α检测值诊断肿瘤大小增大ROC曲线下面积为0.7719，根据youden 指数确定最佳cut-off点为相对基线变化＞34.17％，对应灵敏度为70.37％，95％ 可信区间为(58.19％,82.55％)，特异度为80％，95％可信区间为(74.83％, 85.17％)，详见表8.3.2.3.2。
按病例评价
按病例评价共获得275个有效病例，其中PR组95例，SD组118例，PD 组62例，三组获得评价时Hsp90α检测值相对基线变化值中位数分别为 -90.98ng/ml、-32.91ng/ml、80.32ng/ml，三组间变化值经秩和检验差异有统计 学意义(P<0.0001)，组内治疗前后均有统计学意义，变化百分比中位数分别为 -48.16％、-22.23％、71.40％。
Hsp90α检测值诊断PD ROC曲线下面积为0.8406，根据youden指数确定 最佳cut-off点为相对基线变化＞34.17％，对应灵敏度为72.58％，95％可信区间 为(61.48％,83.68％)，特异度为85.45％，95％可信区间为(80.71％,90.18％)， 详见表8.3.3.2.2。
实施例3
3.统计分析结果
3.1非动态检测组
表8.1.1.1入组受试者及分析数据集
Figure BDA0002455732490000091
表8.1.1.2非动态受试者病例分布
Figure BDA0002455732490000101
3.1.1肺癌组与非癌症组
3.1.1.1Hsp90α诊断性能评价
3.1.1.1.1受试者特征
表8.1.1.1.1.1所有受试者人口学信息
Figure BDA0002455732490000102
表8.1.1.1.1.2肺癌受试者诊断情况
Figure BDA0002455732490000111
3.1.1.1.2 Hsp90α诊断性能评价(肺癌组与非癌症组)
表8.1.1.1.2.1两组受试者Hsp90α检测结果
Figure BDA0002455732490000112
图1是Hsp90α检测结果的ROC曲线(基于所有检测Hsp90α的受试者)。
表8.1.1.1.2.2根据Hsp90α检测结果的cut-off值判定的四格表
Figure BDA0002455732490000121
表8.1.1.1.2.3根据Hsp90α检测结果的cut-off值判定的诊断结果
Figure BDA0002455732490000122
注：TP，真阳性；TN，真阴性；FP，假阳性；FN，假阴性；PPV，阳性预 测值；NPV，阴性预测值；LR+，阳性似然比；LR-，阴性似然比；DOR，diagnostic accuracy odds ratio；
表8.1.1.1.2.4 I、II期肺癌组与III、IV期肺癌组之间Hsp90α值的差异
Figure BDA0002455732490000123
3.1.1.1.3 Hsp90α诊断性能评价(腺癌组与非癌症组)
图2是Hsp90α检测结果的ROC曲线AUC 95％CI(0.788,0.829)。
3.1.1.1.4 Hsp90α诊断性能评价(鳞癌组与非癌症组)
图3是Hsp90α检测结果的ROC曲线AUC 95％CI(0.811,0.854)。
3.1.1.1.5 Hsp90α诊断性能评价(小细胞癌组与非癌症组)
图4是Hsp90α检测结果的ROC曲线AUC 95％CI(0.804,0.850)。
3.1.1.1.6 Hsp90α诊断性能评价(肺癌组与肺部相关疾病组)
表8.1.1.1.6.1两组受试者Hsp90α检测结果
Figure BDA0002455732490000131
图5是Hsp90α检测结果的ROC曲线AUC 95％CI(0.731,0.777)。
表8.1.1.1.6.28根据90α检测结果的cut-off值判定的诊断结果
Figure BDA0002455732490000132
3.1.1.2 Hsp90α与CEA诊断性能
3.1.1.2.1受试者特征
表8.1.1.2.1.1所有受试者人口学信息
Figure BDA0002455732490000133
表8.1.1.2.1.2肺癌受试者诊断情况
Figure BDA0002455732490000141
3.1.1.2.2 Hsp90α与CEA诊断性能评价(肺癌组与非癌症组)
表8.1.1.2.2.1两组受试者Hsp90α与CEA的检测结果
Figure BDA0002455732490000142
3.1.1.2.2.1 Hsp90α与CEA联合诊断性能评价(肺癌组与非癌症组)
表8.1.1.2.2.3.1 Hsp90α与CEA联合诊断(任意阳性即判定为阳性)的四格表
Figure BDA0002455732490000151
注：*Hsp90αcut-off值为56.33，CEA cut-off值为5。
**Hsp90αcut-off值为56.33，CEA cut-off值为4.74。
表8.1.1.2.2.3.2 Hsp90α与CEA联合诊断判定的诊断结果
Figure BDA0002455732490000152
注：TP，真阳性；TN，真阴性；FP，假阳性；FN，假阴性；PPV，阳性预 测值；NPV，阴性预测值；LR+，阳性似然比；LR-，阴性似然比；DOR，diagnostic accuracy odds ratio；
3.1.1.3 Hsp90α与CYFRA21-1诊断性能
3.1.1.3.1受试者特征
表8.1.1.3.1.1所有受试者人口学信息
Figure BDA0002455732490000153
表8.1.1.3.1.2肺癌受试者诊断情况
Figure BDA0002455732490000161
3.1.1.3.2 Hsp90α与CYFRA21-1诊断性能评价(肺癌组与非癌症组)
表8.1.1.3.2.1.1两组受试者Hsp90α与CYFRA21-1的检测结果
Figure BDA0002455732490000162
3.1.1.3.2.1 Hsp90α与CYFRA21-1联合诊断性能评价(肺癌组与非癌症组)
表8.1.1.3.2.3.1 Hsp90α与CYFRA21-1联合诊断(任意阳性即判定为阳性) 的四格表
Figure BDA0002455732490000171
注：*Hsp90αcut-off值为56.33ng/ml，CYFRA21-1cut-off值为5。
**Hsp90αcut-off值为56.33ng/ml，CYFRA21-1cut-off值为3.1。
表8.1.1.3.2.3.2 Hsp90α与CYFRA21-1联合诊断判定的诊断结果
Figure BDA0002455732490000172
注：TP，真阳性；TN，真阴性；FP，假阳性；FN，假阴性；PPV，阳性预 测值；NPV，阴性预测值；LR+，阳性似然比；LR-，阴性似然比；DOR，diagnostic accuracy odds ratio；
3.2行外科手术组
表8.2.1手术受试者分布
Figure BDA0002455732490000173
表8.2.2行外科手术的受试者治疗前后Hsp90α的变化情况
Figure BDA0002455732490000181
3.3内科动态
3.3.1受试者特征
表8.3.1.1受试者基本信息情况
Figure BDA0002455732490000182
3.3.2分段评价
表8.3.2.1不同组间各次访视热休克蛋白检测值
Figure BDA0002455732490000191
表8.3.2.2不同组间各次访视热休克蛋白检测值比较
Figure BDA0002455732490000201
图6是根据斜率判定肿瘤增大的ROC曲线。
表8.3.2.3.1根据相对基线变化百分比判定肿瘤增大四格表
Figure BDA0002455732490000202
表8.3.2.3.2基于不同相对基线变化百分比界值下肿瘤增大诊断结果
Figure BDA0002455732490000211
注：TP，真阳性；TN，真阴性；FP，假阳性；FN，假阴性；PPV，阳性预 测值；NPV，阴性预测值；LR+，阳性似然比；LR-，阴性似然比；DOR，diagnostic accuracy odds ratio；
3.3.3受试者评价
表8.3.3.1不同疗效判定间各次访视热休克蛋白检测值比较
Figure BDA0002455732490000212
注：PR、SD的基线是治疗前的检测值，PD的基线是病灶大小最小时的检测 值
图7是根据变化百分比判定PD的ROC曲线。
表8.3.3.2.1根据变化百分比判定PD四格表
Figure BDA0002455732490000221
表8.3.3.2.2基于检测值变化百分比的疾病进展诊断结果
Figure BDA0002455732490000222
注：TP，真阳性；TN，真阴性；FP，假阳性；FN，假阴性；PPV，阳性预 测值；NPV，阴性预测值；LR+，阳性似然比；LR-，阴性似然比；DOR，diagnostic accuracy odds ratio；
图8是根据变化值判定PD的ROC曲线。
表8.3.3.3.1根据变化值判定PD四格表
Figure BDA0002455732490000231
表8.3.3.3.2基于不同阈值的变化趋势，所对应的疾病进展诊断结果
Figure BDA0002455732490000232
注：TP，真阳性；TN，真阴性；FP，假阳性；FN，假阴性；PPV，阳性预 测值；NPV，阴性预测值；LR+，阳性似然比；LR-，阴性似然比；DOR，diagnostic accuracy odds ratio
实施例4
一、抗凝剂干扰评估资料(证明EDTA-K2对检测无影响)
实验样本
Hsp90α试剂盒，EDTA-K2，校准品1套
实验方法
配置EDTA-K2溶液300mg/mL，向Hsp90α浓度分别为400ng/mL、200 ng/mL的溶液(各1mL)中加入4μL EDTA-K2溶液，最后抗凝剂终浓度为3 mg/mL。同时平行配制一组不加抗凝剂的、对应浓度的Hsp90α蛋白溶液。平行 检测加抗凝剂与不加抗凝剂蛋白溶液浓度，每个浓度重复6次，平均值见下表。
实验结果
浓度(ng/mL) 不加抗凝剂(ng/mL) 加抗凝剂(ng/mL) 偏差(％)
400 328 338 2.9
200 200 224 12.2
结论：由结果可看出，抗凝剂不影响本试剂盒检测结果。
二.不同采血管干扰评估资料
实验样本
Hsp90α试剂盒，EDTA-K2采血管(血浆管)，EDTA-K3采血管(血浆管)， 血清管
实验方法
同时使用不同采血管收集同一人的血样，使用试剂盒同时检测不同采血管收 集的样本，每个样本重复检测2次。计算不同采血管的检测值差异。
实验结果
1、EDTA-K2采血管，EDTA-K3采血管对比
健康人5例和肿瘤病人4例，
图9是EDTA-K3采血管样本与EDTA-K2采血管样本的对比。
结果：在正常人中，EDTA-K3管样本比EDTA-K2管样本检测值平均低4.37％； 在癌症患者中，EDTA-K3管样本比EDTA-K2管样本检测值平均低26.95％。因此 如果选用EDTA-K3管收集样本，那么会导致阳性标本的Hsp90α值减低。
2、血浆管与血清管对比
非恶性肿瘤的一般性疾病共148例
Figure BDA0002455732490000241
结论：通过148个不同的非恶性肿瘤的一般性疾病的对比，血清Hsp90α比血 浆中Hsp90α含量高低27.8％。如果使用血清作为样本，会导致阳性阈值的降低。
3、EDTA-K2采血管与肝素采血管对比
非恶性肿瘤的一般性疾病共30例
Figure BDA0002455732490000242
结论：通过30个不同的非恶性肿瘤一般性疾病的对比，肝素采血管样本检 测值比EDTA-K2采血管样本检测值高19.9％。如果使用肝素采血管收集样本， 会导致阳性阈值的升高。
实施例5
采用非动态监测，即将单次检测结果与病理学诊断和临床诊断结果比对的方 法，对Hsp90α定量检测试剂盒在肝癌诊断中的有效性进行评价。对于患者进行 动态监测，即通过跟踪检测肝癌患者在治疗过程中的血浆Hsp90α含量变化，对 Hsp90α定量检测试剂盒在肝癌疗效评价中的有效性进行评价。
一、试验方案总体设计
1、试验要求
研究采用盲法，即在组别等信息未知的情况下，用Hsp90α定量检测试剂盒 对标本进行Hsp90α含量的检测，并对结果进行比较分析，计算检测结果与病理 学、临床诊断结果、患者疗效评价符合或差异程度的统计学指标，再根据这些指 标对Hsp90α定量检测试剂盒的临床应用性能进行评价。
2、样本采集、保存、运输方法
样本分为非动态监测样本和动态监测样本。非动态监测样本为临床常规检 验后剩余的血浆样本；动态监测样本为入组患者定期采集的血浆样本或定期常规 检验的剩余样本。
所有血浆样本的采集和保存都必须符合Hsp90α定量检测试剂盒使用说明书 的规定：采集静脉血，收集血样装在EDTA-K2抗凝管中，颠倒8-10次。离心分 离血浆(800-1000g，10分钟)，将血浆分装至EP管中(每份不少于250μL)， 迅速放置于-18℃以下冷冻保存。
3、样本选择标准
3.1非动态监测样本的选择
研究对象包括：肝癌组和非肝癌组。
(1)肝癌组：经病理学诊断确诊为肝癌患者的样本，包括肝癌的不同类型 和不同分期。
(2)非肝癌组：经临床生化、影像或病理学方法证实未患肝癌的人群，包 括确定无明显疾病症状的健康人和确定无肝癌但有肝部其他良性相关疾病人群 的样本(如肝炎、肝硬化等)。
健康人定义：无任何已知的良性或恶性疾病、外表正常、无任何可见疾病症 状、临床生化检测结果正常的人。
对于相关疾病患者，如需要做影像学或病理学进行确诊的，应由影像学或病 理学确诊为非癌症病变。
3.2动态监测样本的选择
对规范的手术治疗或内科治疗的肝癌患者进行随访监测，检验血浆中 Hsp90α浓度的变化与患者病情变化的相关性。
血浆样本的收集时间点为：
(1)行手术治疗肝癌患者的动态监测：手术前3天内收集血浆样本1次， 手术后14天内收集血浆样本1次。
(2)行内科治疗肝癌患者的动态监测：治疗开始前收集血浆样本1次，治 疗开始后，在每个治疗周期结束后收集样本1次，血样的收集至少持续到患者完 成第一次疗效评价。
3.3样本剔除标准
(1)动态监测中，妊娠、哺乳期或有生育能力但在试验期间未采取避孕措 施者的样本；
(2)术后进行辅助治疗的患者的样本；
(3)处于放射治疗期的患者的样本；
(4)患有其他癌症的患者。
二、临床评价标准
1、在非动态监测中，参照病理学金标准评价本检测的灵敏度、特异度和符 合率；
2、在动态监测中，参照CT结果评价本检测的灵敏度、特异度和符合率， 即考察血浆中Hsp90α含量的变化与治疗效果的对应性。
三、统计处理方法
对计量资料，采用均数±标准差等描述；对计数资料，采用例数和百分比来 描述。
根据数据类型，分别选择适当的统计分析方法，如t检验/秩和检验/卡方检 验/精确概率等方法。
将灵敏度和特异度分别作为坐标轴绘制ROC曲线，并计算ROC曲线下面 积和95％CI，以评价辅助诊断的价值。
进行一致性比较，计算阳/阴性一致百分比。
通过SPSS软件统计产品测定临床样本Hsp90α浓度值，得出Hsp90α与疾病 的相关性和直线回归分析(ROC曲线)。
四、临床研究结果及分析
1、非动态监测样本数据统计结果
(1)非动态样本数据集构成，见表9.1
表9.1非动态样本数据集构成
Figure BDA0002455732490000261
(2)ROC曲线(肝癌组相对于健康人组)，见图10。
(3)诊断评价指标(肝癌组相对于健康人组)，见表9.2：
表9.2：肝癌组相对于健康人组ROC曲线提示的诊断评价指标
Figure BDA0002455732490000271
(4)ROC曲线(肝癌相对于非癌肝部相关疾病组)，见图11。
(5)诊断评价指标(肝癌组相对于非癌肝部相关疾病组)，见表9.3：
表9.3：肝癌组相对于非癌肝部相关疾病组ROC曲线提示的诊断评价指标
Figure BDA0002455732490000272
(6)行外科手术组动态监测数据统计结果(69例)，见表9.4
表9.4手术前后检测值变化分析
Figure BDA0002455732490000273
结果表明，术后血浆中Hsp90α含量比术前显著降低，结果具有显著统计学意义。
(7)肝癌介入治疗患者病情监测和疗效评价结果(9例)
接受介入治疗的9例患者中，4例临床获益的患者(患者编号001-004)治 疗后检测值降低，5例疾病进展的患者治疗后检测值升高，体现了检测值与患者 病情之间有良好的对应性，见表9.5：
表9.5肝癌介入治疗疗效评价结果
患者编号 治疗前检测值(ng/ml) 治疗后检测值(ng/ml)
001 63 35
002 184 128
003 122 66
004 133 77
005 256 400
006 130 226
007 47 109
008 31 66
009 99 108
实施例6
采用与病理学诊断和临床诊断结果比对的方法，对Hsp90α定量检测试剂盒 在结直肠癌诊断中的有效性进行评价。对于患者进行动态监测，通过跟踪治疗过 程中的血浆Hsp90α含量变化，对Hsp90α定量检测试剂盒在结直肠癌疗效评价 中的有效性进行评价。
一、试验方案总体设计：同实施例5相关内容，适应症改为结直肠癌，非癌 结直肠相关疾病包括结直肠息肉、炎症等。
二、临床评价标准：同实施例5相关内容
三、统计处理方法：同实施例5相关内容。
四、临床研究结果及分析
1、非动态监测样本数据统计结果
(1)非动态样本数据集构成，见表10.1
表10.1非动态样本数据集构成
Figure BDA0002455732490000281
(2)ROC曲线(结直肠癌组相对于健康人及非癌结直肠相关疾病组)，见图12。
(3)诊断评价指标(结直肠癌组相对于健康人及非癌结直肠相关疾病组)，见表10.2。
表10.2：结直肠癌组相对于健康人及非癌结直肠相关疾病组ROC曲线提示的诊 断评价指标
Figure BDA0002455732490000291
(4)行外科手术组动态监测数据统计结果(101例)，见表10.3。
表10.3手术前后检测值变化分析
Figure BDA0002455732490000292
结果表明，术后血浆中Hsp90α含量比术前显著降低，结果具有统计学意义。
(5)行内科治疗获益(CR+PR+SD)的结直肠癌患者疗效评价结果(10例)，
其中9例检测值均降低，检测值与疗效相关性良好，见表10.4。
表10.4经内科治疗获益的结直肠癌患者检测结果
Figure BDA0002455732490000293
Figure BDA0002455732490000301
实施例7
采用与病理学诊断和临床诊断结果比对的方法，对Hsp90α定量检测试剂盒 在乳腺癌诊断中的有效性进行评价。对于患者进行动态监测，通过跟踪治疗过程 中的血浆Hsp90α含量变化，对Hsp90α定量检测试剂盒在乳腺癌疗效评价中的 有效性进行评价。
一、试验方案总体设计：同实施例5相关内容，适应症改为乳腺癌，非癌乳腺相 关疾病包括乳腺炎、乳腺增生等。
二、临床评价标准：同实施例5相关内容
三、统计处理方法：同实施例5相关内容。
四、临床研究结果及分析
1、非动态监测样本数据统计结果
(1)非动态样本数据集构成，见表11.1
表11.1非动态样本数据集构成
Figure BDA0002455732490000302
(2)ROC曲线(乳腺癌组相对于健康人组)，见图13。
(3)诊断评价指标(乳腺癌组相对于健康人组)，见表11.2。
表11.2乳腺癌组相对于健康人组ROC曲线提示的诊断评价指标
Figure BDA0002455732490000303
(4)ROC曲线(乳腺癌相对于非癌乳腺相关疾病组)，见图14。
(5)诊断评价指标(乳腺癌组相对于非癌乳腺相关疾病组)，见表11.3。
表11.3乳腺癌组相对于非癌乳腺相关疾病组ROC曲线提示的诊断评价指标
Figure BDA0002455732490000311
(6)行外科手术组动态监测数据统计结果(26例)，见表11.4。
表11.4手术前后检测值变化分析
Figure BDA0002455732490000312
(7)行内科化疗临床获益(CR+PR+SD)的乳腺癌患者化疗前和化疗后血浆 Hsp90α动态监测数据统计结果(18例)显示，获得临床受益的患者检测值下降， 结果具有显著统计学意义，见表11.5。
表11.5经内科治疗获益的乳腺癌患者检测结果
Figure BDA0002455732490000313
实施例8
采用与病理学诊断和临床诊断结果比对的方法，对Hsp90α定量检测试剂盒在 多种癌症诊断中的有效性进行评价。结果显示，与健康人相比，胃癌、胰腺癌、 卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌、 前列腺癌等多种癌症患者血浆Hsp90α含量均显著升高(见图15)，并且结果具 有显著统计学意义。经统计，各瘤种平均值分别如表12.1所示：
表12.1其他癌症血浆Hsp90α含量平均值
Figure BDA0002455732490000321

Claims (11)

1.确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的方法，包括检测该受试者的血液样本中Hsp90α的浓度，如果该浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中所述阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围内，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述阈值±15％范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地，所述血液样本为血浆样本。
2.用于对正在接受治疗的癌症患者进行病情监测和/或疗效评价或者用于对候选治疗药物进行疗效评价的方法，包括在治疗前及治疗后分别检测受试者的血液样本中Hsp90α的浓度，如果治疗后Hsp90α的浓度相对于治疗前Hsp90α浓度增加的百分比达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者病情进展和/或疗效较差，或者判定所述候选治疗药物疗效较差，其中所述阈值选自10％到50％的范围内，例如所述阈值可以为34％，且所述阈值±15％范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地，所述血液样本为血浆样本。
3.确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的方法，包括联合检测该受试者的血液样本中Hsp90α的浓度以及至少一种其他肿瘤标志物的浓度，如果Hsp90α的浓度和所述至少一种其他肿瘤标志物的浓度达到或超过预先设定的阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中Hsp90α的阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围内，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述阈值±15％范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地，所述血液样本为血浆样本。
4.权利要求1-3之任一项的方法，其中所述癌症选自由肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌和前列腺癌构成的组。
5.权利要求3-4之任一项的方法，其中所述至少一种其他肿瘤标志物选自由CEA、CYFRA21-1、AFP、CA19-9、CA125、CA15-3、PSA和CA72-4构成的组。
6.权利要求1-5之任一项的方法，其中所述Hsp90α的浓度采用EDTA-K2作为抗凝剂进行检测。
7.用于确定受试者是否患有癌症或者具有罹患癌症风险的试剂盒，包括：任选的人分泌型Hsp90α、人分泌型Hsp90α单克隆抗体、检测试剂以及说明书，其中所述说明书中标明了健康人血液样本中Hsp90α浓度的阈值，如果受试者的血液样本中Hsp90α的浓度达到或超过所述阈值，则判定该受试者患有癌症或者具有罹患癌症的风险，其中所述阈值选自50ng/ml到120ng/ml的范围，例如所述阈值可以为50、53、56、62、63、64、67、72、82、85或117ng/ml，且所述阈值±15％范围内的数值均被视为具有等同判定意义；优选地，所述血液样本为血浆样本。
8.权利要求7的试剂盒，其中所述癌症选自由肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、胃癌、胰腺癌、卵巢癌、淋巴瘤、食管癌、黑色素瘤、肾癌、子宫癌、鼻咽癌、骨肉瘤、膀胱癌和前列腺癌构成的组。
9.权利要求7-8之任一项的试剂盒，其中所述试剂盒中包括用于采集血液样本的容器，并且该容器中包含EDTA-K2、EDTA-K3或肝素；优选地，所述容器为包含EDTA-K2的采血管。
10.权利要求7-9之任一项的试剂盒，其中所述Hsp90α的浓度采用EDTA-K2作为抗凝剂进行检测。
11.EDTA-K2作为抗凝剂在收集用于Hsp90α肿瘤标志物检测的血液样本中的用途。
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