CN111588866B

CN111588866B - 一种增加水通道蛋白11表达量的应用

Info

Publication number: CN111588866B
Application number: CN202010475156.0A
Authority: CN
Inventors: 徐国彤; 张敬法; 张朝阳
Original assignee: Shanghai Youqi Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Shanghai Youqi Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2023-03-07
Anticipated expiration: 2040-05-29
Also published as: CN111588866A

Abstract

本发明提供一种增加水通道蛋白11表达量的试剂在制备治疗视网膜黄斑水肿的药物中的应用，其特征在于：包括增加视网膜的水通道蛋白11表达的步骤，其中，所述增加水通道蛋白11表达量，是指过表达水通道蛋白11或者将水通道蛋白11的表达量提升到生理水平。本发明发现AQP11参与到ME的发生发展，并可作为治疗ME的新靶点。

Description

一种增加水通道蛋白11表达量的应用

技术领域

本发明涉及一种增加水通道蛋白11表达量的试剂在制备治疗视网膜黄斑水肿的药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

Starling方程表明：在正常的生理状态下，视网膜液体的进出受到水平衡调控系统的严格调控，将视网膜维持在“相对干”的状态，以保证其最佳的光传导功能。血-视网膜屏障(包括内屏障和外屏障)限制着液体的进入，而视网膜排水系统控制着液体的排出。其中，Müller细胞和RPE细胞是视网膜排水的主要两类细胞，这两种细胞的功能失调会导致视网膜水肿的发生。之前的临床研究表明，DME病人视网膜中央子区厚度(central subfieldthickness,CSFT)与视网膜内核层厚度具有很强的相关性，提示胞内水肿(尤其是Müller细胞)可能参与到DME的形成。

Müller细胞作为视网膜中的大胶质细胞贯穿视网膜全层，具有支持、营养和维持视网膜稳态作用。其中，在调节离子和水平衡方面，Müller细胞犹如一个泵，将视网膜中的离子和水排入玻璃体和视网膜血管。很多研究表明，Müller细胞主要通过内向整流钾通道4.1(inward-rectifier potassium ion 4.1,Kir4.1)和与之共定位的水通道蛋白4(aquaporin 4,AQP4)发挥其维持水离子平衡的功能。Kir4.1主要表达在包绕血管的Müller细胞膜及Müller细胞终足上，其可将视网膜中的钾离子泵出，与此同时水由于渗透压的驱动会随着钾离子通过AQP4排入血管。此外，有研究提示在很多ME动物模型中，Kir4.1、AQP4和Dystrophin 71(Dp71)复合体的下调和分布的改变会导致Müller细胞内水肿。

水通道蛋白是一类可以转运水和小分子的跨膜蛋白，在哺乳动物中包含13个亚型(AQP0-12)。AQPs按照功能和序列的差异可分为三类：传统水通道、水-甘油通道和超级水通道。AQP11作为超级水通道家族中的成员，除了羧基端包含一个水通道经典的“Asn-Pro-Ala(NPA)”结构域，其氨基端还包含了一个特殊的“Asn-Pro-Cys(NPC)”结构域。AQP11在多种组织中表达，包括睾丸、肾脏、大脑、肝脏以及视网膜等。在不同种属哺乳动物的视网膜中，AQP11主要表达在Müller细胞上，尤其是聚集在内界膜的终足上。AQP11功能研究较少，相关报道提示，在体外载体上表达AQP11蛋白进行水传导检测，发现AQP11确实具有转运水的功能。有研究表明，在马自身免疫性葡萄膜炎模型中，AQP11被证明具有外排水的功能，且其表达量在疾病组降低。另有研究表明，AQP11可与AQP7共定位在内界膜上，提示它们可能参与到水由视网膜向玻璃体方向的排出。此外，在链脲霉素诱导的晚期糖尿病大鼠模型中，Q-PCR结果显示AQP11在视网膜的表达下调。综上所述，AQP11具有水传导功能，其特异表达在视网膜Müller细胞上，可能参与到水外排入玻璃体的过程中。同时，AQP11在ME疾病相关动物模型(视网膜水肿)中下调可能导致视网膜外排水不足以及Müller细胞的胞内水肿，进而促进了视网膜水肿的形成。

近年来，由于眼科疾病的适应性、眼球解剖结构的特殊性以及良好的免疫豁免性，眼病研究一直处于基因治疗的前沿。临床试验表明，在眼睛中使用腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)或者慢病毒(Lentivirus,LV)载体介导的基因疗法不会导致全身性副作用，而且不会引起显著的免疫反应。其中，AAV具有极小的免疫反应、很高的安全性以及长期表达的稳定性，因此其成为许多眼病治疗首选的载体。

因此，本发明提出通过基因治疗技术过表达AQP11或干预AQP11相关信号分子通路进而增加AQP11在视网膜中的表达。该策略有望成为治疗视网膜黄斑水肿的新方法。

目前，ME最常见的治疗方法包括各种抗VEGF注射(如雷珠单抗、康柏西普等)、激素(如缓释地塞米松注射、曲安奈德、氟轻松等)、激光光凝及玻璃体切割术等，但仍有一些患者的治疗效果不理想，提示还有其它因素参与了ME的发生发展。传统的方法主要是通过抑制VEGF及炎症因子，进而维持血-视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)，最终减少视网膜“进水”。但是，针对视网膜“排水”系统的治疗方案却没有被开发出来。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增加水通道蛋白11表达量的应用，以提供针对视网膜“排水”系统的治疗方案。

本发明采用了如下技术方案：

本发明提供一种增加水通道蛋白11表达量的试剂在制备治疗视网膜黄斑水肿的药物中的应用，其特征在于：包括增加视网膜的水通道蛋白11表达的步骤，其中，所述增加水通道蛋白11表达量，是指过表达水通道蛋白11或者将水通道蛋白11的表达量提升到生理水平。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：增加水通道蛋白11表达量的步骤中，使用眼科治疗中所能接受的载体。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：所述载体为病毒载体，所述病毒载体为：腺相关病毒AAV、腺病毒Ad或慢病毒LV的其中一种或者至少两种的组合。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：所述载体中包含水通道蛋白11基因。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：增加水通道蛋白11表达量的试剂为调控水通道蛋白11的信号分子，包括抑制剂或激活剂。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征：抑制剂或激活剂包含于可用于眼科临床治疗中可接受的载体之中。

进一步，本发明的应用，还具有这样的特征:调控机制包括靶向水通道蛋白11的相关microRNA，如miR27b或miR-27a-3p，采用相关抑制剂或激活剂对所述相关microRNA进行干预。

进一步，上述应用，所述治疗药物能够制成医学上可接受的药物制剂形式，包括自冻干制剂或溶液制剂。

进一步，上述应用，给药方式包括玻璃体腔内注射、视网膜下腔注射以及眼药水滴眼方式给药。

进一步，上述应用，所述眼科疾病包括但不限于糖尿病视网膜病变、视网膜中央及分支膜静脉阻塞、脉络膜新生血管、后葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性、中心性浆液性脉络膜视网膜病变、视网膜色素变性、眼肿瘤、视网膜血管炎、黄斑部视网膜前膜、高血压、眼外伤以及白内障术后(如Irvine-Gass综合征)疾病。

增加水通道蛋白11表达可以与其它治疗方法结合使用以缓解视网膜黄斑水肿。

发明的有益效果：ME的发病机理十分复杂，即BRB破坏导致视网膜内水份进入增多，而Müller细胞和RPE细胞功能失调导致视网膜内水份排出减少，以上两个因素共同作用导致ME和视网膜内Müller细胞胞内水肿。本发明目前得到实验数据发现：疾病状态下视网膜Müller细胞AQP11的下调可能参与到视网膜水肿的形成，且增加AQP11的表达可以有效缓解视网膜水肿。

目前，ME疾病状态下，视网膜AQP11下调的相关分子机制尚不清楚。有报道显示：在大鼠颅内出血模型中，miR-27a-3p通过调控大脑内皮细胞AQP11进而保护血-脑屏障。miR-27b通过调控肝细胞AQP11进而降低丙肝病毒的感染。这些结果提示：小干扰RNA(microRNA,miR)可以靶向AQP11的mRNA，进而调控其表达。因此可以建立特异性调控视网膜AQP11的信号转导通路数据库，筛选相关激活剂或抑制剂。

本发明的优点在于：

(1)除了现有的治疗方法，目前通过调控Müller细胞增强视网膜“排水”进而减轻ME的治疗方案还未见报道。本发明将治疗对象聚焦在Müller细胞，扩宽了治疗ME的思路；

(2)本发明的研究发现AQP11可能参与到ME的发生发展，并可作为治疗ME的新靶点。对AQP11的研究进一步补充了ME的发病机理，为更好的理解和治疗ME相关疾病提供了理论基础；

(3)通过对AQP11调控机制的研究，本发明提出通过基因治疗技术过表达AQP11或干预AQP11相关信号分子通路进而增加AQP11在视网膜中的表达，从而应用于制药用途。该策略有望成为治疗视网膜黄斑水肿的新方法。

附图说明

图1是AQP11在糖尿病大鼠视网膜中表达的时程改变。图1A显示AQP11在2周糖尿病大鼠视网膜中mRNA水平的改变，图1B和图1C显示AQP11在2周糖尿病大鼠视网膜中蛋白水平的改变；图1D显示糖尿病发病4周视网膜中AQP11表达量的改变，图1E显示糖尿病发病6周视网膜中AQP11表达量的改变，图1F和图1G显示糖尿病发病12周视网膜中AQP11表达量的改变。图1中Nor：正常对照；D：糖尿病；w：周数。标尺：20微米。

图2是不同发病时间的糖尿病大鼠视网膜超微切片的甲苯胺蓝染色。各组视网膜进行1微米超微切片,然后进行甲苯胺蓝染色，最后在显微镜下拍明场照片。图2D、图2E和图2F可见糖尿病视网膜Müller细胞水肿在外核层产生的条状空隙。其中，图2A、图2B和图2C是正常对照组，图2D、图2E和图2F分别是糖尿病发病6周、12周和24周的Nor：正常对照组；D：糖尿病；w：周数。标尺：100微米。

图3是rMC-1细胞经过低氧(0.5％氧浓度)处理不同时间后，其中，图3A采用Q-PCR、图3B采用Western blot、图3C采用免疫荧光检测各组AQP11表达量改变；图3D是rMC-1细胞经低氧处理后细胞直径的改变；图3E是各组细胞直径改变的拟合曲线。Nor：正常对照组。标尺：20微米。

图4是在低氧诱导的rMC-1细胞模型中，敲减AQP11对细胞体积的影响。图4A和图4B分别是采用Q-PCR和Western blot检测各组rMC-1细胞AQP11表达量改变的结果；图4C是敲减AQP11对细胞活力的影响；图4D是Countstar结果显示各组细胞直径的变化；图4E拟合曲线分析。Nor：正常对照组；图中H代表：低氧组。

图5是在低氧诱导的rMC-1细胞模型中，过表达AQP11对细胞体积的影响。图5A是慢病毒转染后，各组细胞GFP表达结果；图5B和图5C是Lenti-AQP11显著升高rMC-1细胞中AQP11的表达；图5D和图5E是AQP11过表达后，各组细胞体积改变；图5F是各组细胞明场照片。图中Nor：正常对照组；LV：慢病毒；NC：阴性对照。标尺：20微米。

图6是在低氧诱导的rMC-1细胞模型中，过表AQP11对Müller细胞谷氨酸代谢和胶质化的影响。图6A和图6B分别显示低氧处理rMC-1细胞后，Müller细胞GS和GFAP的表达改变；图6C、图6D、图6E分别是过表达AQP11后，各组细胞GS、GLAST和GFAP改变。图中Nor：正常对照组；LV：慢病毒；NC：阴性对照。

图7是糖尿病大鼠视网膜过表达AQP11后，各组视网膜Müller细胞水肿改变。图7A是AQP11表达量的改变。图7B是在12周糖尿病大鼠视网膜中，通过玻璃体腔注射LV-Ubi-AQP11过表达AQP11，然后进行超微切片和甲苯胺蓝染色。箭头处表示糖尿病视网膜在外核层产生的条状空隙。图中NC：阴性对照；LV：慢病毒；D：糖尿病；w：周数。标尺：100微米。

具体实施方式

以下结合附图来进一步说明本发明的技术方案。

以下实施方式中未具体描述的实验方法，均按照《生物化学实验技术》或者《ColdSpring Harbor Protocls》所记载的常规生化实验方法或者在商用试剂供应商所建议的实验操作下进行。

实施例1：水通道蛋白在早期糖尿病大鼠视网膜和低氧诱导的rMC-1细胞模型中表达量改变的筛选

通过实时定量PCR技术检测了各个水通道在链脲佐霉素(streptozocin,STZ)诱导的2周糖尿病大鼠视网膜和低氧诱导的rMC-1细胞系中mRNA水平的改变，低氧诱导处理为：0.5％氧浓度处理12小时。本次筛选包括大鼠的11种水通道蛋白，不包括AQP10(NCBI无相关序列信息)，引物序列见表1。Q-PCR结果显示，大鼠视网膜不表达AQP2和AQP7。表2的动物模型结果显示，与正常对照大鼠视网膜相比，2周糖尿病大鼠视网膜中AQP1和AQP11的表达量显著性升高，其它水通道蛋白无显著性改变。表3的细胞模型结果显示，较正常对照组，低氧使AQP3、AQP4、AQP6、AQP9、AQP11以及AQP12上调，使AQP9下调，对AQP0、AQP1和AQP8无显著性改变。以上结果提示，AQP11在糖尿病大鼠模型和低氧细胞模型中均有显著性上升的趋势，且AQP11在视网膜中的功能研究较少，所以选择AQP11进行进一步研究。

表1：大鼠水通道蛋白的引物信息

表2：两周糖尿病大鼠视网膜中水通道蛋白的实时PCR

SEM:standard error of mean

表3：缺氧处理的rMC-1细胞中水通道蛋白的实时PCR

SEM:均值标准误差standard errorof mean

实施例2：糖尿病大鼠模型中，AQP11早期代偿升高，之后随着病程逐渐降低并伴有视网膜Müller细胞的胞内水肿

通过Westernblot和免疫荧光技术检测STZ诱导的不同发病时间糖尿病大鼠视网膜中AQP11表达改变。如图1所示，AQP11在糖尿病发病早期，即图1A、图1B和图1C中2周时，较正常对照组显著升高。随着糖尿病发病时间的延长，糖尿病大鼠视网膜AQP11表达量逐渐降低，如图1D，具体表现为发病4周时与正常组无显著性差异，如图1E和图1F，而发病6周和12周都有显著性降低。免疫荧光结果显示，AQP11可与Müller细胞激活标志物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)共定位，提示其主要表达在Müller细胞上。这些结果提示：AQP11在糖尿病大鼠视网膜中早期代偿升高，随后失代偿逐渐降低。糖尿病状态下，视网膜Müller细胞AQP11的下调可能加重了视网膜水肿。

图1A显示AQP11在2周糖尿病大鼠视网膜中mRNA水平的改变，图1B和图1C显示AQP11在2周糖尿病大鼠视网膜中蛋白水平的改变；图1D显示糖尿病发病4周视网膜中AQP11表达量的改变，图1E显示糖尿病发病6周视网膜中AQP11表达量的改变，图1F和图1G显示糖尿病发病12周视网膜中AQP11表达量的改变。

同时，为了观察不同发病时间糖尿病大鼠视网膜中Müller细胞是否发生水肿，参考已发表的方法(The FASEB Journal 24(9):3405-15·May2010；doi:10.1096/fj.09-154344)，使用超微切片和甲苯胺蓝染色检测视网膜Müller细胞的水肿状态。如图2所示，正常大鼠视网膜外核层细胞核致密，而在发病6周的糖尿病大鼠视网膜外核层就可以检测到很多条索状空隙，提示Müller细胞发生水肿，且发病12周更加明显。图1的结果提示，AQP11的表达量在糖尿病发病6周的大鼠视网膜中显著降低，提示AQP11的下调可能导致Müller细胞水肿。

实施例3：低氧诱导的rMC-1细胞水肿模型中，AQP11参与Müller细胞外排水过程

本实施方式采用0.5％氧浓度的低氧条件在体外刺激rMC-1细胞建立体外模型进一步研究AQP11的功能。如图3A、3B和3C所示，与常氧组细胞相比，低氧组rMC-1细胞AQP11表达量呈时间依赖式升高，此结果与图1中发病2周的早期糖尿病大鼠AQP11的变化一致，提示AQP11在低氧诱导的rMC-1细胞模型中代偿升高。此外，采用Countstar细胞仪监测低氧处理的rMC-1细胞直径的时程改变，结果显示细胞的直径随着低氧处理时间的延长呈现时间依赖性增加，提示Müller细胞发生水肿(图3D)。如图3E所示，以细胞直径为横坐标，细胞占比为纵坐标，将Countstar的数据进行线性拟合，发现低氧处理组拟合曲线逐渐右移，提示低氧引起rMC-1水肿，验证了图3D的结果。

为了研究AQP11在Müller细胞中的功能，通过siRNA和过表达慢病毒(Lentivirus,LV)分别对AQP11进行敲减和过表达，然后继续观察Müller细胞大小的改变，进而确定AQP11在Müller细胞中的水调节功能。对于AQP11的敲减，合成了靶向AQP11的siRNA(AQP11siRNA)，序列为5’-GACGAAUCGUUCUAUAAGUTT-3’(正义)和5’-ACUUAUAGAACGAUUCGUCTT-3’(反义)；同时还合成了阴性对照siRNA(scrambled siRNA)，序列为5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’(正义)和5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’(反义)。转染步骤如下：将rMC-1细胞接种在孔板中，细胞培养贴壁后转入无血清培养基使用Lipofectamine2000进行siRNA(20μM)转染，6小时后再转至正常含血清培养基继续培养48小时。如图4A和4B所示，与随机干扰序列scrambled对照组相比，siRNA可以显著降低低氧组细胞AQP11的表达，如图4C所示，且沉默AQP11不影响rMC-1细胞活力。图4D和图4E的Countstar结果显示，低氧可以引起rMC-1细胞水肿，敲减AQP11可以进一步加剧Müller细胞水肿。对于AQP11的过表达，选用GV358载(Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin)并构建过表达慢病毒和阴性对照病毒。病毒感染步骤如下：将细胞接种在孔板中，贴壁后使用HitransG感染试剂进行慢病毒(1×10⁸)感染，12小时后转至正常培养基继续培养48小时。如图5A、5B和5C所示，LV-Ubi-AQP11可以显著性升高Müller细胞AQP11的表达。Countstar细胞仪的结果提示，如图5D和图5E所示，过表达AQP11可以有效缓解低氧诱导的rMC-1细胞胞内水肿，各组rMC-1细胞的明场照片进一步验证了该结果(图5F)。以上结果均证明了Müller细胞中的AQP11具有外排水功能，且过表达AQP11可以有效缓解低氧状态下Müller细胞水肿。

实施例4：在低氧诱导的rMC-1细胞模型中，过表达AQP11可以部分恢复Müller细胞功能

实施例3的结果提示，Müller细胞AQP11具有外排水功能，且过表达AQP11可以有效缓解低氧诱导的rMC-1细胞水肿，Müller细胞的功能。本实施方式在低氧诱导的rMC-1细胞模型中，过表AQP11，并观察对Müller细胞谷氨酸代谢和胶质化的影响。如图6A所示，低氧状态下rMC-1细胞谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)降低，如图6C所示，谷氨酸转运体(Glutamate-aspartate transporter,GLAST)表达降低，提示Müller细胞谷氨酸代谢功能异常；同时，如图6B所示，低氧可使rMC-1细胞GFAP表达量升高，提示Müller细胞胶质化增强。如图6C、图6D和6E所示，在低氧诱导的rMC-1细胞中，过表达AQP11可以升高Müller细胞GS和GLAST表达，但不影响GFAP。该结果提示，过表达AQP11除了可以在形态学降低低氧诱导的Müller细胞水肿，还可以部分改善Müller细胞的功能。

实施例5：糖尿病大鼠视网膜中，过表达AQP11可以有效减轻Müller细胞水肿

在糖尿病发病4周的糖尿病大鼠中，通过玻璃体腔注射LV-Ubi-AQP11(1×10⁹TU/ml,2μL)过表达视网膜AQP11，然后在发病12周时观察视网膜Müller细胞水肿是否得到缓解。如图7A的Western blot结果所示，与阴性对照病毒注射组相比，LV-AQP11注射组可以显著上调视网膜AQP11的表达。如图7B所示，甲苯胺蓝结果显示，在正常大鼠玻璃体中注射LV-Ubi-AQP11不会影响视网膜的形态。与图2的甲苯胺蓝染色结果一致，12周糖尿病大鼠视网膜外核层出现了明显的条索状空隙，如图7B所示过表达AQP11可以有效的减少条状空白的大小和数量。以上结果表明：过表达AQP11可以有效缓解12周糖尿病大鼠视网膜Müller细胞的水肿程度。AQP11有望成为治疗视网膜水肿的新靶点。

序列表

<110> 上海优祺生物医药科技有限公司

<120> 一种增加水通道蛋白11表达量的应用

<160> 24

<170> SIPOSequenceListing 1.0

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ctgtacagtg tcaccccacc 20

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acgugacacg uucggagaat t 21

Claims

1.一种增加水通道蛋白11表达量的试剂在制备治疗糖尿病性视网膜水肿的药物中的应用，其特征在于：包括增加视网膜的水通道蛋白11表达的步骤，

其中，所述增加水通道蛋白11表达量，是指过表达水通道蛋白11。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：

增加水通道蛋白11表达量的步骤中，使用眼科治疗中所能接受的载体。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述载体为病毒载体，所述病毒载体为：腺相关病毒AAV、腺病毒Ad或慢病毒LV的其中一种或者至少两种的组合。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述载体中包含水通道蛋白11基因。

5.如权利要求1-4任一所述的应用，所述治疗药物制成医学上可接受的药物制剂形式，包括自冻干制剂或溶液制剂。

6.如权利要求1-4任一所述的应用，给药方式包括玻璃体腔内注射、视网膜下腔注射或者眼药水滴眼方式。