CN111592670A - γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种γ‑聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，其特征在于，将壳聚糖与聚乙二醇2000混合，向其中加入冰醋酸溶液，水浴条件下充分溶解；待壳聚糖溶解后，向体系中加人γ‑聚谷氨酸，充分溶解之后加入戊二醛，进行聚合反应，得到铸膜液；将铸膜液流延于水平放置的洁净玻璃板上，置于烘箱中干燥，然后将得到的膜置于硫酸溶液浸泡交联；将得到的膜先用NaOH溶液冲洗，再用蒸馏水冲洗，直至冲洗液检测不出γ‑聚谷氨酸的存在，最后将膜晾干成型。非分子印迹膜与印迹膜制备方法相同，只是不加入模板分子。为了方便起见，我们把分子印迹膜简称为MIP，非分子印迹膜为NIP。

Description

γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法
技术领域
本发明涉及一种分子印迹聚合物膜的制备方法，尤其是一种对γ-聚谷氨酸高选择性吸附的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法。
背景技术
γ-聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是由D型或L型谷氨酸通过γ-酰胺键连接而成的高分子氨基酸均聚物，相对分子量一般在10～100万道尔顿之间，易溶于水，难溶于乙醇等有机溶剂，易在酸性、碱性、高温条件下降解，其降解产物无毒。γ-聚谷氨酸是属于α-螺旋和β-折叠的含量都较高的生物大分子，γ-聚谷氨酸的二级结构对pH、SDS和乙醇具有一定的稳定性，对热变性比较敏感。γ-DL-聚谷氨酸随溶液pH、离子强度及浓度的不同，分子构象会发生明显变化。枯草芽孢杆菌生产的γ-DL-聚谷氨酸在酸性溶液中是平行的β-折叠结构，在接近中性时是无规卷曲的结构，在碱性环境中是伸展的随机结构。γ-聚谷氨酸具有增稠、凝胶、乳化、成膜、保湿和黏接等功能，正逐渐应用于化妆品、食品加工、农业、医药和环保等领域。基因改造技术和发酵工艺优化大大提高了γ-聚谷氨酸的产能，而如何高效的分离纯化γ-聚谷氨酸便成为下一步的挑战。目前，γ-聚谷氨酸的分离工艺多采用传统的蛋白质分离方法，如有机溶剂沉淀法、化学沉淀法和膜分离沉淀法等。也有一些新颖的分离技术和方法，如离子交换法、双水相法、超声波辅助法等。然而传统方法中，使用大量有机溶剂，耗时耗力，并且对环境会产生大量污染，因此，亟需一种γ-聚谷氨酸环境友好型的高效提取方法。
分子印迹技术(molecular imprinting technology MIT)其基本原理是将模板分子(待分离、识别的分子)同具有适合官能团的功能单体相互作用，在交联剂和引发剂的作用下形成具有大孔、网状的聚合物，通过溶剂洗脱或在一定条件下水解除去模板分子，聚合物中就留下了大小、形状及功能基团与模板分子匹配的“记忆”空穴，这样的空穴便可以与混合物中待分离的模板分子进行特异性的亲和作用，从而达到分离、纯化、预富集模板分子等，但是，迄今为止未见关于制备γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的相关报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种对γ-聚谷氨酸高选择性吸附的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明的提供的技术方案是：
一种γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将壳聚糖与聚乙二醇2000混合，向其中加入冰醋酸溶液，水浴条件下充分溶解；
步骤2)：待壳聚糖溶解后，向体系中加人γ-聚谷氨酸，充分溶解之后加入戊二醛，进行聚合反应，得到铸膜液；
步骤3)：将铸膜液流延于水平放置的洁净玻璃板上，置于烘箱中干燥，然后将得到的膜置于硫酸溶液浸泡交联；
步骤4)：将步骤3)得到的膜先用NaOH溶液冲洗，再用蒸馏水冲洗，直至冲洗液检测不出γ-聚谷氨酸的存在，最后将膜晾干成型。
优选地，所述步骤1)中壳聚糖与聚乙二醇2000的质量比为2.5：(0.55～0.65)；冰醋酸溶液的质量浓度为2％，其加入量为：每1g壳聚糖加入40mL；水浴的温度为40℃。
优选地，所述步骤2)中壳聚糖与γ-聚谷氨酸的质量比为2.5：(0.30～0.75)；所述戊二醛的加入量为每2.5g壳聚糖加入1.0～1.7mL；聚合反应的条件为：
37～40℃，10～14h。
优选地，所述步骤2)中γ-聚谷氨酸的制备方法为：
步骤a)：枯草芽孢杆菌的培养：
将枯草芽孢杆菌接种于斜面培养基中，在恒温培养箱中37℃培养12h，作为活化菌种；
将活化后的菌种挑取一环接种于种子培养基中，摇床转速为220r/min，37℃振荡培养15h作为种子液；
按5wt％的接种量将所得的种子液接种到液体发酵培养基中，摇床转速为220r/min，37℃振荡培养24h得到含有产物的发酵液；
步骤b)：发酵液预处理：
将发酵液在8000r/min离心15min以去除菌体，取上清液；
步骤c)：提取发酵液中的γ-聚谷氨酸：
将得到的上清液的pH值调至2，添加四倍乙醇-4℃冷藏24h，在8000r/min离心10min，获得γ-聚谷氨酸沉淀物；
步骤d)：对γ-聚谷氨酸沉淀加少量蒸馏水溶解进行透析，将透析得到的浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸粗品；
步骤e)：将γ-聚谷氨酸粗品溶于蒸馏水中，再次进行透析，浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸纯品。
更优选地，所述步骤a)中的枯草芽孢杆菌采用Bacillus subtilis GIM1.286；恒温培养箱的温度为37℃，培养时间为12h；第一次振荡培养的摇床转速为220r/min，温度为37℃，时间为15h；种子液的接种量为按质量百分比5％的接种量将所得的种子液接种到液体发酵培养基中；第二次振荡培养的摇床转速为220r/min，温度为37℃，时间为24h。
更优选地，所述步骤a)中种子培养基的成分包括：蔗糖30g/L、牛肉膏10g/L、谷氨酸钠30g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、K2HPO4·3H2O 0.5g/L，pH值为7.5，灭菌条件为121℃、20min；所述液体发酵培养基的成分包括：蔗糖30g/L、牛肉膏8g/L、谷氨酸钠30g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、K2HPO4·3H2O 0.5g/L，pH值为7.5；灭菌条件为121℃、20min。
优选地，所述步骤4)中NaOH溶液的质量浓度为2.5％。
优选地，所述步骤4)中检测γ-聚谷氨酸的方法采用CTAB比浊法。
本发明还提供了上述γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法所制得的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜。
本发明还提供了一种多功能生物吸附材料，其特征在于，包括至少一层上述γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜。
本发明是以壳聚糖功能单体，以戊二醛为交联剂、聚乙二醇2000为致孔剂，并按照特定比例及生产条件等，生产出具有非常高的选择性和特异性的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜，有较高的稳定性、较长的使用寿命和较强的抗恶劣环境能力。本发明成本低廉、操作简单、反应条件容易控制。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明所制备的印迹复合膜成本低廉，可以大规模投产使用；
2、本发明所制备得到的分子印迹复合膜环境友好，不含有有害物质；
3、本发明所制备得到的分子印迹复合膜具有较强的饱和吸附容量。
附图说明
图1为实施例2制得的膜对不同浓度的γ-聚谷氨酸溶液吸附能力示意图；
图2是实施例2制得的膜对3.0～7.5mg/mL浓度的γ-聚谷氨酸溶液吸附动力学曲线。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
一种γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，包括以下步骤：
a.称取2.5g壳聚糖和0.55g聚乙二醇2000于烧瓶中，向其中加入100mL2wt％冰醋酸溶液和，在37℃水浴条件下充分溶解；
b.待壳聚糖溶解后，向体系中加人0.5gγ-聚谷氨酸，充分溶解之后加入1.3mL戊二醛；40℃下聚合12h；
c.将铸膜液流延于水平放置的洁净玻璃板上，置烘箱干燥继而将膜置于硫酸溶液浸泡交联；
d.将处理后的膜先用2.5wt％NaOH溶液反复冲洗；取出膜，用蒸馏水反复冲洗，直至冲洗液检测不出γ-聚谷氨酸的存在(用CTAB比浊法检测不出谷氨酸的存在)，将膜晾干成型。
根据以上步骤制备的分子印迹膜的吸附量为107.34±3.02mg/g。
实施例2
一种γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，包括以下步骤：
a.称取2.5g壳聚糖和0.55g聚乙二醇2000于烧瓶中，向其中加入100mL2wt％冰醋酸溶液和，在40℃水浴条件下充分溶解；
b.待壳聚糖溶解后，向体系中加人0.5gγ-聚谷氨酸，充分溶解之后加入1.5mL戊二醛；40℃下聚合12h；
c.将铸膜液流延于水平放置的洁净玻璃板上，置烘箱干燥继而将膜置于硫酸溶液浸泡交联；
d.将处理后的膜先用2.5wt％NaOH溶液反复冲洗；取出膜，用蒸馏水反复冲洗，直至冲洗液检测不出γ-聚谷氨酸的存在(用CTAB比浊法检测不出谷氨酸的存在)，将膜晾干成型。
根据以上步骤制备的分子印迹膜的吸附量为121.55±2.47mg/g。
吸附性能试验：将10mL一系列浓度变化(3.0～7.5mg/mL)的γ-聚谷氨酸溶液分别置于25mL具塞锥形瓶中，分别向其中放入一片实施例2的印迹膜和非印迹膜，将其放在微量振荡器上室温振荡2h，振荡完毕后静置10min，取适量的上清液用蒸馏水稀释到一定体积，用紫外分光光度计在A250下测定平衡吸附溶液中γ-聚谷氨酸的吸光度。结果如图1所示。
图1展示了实施例2的γ-聚谷氨酸分子印迹膜(MIP)和非印迹膜(NIP)对一系列浓度的γ-聚谷氨酸溶液(3.0～7.5mg/mL)的吸附能力，可以看出实施例2印迹膜的吸附能力强于非印迹膜并且两者的吸附能力都随着γ-聚谷氨酸起始浓度的升高而升高。MIP膜与NIP膜的吸附容量均随着吸附溶剂中γ-聚谷氨酸浓度的增加而增大，在同样的浓度下，MIP膜的吸附容量大于NIP膜，而且随浓度增加而增长的幅度大于NIP膜。在浓度为5mg/mL时，MIP膜的吸附容量(134.68±2.37mg/mL)即能达到NIP膜(59.44±1.04mg/mL)的2.27倍。
由于吸附动力学曲线不随底物起始浓度的改变而改变，而且γ-聚谷氨酸吸附量在浓度为5mg/L时有平稳的趋势，因此选择在此浓度下绘制吸附动力学曲线，如图2所示。由图2可知，实施例2印迹膜吸附速度快，吸附时间在20min时，即达到平衡吸附容量的60wt％(86.46±2.78mg/g)，40min时达到平衡吸附容量的80wt％(112.70±3.01mg/g)，60min时则基本达到平衡吸附容量(137.85±1.34mg/g)。快速的吸附动力学是得益于表面分子印迹合成法，吸附位点位于MIP膜的表面，避免了模板分子吸附过程中向聚合物内部传质的过程，缩短了吸附时间，这使得合成的MIP膜在特异性吸附分离中的应用有很大优势。
实施例3
一种γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，包括以下步骤：
a.称取2.5g壳聚糖和0.65g聚乙二醇2000于烧瓶中，向其中加入100mL2wt％冰醋酸溶液和，在40℃水浴条件下充分溶解；
b.待壳聚糖溶解后，向体系中加人0.5gγ-聚谷氨酸，充分溶解之后加入1.7mL戊二醛；43℃下聚合13h；
c.将铸膜液流延于水平放置的洁净玻璃板上，置烘箱干燥继而将膜置于硫酸溶液浸泡交联；
d.将处理后的膜先用2.5wt％NaOH溶液反复冲洗；取出膜，用蒸馏水反复冲洗，直至冲洗液检测不出γ-聚谷氨酸的存在(用CTAB比浊法检测不出谷氨酸的存在)，将膜晾干成型。
根据以上步骤制备的分子印迹膜的吸附量为116.20±3.50mg/g。
实施例4
一种γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，包括以下步骤：
a.称取2.5g壳聚糖和0.6g聚乙二醇2000于烧瓶中，向其中加入100mL 2wt％冰醋酸溶液和，在40℃水浴条件下充分溶解；
b.待壳聚糖溶解后，向体系中加人0.5gγ-聚谷氨酸，充分溶解之后加入1.3mL戊二醛；40℃下聚合12h；
c.将铸膜液流延于水平放置的洁净玻璃板上，置烘箱干燥继而将膜置于硫酸溶液浸泡交联；
d.将处理后的膜先用2.5wt％NaOH溶液反复冲洗；取出膜，用蒸馏水反复冲洗，直至冲洗液检测不出γ-聚谷氨酸的存在(用CTAB比浊法检测不出谷氨酸的存在)，将膜晾干成型。
根据以上步骤制备的分子印迹膜的吸附量为113.81±1.95mg/g。
实施例5
一种γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，包括以下步骤：
a.称取2.5g壳聚糖和0.6g聚乙二醇2000于烧瓶中，向其中加入100mL 2wt％冰醋酸溶液和，在40℃水浴条件下充分溶解；
b.待壳聚糖溶解后，向体系中加人0.5gγ-聚谷氨酸，充分溶解之后加入1.5mL戊二醛；37℃下聚合14h；
c.将铸膜液流延于水平放置的洁净玻璃板上，置烘箱干燥继而将膜置于硫酸溶液浸泡交联；
d.将处理后的膜先用2.5wt％NaOH溶液反复冲洗；取出膜，用蒸馏水反复冲洗，直至冲洗液检测不出γ-聚谷氨酸的存在(用CTAB比浊法检测不出谷氨酸的存在)，将膜晾干成型。
根据以上步骤制备的分子印迹膜的吸附量为118.64±3.34mg/g。
实施例6
一种γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，包括以下步骤：
a.称取2.5g壳聚糖和0.65g聚乙二醇2000于烧瓶中，向其中加入100mL2wt％冰醋酸溶液和，在40℃水浴条件下充分溶解；
b.待壳聚糖溶解后，向体系中加人0.5gγ-聚谷氨酸，充分溶解之后加入1.3mL戊二醛；40℃下聚合14h；
c.将铸膜液流延于水平放置的洁净玻璃板上，置烘箱干燥继而将膜置于硫酸溶液浸泡交联；
d.将处理后的膜先用2.5wt％NaOH溶液反复冲洗；取出膜，用蒸馏水反复冲洗，直至冲洗液检测不出γ-聚谷氨酸的存在(用CTAB比浊法检测不出谷氨酸的存在)，将膜晾干成型。
根据以上步骤制备的分子印迹膜的吸附量为109.29±0.53mg/g。

Claims (10)

1.一种γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)：将壳聚糖与聚乙二醇2000混合，向其中加入冰醋酸溶液，水浴条件下充分溶解；
步骤2)：待壳聚糖溶解后，向体系中加人γ-聚谷氨酸，充分溶解之后加入戊二醛，进行聚合反应，得到铸膜液；
步骤3)：将铸膜液流延于水平放置的洁净玻璃板上，置于烘箱中干燥，然后将得到的膜置于硫酸溶液浸泡交联；
步骤4)：将步骤3)得到的膜先用NaOH溶液冲洗，再用蒸馏水冲洗，直至冲洗液检测不出γ-聚谷氨酸的存在，最后将膜晾干成型。
2.如权利要求1所述的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中壳聚糖与聚乙二醇2000的质量比为2.5：(0.55～0.65)；冰醋酸溶液的质量浓度为2％，其加入量为：每1g壳聚糖加入40mL；水浴的温度为40℃。
3.如权利要求1所述的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中壳聚糖与γ-聚谷氨酸的质量比为2.5：(0.30～0.75)；所述戊二醛的加入量为每2.5g壳聚糖加入1.0～1.7mL；聚合反应的条件为：37～40℃，10～14h。
4.如权利要求1所述的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中γ-聚谷氨酸的制备方法为：
步骤a)：枯草芽孢杆菌的培养：
将枯草芽孢杆菌接种于斜面培养基中，在恒温培养箱中37℃培养12h，作为活化菌种；
将活化后的菌种挑取一环接种于种子培养基中，摇床转速为220r/min，37℃振荡培养15h作为种子液；
按5wt％的接种量将所得的种子液接种到液体发酵培养基中，摇床转速为220r/min，37℃振荡培养24h得到含有产物的发酵液；
步骤b)：发酵液预处理：
将发酵液在8000r/min离心15min以去除菌体，取上清液；
步骤c)：提取发酵液中的γ-聚谷氨酸：
将得到的上清液的pH值调至2，添加四倍乙醇-4℃冷藏24h，在8000r/min离心10min，获得γ-聚谷氨酸沉淀物；
步骤d)：对γ-聚谷氨酸沉淀加少量蒸馏水溶解进行透析，将透析得到的浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸粗品；
步骤e)：将γ-聚谷氨酸粗品溶于蒸馏水中，再次进行透析，浓缩液进行真空冷冻干燥，得到γ-聚谷氨酸纯品。
5.如权利要求4所述的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中的枯草芽孢杆菌采用Bacillus subtilis GIM1.286；恒温培养箱的温度为37℃，培养时间为12h；第一次振荡培养的摇床转速为220r/min，温度为37℃，时间为15h；种子液的接种量为按质量百分比5％的接种量将所得的种子液接种到液体发酵培养基中；第二次振荡培养的摇床转速为220r/min，温度为37℃，时间为24h。
6.如权利要求4所述的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤a)中种子培养基的成分包括：蔗糖30g/L、牛肉膏10g/L、谷氨酸钠30g/L、MgSO4·7H2O0.25g/L、K2HPO4·3H2O 0.5g/L，pH值为7.5，灭菌条件为121℃、20min；所述液体发酵培养基的成分包括：蔗糖30g/L、牛肉膏8g/L、谷氨酸钠30g/L、MgSO4·7H2O 0.25g/L、K2HPO4·3H2O0.5g/L，pH值为7.5；灭菌条件为121℃、20min。
7.如权利要求1所述的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中NaOH溶液的质量浓度为2.5％。
8.如权利要求1所述的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中检测γ-聚谷氨酸的方法采用CTAB比浊法。
9.一种权利要求1所述的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜的制备方法所制得的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜。
10.一种多功能生物吸附材料，其特征在于，包括至少一层权利要求9所述的γ-聚谷氨酸分子印迹聚合物膜。
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YUUKI SUEYOSHI等: "Chiral separation with molecularly imprinted polysulfone-aldehyde derivatized nanofiber membranes", 《JOURNAL OF MEMBRANE SCIENCE》 *
YUUKI SUEYOSHI等: "Chiral separation with molecularly imprinted polysulfone-aldehyde derivatized nanofiber membranes", 《JOURNAL OF MEMBRANE SCIENCE》, 6 February 2012 (2012-02-06) *

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