CN111575357A - 基于半连接pcr技术的二代测序文库构建方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于半连接PCR技术的二代测序文库构建方法及其应用。本发明实现方式有两种：(1)通过去除打断双链DNA 5’‑磷酸基团，阻断打断后DNA双链两5’端与接头连接；而接头的另一条链含有5’‑磷酸基团，能够与打断后DNA双链两3’端连接，从而实现半连接。(2)通过在连接接头的3’端进行分子修饰，此分子修饰可以阻断接头平末端3’端与打断后DNA的5’端连接。本发明在将双链DNA打断后，通过半连接的方式针对含有UBC序列的DNA区域进行扩增，同时引入测序接头，集合了三种方法的优势，还有效避免了不含UBC序列的形成测序文库，非特异扩增，片断分布不集中等缺点。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一种基于半连接PCR技术的二代测序文库构建方法及其应用。
背景技术
现代分子生物学技术中，针对较长的扩增产物DNA，构建二代测序文库的方法主要有：打断连接测序接头法，扩增引入测序接头法、转座酶介导的引入测序接头法等。在批量单细胞转录组文库构建过程中，由于转录组cDNA经过全长扩增之后，每个细胞的cDNA分子都标记了相应的记号序列，称为UBC。不同的细胞被标记了不同的UBC。而UBC序列仅能存在于cDNA序列的两端之中的一端。因此构件批量单细胞转录组文库时，不仅仅是引入测序接头，而是在含有UBC序列的DNA区域引入接头。因此，上文提到的三种方法虽然可以实现此功能，但是同时会引入不含有UBC序列的DNA区域（如打断连接接头法），或导致含有UBC序列的DNA区域过短或过长（如使用随机或兼并引物扩增引入测序接头法、转座酶介导的引入测序接头法）导致非特异扩增，或UBC序列不完整或测序文库片断不集中等。
本发明是在打断连接接头的方法上进行改进，根据DNA连接酶催化契合的双链DNA的5´-磷酸末端和3´-羟基末端形成磷酸二酯键原理，在将双链cDNA进行打断后，通过半连接的方式针对含有UBC序列的DNA区域进行扩增，同时引入测序接头，集合了三种方法的优势，还有效避免了不含UBC序列的形成测序文库，非特异扩增，片断分布不集中等缺点。
发明内容
本发明提供了一种基于半连接PCR技术的二代测序文库构建方法及其应用。其中半连接的实现方式有两种：
(1) 通过磷酸酶去除打断双链cDNA 5’-磷酸基团，然后进行末端修复，并与一端为5’序列突出，一端为平末端且含有5’-磷酸基团的接头连接。由于打断后DNA双链两5’端均不含磷酸基团，因此无法与接头对应的3’端连接成功；而接头的一端含有5’-磷酸基团，能够与打断后DNA双链两3’端连接成功，从而实现半连接。
(2) 通过在连接接头平末端侧的3’端进行分子修饰，如氨基修饰。在双链cDNA打断，末端修复后，此分子修饰可以阻断接头平末端3’端与打断后DNA的5’端连接，仅能实现平末端5’端与打断后DNA的3’端连接。半连接本质上是双链DNA的两个5’端保持不变，在两个3’端连接接头。
完成半连接后，可以通过带有测序接头序列Tag的接头特异引物与UBC的特异引物进行扩增，实现含有UBC序列的cDNA文库构建。
进一步，在半连接中，可以将所用接头和打断后双链DNA的平末端修改为T/A粘性末端。具体的，打断后双链DNA在末端修复同时进行加A尾；所用接头连接侧3’含有T粘性末端。
进一步，所述的半连接过程中使用的磷酸酶，包括但不局限于虾碱酶。
进一步，所述的半连接过程中连接接头的 3’端分子修饰，包括但不局限于氨基修饰、ddNTP修饰。
本发明提供了一种通过半连接方式构建文库的试剂盒。
进一步，所述的试剂盒包含具有3'-5’外切酶活性的DNA聚合酶及反应缓冲液、含有分子修饰的连接接头、DNA连接酶及反应缓冲液、含有测序接头的接头特异引物、PCR扩增反应缓冲液等。
进一步，所述的试剂盒含有磷酸酶，包括但不局限于碱性磷酸酶，虾碱酶。
进一步，所述的含有分子修饰的连接接头含有T粘性末端。
进一步，所述的分子修饰，包括但不局限于5’磷酸基团修饰，3’氨基修饰。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供了一种在打断连接接头的方法上进行改进文库构建方法，通过将双链cDNA打断后，进行半连接的方式，针对含有UBC序列的DNA区域进行扩增，同时引入测序接头，还有效避免了不含UBC序列的形成测序文库，非特异扩增，片断分布不集中等缺点。
附图说明
图1是半连接原理示意图1。
图2 是半连接原理示意图2。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook 等人，分子克隆：实验室手册（New York: Cold Spring HarborLaboratoryPress, 1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 批量单细胞转录组文库构建
1. 批量单细胞转录组双链cDNA制备
A、细胞固定和打孔
步骤如下：
1）取2mL带培养基细胞，500g 4℃离心3分钟，去除上清，用1mL预冷的含RNase 抑制剂的1×PBS溶液重悬。
2）使用40um过滤器过滤细胞悬液至15mL离心管中，加入3mL预冷的1.33%福尔马林溶液，静置10分钟，进行细胞固定。
3）加入160μl 5% Triton X-100，静置3 min进行细胞打孔，迅速500g 4℃离心3分钟，去除上清。
4）使用500 μl含RNase 抑制剂的1×PBS溶液重悬细胞，加入500μl预冷的100mMTris-HCl（pH8），加入20μl 5% Triton X-100。
5）500g 4℃离心3分钟，去除上清，用300μl含RNase 抑制剂的0.5×PBS溶液重悬细胞，并使用40um 过滤器过滤。
6）进行细胞计数，稀释至1000000细胞/mL。
B、分池编码
7）在逆转录芯片中（包含16个不同标记的逆转录引物及相同的模板转换引物各1μl），加入3μl细胞悬液，15μl逆转录反应液（1×RT Buffer，0.5mM dNTP，1U RNase 抑制剂，4U逆转录酶）。
8）在PCR仪上执行以下程序：50℃ 10分钟；3个循环（8℃ 12秒，15℃ 45秒，20℃45秒，30℃ 30秒，42℃ 2分钟，50℃ 3分钟）；50℃ 5分钟。
9）混合16个反应体系，加入1.6μl 10% Triton X-100，500g 4℃离心3分钟，去除上清。
10）使用350μl 含RNase 抑制剂的1×NEB Buffer 3.1重悬细胞。
11）将357μl 连接酶混合液（1×连接酶Buffer，2U/μl 连接酶，0.25% Triton X-100，1U/μl RNase 抑制剂），与350μl 细胞悬液混合。
12）在连接2芯片（包含16种不同标记的连接2接头10μl）中，每孔加入40μl连接酶细胞混合液。
13）在杂交箱内37℃杂交连接30分钟，50转每分钟。
14）每孔加入10μl连接2封闭液，继续在杂交箱内37℃杂交连接30分钟，50转每分钟。
15）收集反应液，加入100μl T4 DNA连接酶。
16）在连接3芯片（包含16种不同标记的连接3接头10μl）中，每孔加入50μl 细胞悬液。
17）在杂交箱内37℃杂交连接30分钟，50转每分钟。
18）每孔加入10μl连接3封闭液，继续在杂交箱内37℃杂交连接30分钟，50转每分钟。
C、裂解纯化及扩增
19）收集反应液，1000g 4℃离心5分钟，去除上清。
20）加入10μl细胞裂解液（1×Blue Buffer，0.2U RNAGEM）重悬细胞。
21）在PCR仪上，75℃ 5分钟。
22）同时取40μl 链霉亲和素磁珠，用1×B&W Buffer 洗涤3次后，用100μl 2×B&WBuffer 重悬。
23） 裂解产物与30μl链霉亲和素磁珠混合，室温60分钟。
24） 用1×B&W Buffer 洗涤2次后，再用10mM Tris-HCl洗涤一次。
25） 加入20μl PCR体系（1×PCR Mix，0.8uM 引物）重悬磁珠。
26） 在PCR仪上进行以下程序：95℃ 3分钟；5个循环（98℃ 20秒，65℃ 45秒，72℃3分钟）。
27） 反应结束后，去除磁珠，向反应液加入SYBR GREEN I染料。
28）在荧光定量PCR仪上进行以下程序：95℃ 3分钟；25个循环（98℃ 20秒，65℃45秒，72℃ 3分钟）。
29） 使用0.8×KAPA 磁珠纯化PCR产物。
2. 连接接头制备
合成接头序列，并退火使序列1与序列2形成双链。序列如下：
caggtaatacgactcactatagggt-NH2（SEQ ID NO.1）
P-ccctatagtgagtcgtattacc（SEQ ID NO.2）
3. 半连接
1）取纯化后转录组cDNA，使用超声波打断，超声10s，停10s，将DNA打断成约300bp片断，取20uL，加入10×ERA Buffer 5uL，5×ERA Enzyme Mix 10uL，补充15uL双蒸水。在PCR仪上20℃ 30分钟，65℃ 30分钟进行末端修复及加A。
2）加入5×Ligation Buffer 20uL，接头3uL，TIANSeq DNA Ligasex 17uL，补充17uL 双蒸水。在PCR仪上20℃ 30分钟进行连接。
3）将AMPure XP磁珠置于室温平衡。涡旋使磁珠充分悬浮，加入60 μl磁珠至100 μl的连接产物，充分吸打混匀。室温孵育5 min，将反应管置于磁力架上1～2 min。待磁珠完全贴壁后，用移液器吸弃上清。入200 μl 80%乙醇，轻轻震荡混匀，洗涤磁珠，并用磁力架回收磁珠，弃上清。重复200 μl 80%乙醇洗涤一次。开盖室温放置5～10 min至晾干。加入18 μl 纯水重悬磁珠，洗脱连接产物。
4．文库扩增
使用序列3和序列4作为文库扩增引物，扩增连接产物。具体配置体系：2倍Kapa PCRmix 25uL，序列3（10uM）1uL，序列4（10uM）1uL，纯化连接产物15uL，补充8uL双蒸水。在PCR仪上反应，95℃ 3分钟；95℃ 30秒，65℃ 30秒，72℃ 30秒，12个循环；72℃ 5分钟。
ATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGTAATACGACTCACTATAGG（SEQ ID NO.3）
CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC （SEQ IDNO.4）
将AMPure XP磁珠置于室温平衡。涡旋使磁珠充分悬浮，加入40 μl磁珠至50 μl的扩增产物，充分吸打混匀。室温孵育5 min，将反应管置于磁力架上1～2 min。待磁珠完全贴壁后，用移液器吸弃上清。入200 μl 80%乙醇，轻轻震荡混匀，洗涤磁珠，并用磁力架回收磁珠，弃上清。重复200 μl 80%乙醇洗涤一次。开盖室温放置5～10 min至晾干。加入25 μl TE缓冲液重悬磁珠，洗脱产物。
5．测序结果
同时测试使用诺唯赞公司转座子建库试剂盒（TD503），扩增步骤使用N501引物（诺唯赞）和序列4进行扩增文库。
使用Novaseq 6000测序仪进行测序，下机数据比对后，含有UBC reads且匹配到基因的比例为70%，明显优于使用转座子构建文库（40%）。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京全谱医学检验实验室有限公司
<120> 基于半连接PCR技术的二代测序文库构建方法及试剂盒
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctatagtg agtcgtatta cc 22
<210> 1
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caggtaatac gactcactat agggagt 27
<210> 3
<211> 78
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgatacggc gaccaccgag atctacactc tttccctaca cgacgctctt ccgatctggt 60
aatacgactc actatagg 78
<210> 4
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
caagcagaag acggcatacg agatgatctg gtgactggag ttcagacgtg tgctcttccg 60
atc 63
Claims (10)
1.本发明提供了一种基于半连接PCR技术的二代测序文库构建方法及其试剂盒，具体通过半连接实现仅在双链DNA 3’端连接接头，继而使用带有测序接头的特异引物扩增构建文库的方法及试剂盒。
2.据权利要求1所述，双链DNA为平末端或粘性末端DNA片段，其长度在150bp至300bp之间。
3.据权利要求1所述，连接接头为平末端或粘性末端的人工双链DNA片段，5’端进行磷酸化。
4.据权利要求1所述，半连接可以通过磷酸酶去除双链DNA末端的磷酸基团进行阻碍DNA 连接酶催化的接头3’端与双链DNA 5’端的连接。
5.据权利要求1所述，半连接还可以通过对连接接头3’端进行分子修饰实现阻碍DNA连接酶催化的接头3’端与双链DNA 5’端的连接。
6.据权利要求4所述，磷酸酶包含但不局限于碱性磷酸酶。
7.据权利要求5所述，分子修饰包括但不局限于氨基修饰、ddNTP修饰。
8.据权利要求4所述，DNA连接酶包括但不局限于T4 DNA 连接酶。
9.本发明提供了一种通过半连接方式构建文库的试剂盒，包含具有3'-5’外切酶活性的DNA聚合酶及反应缓冲液、含有3’端分子修饰的连接接头、DNA连接酶及反应缓冲液、含有测序接头的接头特异引物、PCR扩增反应缓冲液等。
10.本发明提供了一种通过半连接方式构建文库的试剂盒，包含具有3'-5’外切酶活性的DNA聚合酶及反应缓冲液、碱性磷酸酶、连接接头、DNA连接酶及反应缓冲液、含有测序接头的接头特异引物、PCR扩增反应缓冲液等。
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| CN107002292A (zh) * | 2014-11-26 | 2017-08-01 | 深圳华大基因研究院 | 一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂 |
| CN108060191A (zh) * | 2017-11-07 | 2018-05-22 | 深圳华大基因科技有限公司 | 一种双链核酸片段加接头的方法、文库构建方法和试剂盒 |
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