CN111569051A - 人血管内皮细胞抑制因子vegi-251在制备抗肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了人血管内皮细胞抑制因子VEGI‑251在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明发现VEGI‑251具有高效靶向并诱导TAM凋亡而促进机体抗肿瘤免疫的生物学功能，并阐明其通过激活TAM细胞内ASK1/JNK信号转导而诱导凋亡，从而具有高效抗肿瘤活性应用。显示VEGI‑251可以成为TAM靶向性抗肿瘤免疫分子治疗的一个新靶点，为抗肿瘤药物的开发提供科学理论依据，并为临床抗肿瘤治疗提供新思路，具有重要的学术意义和潜在的临床应用价值。

Description

人血管内皮细胞抑制因子VEGI-251在制备抗肿瘤药物中的 应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，更具体地，涉及人血管内皮细胞抑制因子VEGI-251在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤的血管新生和肿瘤相关巨噬细胞的聚集都是肿瘤重要的恶性表型，可用于肿瘤患者不良生存预后的判断标志。同时，抗血管新生和抗肿瘤免疫治疗往往具有高效、高选择、低毒及低耐药的优点，为当前肿瘤治疗研究的两个重大主题。

血管内皮生长抑制因子(Vascular endothelial growth inhibitor,VEGI)是一种新近发现的抗血管生成因子，属于肿瘤坏死因子(tumour necrosis factor,TNF)超家族。VEGI至少包括三种可变剪接体：VEGI-174，VEGI-192和VEGI-251。目前研究表明VEGI具有的生物学功能包括：抑制血管新生、抗肿瘤活性、参与机体免疫调节、参与免疫炎症反应性疾病早期进展。基于VEGI蛋白家族在抑制血管新生及机体免疫调节的双向生物学功能，深入研究VEGI蛋白的在抗肿瘤血管新生及抗肿瘤免疫两个方面的新功能及新机制，对于VEGI蛋白的临床转化研究具有极其重要的科学意义。

肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)由机体循环系统中的不成熟单核细胞活化而来，生物学特性类似于M2型巨噬细胞。肿瘤相关巨噬细胞可抑制机体的抗肿瘤免疫应答，并可分泌肿瘤生长因子、促血管生长因子和降解细胞外基质的蛋白水解酶，参与了肿瘤的发生、生长、血管新生、侵袭和转移等多种生物学过程。肿瘤相关巨噬细胞和患者不良生存预后之间的存在密切的关联性，其浸润程度、激活类型和组织学定位已作为判断多种肿瘤患者生存预后的标志物。特异性靶向TAM的抗肿瘤免疫治疗，已成为肿瘤防治研究领域的热点方向，为抗肿瘤靶向性治疗提供了新策略和新方向。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供VEGI作为肿瘤相关巨噬细胞的抑制剂在抗肿瘤药物中的应用。

本发明的一个目的是提供VEGI-251在制备治疗抗肿瘤免疫药物中的应用。

本发明的另一个目的是提供VEGI-251在制备肿瘤相关巨噬细胞抑制剂中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

VEGI-251表达的蛋白产物含有251位氨基酸残基，Gene ID:9966，GenBank:NM_005118.4。本发明证实VEGI-251具有诱导肿瘤相关巨噬细胞凋亡的生物学功能，显示其可以作为新型抗肿瘤免疫制剂的药物应用。

具体地，本发明中，采用小鼠同种移植瘤模型，证明VEGI-251蛋白对小鼠肝癌皮下同种移植瘤的生长具有显著的抑制作用，并且采用流式细胞术证明VEGI-251能够较强抑制荷瘤小鼠体内TAM的产生。以荷瘤小鼠内原代培养TAM为模型，采用免疫印迹技术证明了VEGI-251能够较强诱导TAM的凋亡。通过免疫印迹技术、免疫共沉淀技术阐明VEGI-251诱导TAM凋亡的分子机制：VEGI-251通过与DR3受体结合，招募TRAF2和ASK1蛋白形成复合体，而激活ASK1激酶，进而激活下游的JNK通路，活化的c-Jun转录激活促凋亡蛋白的表达，诱导TAM细胞的凋亡，促进机体抗肿瘤免疫，结合其抗肿瘤血管新生的双效应，从而实现高效抗肿瘤功能。

因此本发明要求保护以下内容：

VEGI-251在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

优选地，所述抗肿瘤药物靶向肿瘤相关巨噬细胞。

VEGI-251在制备肿瘤相关巨噬细胞抑制剂中的应用。

优选地，所述肿瘤相关巨噬细胞抑制剂为肿瘤相关巨噬细胞的凋亡诱导制剂。

本发明所提供的VEGI-251作用于机体内异常的巨噬细胞，参与机体病理条件下免疫调节的功能及机理。重点性阐明VEGI的抗肿瘤免疫活性，将揭示VEGI通过诱导TAM凋亡而促进机体抗肿瘤免疫的新功能，显示VEGI可以成为TAM靶向性抗肿瘤免疫分子治疗的一个新靶点。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明发现VEGI蛋白具有诱导肿瘤相关巨噬细胞凋亡的新功能，而促进机体抗肿瘤免疫，结合其肿瘤血管新生抑制剂的功效，从而实现高效抗肿瘤功能。这显示VEGI可以成为肿瘤相关巨噬细胞靶向性分子治疗的一个新分子。同时，发现VEGI(以VEGI-251为主)的抗肿瘤免疫分子机制：VEGI-251通过与TAM细胞膜上的DR3受体直接结合，招募TRAF2和ASK1蛋白形成复合体，直接激活ASK1激酶，进而激活下游的JNK信号传导通路，最终活化的c-Jun转录激活促凋亡蛋白Puma的表达，诱导肿瘤相关巨噬细胞的凋亡。这将为首创性发现VEGI-251能与重要的凋亡相关激酶ASK1结合形成复合体并使其活化，从信号转导最上游至最下游，揭示了VEGI-251诱导细胞凋亡的分子机制和通路。

本发明发现VEGI-251具有高效靶向并诱导TAM凋亡而促进机体抗肿瘤免疫的生物学功能，并阐明其通过激活TAM细胞内ASK1/JNK信号转导而诱导凋亡，从而具有高效抗肿瘤活性应用。显示VEGI-251可以成为TAM靶向性抗肿瘤免疫分子治疗的一个新靶点，为抗肿瘤药物的开发提供科学理论依据，并为临床抗肿瘤治疗提供新思路，具有重要的学术意义和潜在的临床应用价值。

附图说明

图1为采用小鼠同种移植瘤模型并结合流式细胞术证明VEGI-251蛋白能够较强抑制荷瘤小鼠体内TAM的产生的结果图。

图2为采用免疫印迹技术证明VEGI-251能够较强诱导TAM的凋亡的结果图。

图3为采用免疫共沉淀技术证明VEGI-251通过与DR3受体结合，招募TRAF2和ASK1蛋白形成复合体的结果图。

图4为采用免疫印迹技术VEGI-251通过活化ASK1而激活其下游信号转导而诱发TAM细胞凋亡的结果图。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1：VEGI-251蛋白对小鼠肝癌皮下同种移植瘤的生长抑制作用

一、实验方法

1、小鼠移植瘤模型的建立

取对数生长期的鼠源性肿瘤细胞(鼠肝细胞癌细胞系Hep1-6)消化后重悬于1×PBS溶液中，细胞计数后，制成细胞密度为3×10⁷/ml的单细胞悬液，将100μl细胞悬液(3×10⁶个细胞)皮下接种于C57BL/6J小鼠颈项部皮下位置。

2、动物的分组及给药方法

接种后第6天，所有小鼠颈项部位置肿瘤形成均匀，平均体积约为50mm³，表明本法能建立稳定的小鼠肝癌皮下同种移植瘤模型。待平均体积约为50mm³后，rhVEGI-251蛋白处理组分别以5mg/kg和10mg/kg剂量的rhVEGI-251蛋白，每隔三天腹腔注射给药1次，持续给药6次，观察并记录rhVEGI-251蛋白的体内抑瘤作用，以真核表达系统溶剂(293FT细胞培养液上清)作为溶剂对照组。

3、绘制移植瘤生长曲线

持续观察小鼠的生存状况，每隔三天使用游标卡尺测量皮下移植瘤的长径和短径(mm)，计算皮下移植瘤的体积。移植瘤体积计算公式：体积(mm³)＝π/6×长径×短径²。

根据各组皮下移植瘤体积，计算各个时间点肿瘤体积的均数值及抑制率，并绘制肿瘤生长曲线。抑制率＝(1一实验组平均瘤体积/对照组平均瘤体积)×100％。

4、动物实验的终点处理

采用颈椎脱臼法处死小鼠。迅速取下肿瘤体，称量瘤体重量。抑制率＝(1一实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。

终点处理三批实验动物产生以下数据：

(1)动物体内肿瘤体积动态变化数据；

(2)动物体内肿瘤重量数据；

所有动物实验操作均遵守《实验动物管理条例》(中华人民共和国国家科学技术委员会令第2号，1988)。

二、实验结果

结果如表1所示，在给药期间rhVEGI-251蛋白处理组的肿瘤生长速度明显慢于溶剂对照组，组间差异明显。经给药6次后，以小鼠移植瘤体积为检测指标，结果显示5mg/kg剂量rhVEGI-251蛋白处理组的抑瘤率为38.63％，10mg/kg剂量rhVEGI-251蛋白处理组的抑瘤率达68.15％，见表1，且与溶剂对照组比较差别有统计学意义。而以瘤体重量为检测指标，结果显示5mg/kg剂量rhVEGI-251蛋白处理组的抑瘤率为40.83％，10mg/kg剂量rhVEGI-251蛋白处理组的抑瘤率达71.63％，且与溶剂对照组比较差别有统计学意义。上述结果表明rhVEGI-251蛋白对小鼠肝癌皮下同种移植瘤的生长具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖性效应。

表1采用小鼠同种移植瘤模型证明VEGI-251蛋白对小鼠肝癌皮下同种移植瘤的生长具有显著的抑制作用的结果：

实施例2:VEGI-251蛋白能抑制小鼠肝癌移植瘤中肿瘤相关巨噬细胞的产生

一、实验方法

1、肿瘤相关巨噬细胞提取实验

对于小鼠肿瘤模型中的肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)，采用CD11b和F4/80作为特异性表面分子标记来进行鉴定。

(1)单细胞悬液制备实验

下文涉及的Solution 1、Solution 2、和Solution 3试剂均为TumorDissociationKit^TM(mouse)中提供。根据上文实施例1所述方法建立小鼠移植瘤模型；小鼠饲养两周后经颈椎脱臼法处死，全身酒精消毒后迅速取下肿瘤标本，称量瘤体重量；在生物安全柜内，剔除坏死组织，将肿瘤标本在RPMI-1640培养基中切成2-4mm的瘤组织块；将瘤组织块转移至2ml离心管中，放置于TissueLyser匀浆机中，并以10Hz/s的速率匀浆5min；将肿瘤组织匀浆液转移至50ml离心管，1000rpm离心4min，弃上清；按瘤重比例每1.5g肿瘤组织中加入2.35ml RPMI-1640，以及加入小鼠肿瘤解离试剂100μl Solution 1，50μl Solution2，12.5μl Solution 3，充分混匀，37℃孵育40min，每5min震荡混匀一次；消化后的细胞悬液经筛网过滤至15ml离心管中，1000rpm离心4min，弃去上清，加入8ml 1×PBS，1000rpm离心4min；弃去PBS，细胞重悬后，取50μl细胞悬液与50μl 0.4％台盼蓝溶液充分吹打混匀；从活细胞计数板侧面凹槽处向内滴入20μl细胞悬液；在倒置显微镜下对血细胞计数板中4个大方格内的细胞进行计数，计数原则：不计入着蓝色的死细胞；当细胞压住大格线时，则上下线只计一侧，左右线也只计一侧；成团细胞较多时不计数，应重新吹散细胞再计数；细胞密度(cell/ml)＝(4个大方格细胞数之和/4)×稀释倍数×10⁴。。

2、应用免疫磁珠分选技术分离肿瘤相关巨噬细胞实验

(1)以细胞数每10⁷个细胞加入90μl 1×PBS并加入10μl CD11bMicroBeads^TM。

(2)将细胞与microbeads充分混匀，置于4℃冰箱中孵育15min；

(3)加入1×PBS洗涤细胞，1000rpm离心4min，弃去上清；

(4)加入500μl 1×PBS，重悬细胞；

(5)利用全自动磁性细胞分选仪，选择posseld程序，对阳性细胞进行分选；

(6)加入1×PBS，1000rpm离心4min，对分选出来的阳性细胞进行洗涤，弃上清；

(7)加入RPMI-1640培养基，重悬细胞，按上文所提实验方法进行细胞计数，置于37℃，5％CO₂细胞培养箱培养；

(8)细胞培养1h后，弃去未贴壁细胞，以1×PBS洗涤细胞，加入含有10％FBS的完全培养基，并置于37℃，5％CO₂细胞培养箱中培养。

3、应用流式细胞分选技术分离肿瘤相关巨噬细胞实验

(1)将实例二步骤2中单细胞悬液分别做如下处理：

1)不做染色处理的Control组细胞：取1×10⁶个细胞，用1×PBS将细胞重悬；

2)单独染CD11b-PE组细胞：取1×10⁷个细胞，用100μl 1×PBS将细胞重悬后，在避光条件下，加入10μl CD11b-FITC抗体，在4℃孵育15分钟；

3)单独染F4/80-FITC组细胞：取1×10⁷个细胞，用100μl 1×PBS将细胞重悬后，在避光条件下，加入1μl F4/80-FITC抗体，在4℃孵育15分钟；

4)双染CD11b-PE和F4/80-FITC组细胞：将余下细胞密度调整为1×10⁸/ml，在避光条件下，在每毫升细胞重悬液中加入100μl CD11b-FITC抗体以及10μlF4/80-FITC抗体，在4℃孵育15分钟；

(3)往上述几组细胞中加入6ml 1×PBS，1000rpm离心4min；

(4)流式细胞术分选：应用流式细胞术进行目标细胞分选。F4/80-FITC染色的细胞激发的绿色荧光通过FITC通道检测；CD11b-PE染色的细胞激发的红色荧光通过PE通道检测。采用不做染色处理的对照组细胞，设定十字门的位置；荧光补偿调节：单独染CD11b-PE组细胞以及单独染F4/80-FITC组细胞作为对照进行荧光补偿调节去除光谱重叠；将双染CD11b-PE和F4/80-FITC组细胞密度调整为2×10⁷/ml，按照设定的十字门进行分选。

二、实验结果

结果如图1所示，从瘤体消化获得的分散的单个细胞中，采用免疫磁珠分选技术分离各组别的CD11b⁺的细胞群，并采用CD11b-PE标记抗体进行细胞染色结合流式细胞术检测。结果显示，溶剂对照组、5mg/kg剂量rhVEGI-251蛋白处理组、10mg/kg剂量rhVEGI-251蛋白处理组CD11b⁺的细胞群纯度分别为97.16±1.83％、96.79±1.03％、97.24±0.96％。进而采用流式细胞分选技术从CD11b⁺细胞群中，分选CD11b⁺F4/80⁺TAMs细胞群。结果显示，溶剂对照组的CD11b⁺F4/80⁺TAMs占所有CD11b+细胞比例为55.63±3.74％，5mg/kg剂量rhVEGI-251蛋白处理组的CD11b⁺F4/80⁺TAMs占所有CD11b+细胞群比例为34.76±3.19％，10mg/kg剂量rhVEGI-251蛋白处理组的CD11b⁺F4/80⁺TAMs占所有CD11b⁺细胞群比例为23.23±3.32％，且rhVEGI-251蛋白处理组均与溶剂对照组比较差别有统计学意义。上述结果表明rhVEGI-251蛋白对小鼠肝癌皮下同种移植瘤中TAMs的产生具有显著的抑制作用，且呈剂量依赖性效应。

实施例3 VEGI-251蛋白能有效诱导肿瘤相关巨噬细胞的凋亡

一、实验方法

1、疫印迹法技术

(1)收集实验组细胞，使用1×Sample Buffer充分裂解细胞，获得总蛋白裂解液样品并进行SDS-PAGE；

(2)准备9×6cm的Whatman 3mm滤纸四张和8×5cm PVDF膜一张，甲醇浸泡PVDF膜5min，1×Transfer Buffer将夹子、海绵和滤纸泡湿。按电转印装置操作，负极－海绵－2张滤纸－浓缩凝胶－PVDF膜－2张滤纸－海绵－正极板，将其放入转膜槽中，加满1×Transfer Buffer。冰浴，300mA转膜2h；

(3)取出PVDF膜，含5％脱脂牛奶的TBST封闭液封闭1h；

(4)用需检测蛋白的一抗4℃过夜孵育，回收一抗，TBST洗膜，每次15min，重复3次；

(5)采用相应的二抗孵育1h；回收二抗，TBST洗膜，每次15min，重复3次；

(6)在暗房用采用X片发光显影定影而制作数据图。

二、实验结果

结果如图2所示，应用Western blotting分析了rhVEGI-251蛋白对凋亡途径中的关键caspase家族蛋白以及PARP蛋白的影响。TAM细胞经不同浓度(0,2,4,8U)rhVEGI-251蛋白作用24h后，随着蛋白作用浓度的升高，caspase-8,-3蛋白前体逐渐降低，而caspase-8,-3成熟体逐渐增强，结果见图2。PARP蛋白前体随着rhVEGI-251蛋白作用浓度的升高逐渐降低，而其切割带逐渐增多，呈剂量依赖性效应。

实施例4 VEGI-251通过活化ASK1而激活其下游信号转导而诱发TAM细胞凋亡

1、采用免疫印迹技术检测目的蛋白

(1)采用免疫印迹技术检测在不同浓度(0,2,4,8U)的VEGI-251蛋白处理后，TAM中的ASK1蛋白Ser967和Thr845位点磷酸化水平和ASK1总蛋白的变化。

(2)采用免疫印迹技术检测在不同浓度(0,2,4,8U)的VEGI-251蛋白处理后，TAM细胞中的JNK蛋白磷酸化水平和JNK总蛋白的变化。

(3)采用免疫印迹技术检测在不同浓度(0,2,4,8U)的VEG-251蛋白处理后，TAM细胞中的c-Jun蛋白Ser63和Ser73位点磷酸化水平和c-Jun总蛋白的变化。

(4)采用免疫印迹技术检测在不同浓度(0,2,4,8U)的VEG-251蛋白处理后，TAM细胞中的凋亡相关蛋白Puma的变化。

二、实验结果

结果如图3所示，利用免疫印迹技术检测在不同浓度rhVEGI-251蛋白(0,2,4,8U)处理后的TAM细胞中蛋白表达水平。结果显示，经rhVEGI-251蛋白处理后，ASK1(Thr845位点)、SAPK-JNK(Thr183-Tyr185位点)、c-Jun(Ser63位点)、c-Jun(Ser73位点)蛋白磷酸化水平和Puma的蛋白表达水平明显升高，ASK1(Thr967位点)蛋白磷酸化水平显著下降，而ASK1、SAPK/JNK、c-Jun的总蛋白表达水平无明显改变。这显示rhVEGI-251蛋白能通过激活ASK1/JNK及下游信号转导通路，有效诱导TAM细胞的凋亡。

实施例5 VEGI-251蛋白与DR3受体结合而招募TRAF2衔接蛋白而激活ASK1

一、实验方法

1、免疫共沉淀

(1)应用瞬时转染方法构建高表达的VEGI-251-Flag蛋白的TAM细胞。

(2)预冷的1×PBS洗涤细胞两次后，加入细胞1×IP裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)；

(3)使用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿中刮下，将细胞悬液转移到1.5ml离心管中，4℃，缓慢晃动15min后，4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中；

(4)30μl的裂解液作为Input，往余下的裂解液中加入50μl交联好proteinA/G-beads的Flag磁珠，4℃缓慢摇晃孵育过夜；

(5)4℃，3000rpm 5min离心，将经过夜共孵育的蛋白-抗体混合物中proteinA/G-beads离心至管底，使用1ml注射器及IP裂解缓冲液彻底洗5次以上，注意动作要轻柔，避免破坏蛋白结合作用；使用免疫印迹技术对相应的蛋白进行检测。

二、实验结果

结果见图4所示，应用瞬时转染方法构建高表达的VEGI-251-Flag蛋白的TAM细胞，通过免疫共沉淀法，检测TAM细胞中VEGI-251蛋白与ASK1蛋白的相互结合作用。对于高表达VEGI-251-Flag蛋白的TAM细胞，采用结合Flag标签抗体的磁珠，将收集的各组细胞裂解液进行免疫共沉淀；对照组，采用结合IgG抗体的磁珠进行免疫共沉淀。最后使用免疫印迹法检测各组TAM细胞ASK1的蛋白表达水平及VEGI-251-Flag蛋白表达水平。采用免疫印迹法检测收集的各组细胞裂解液(Input)，以表明各组细胞中ASK1蛋白表达量相近。结果显示，细胞中VEGI-251能够与ASK1蛋白相互结合。

进一步应用瞬时转染方法构建高表达的VEGI-251-Flag蛋白的TAM细胞，通过免疫共沉淀法，检测TAM细胞中VEGI-251蛋白与TRAF2衔接蛋白的相互结合作用。对于高表达VEGI-251-Flag蛋白的TAM细胞，采用结合Flag标签抗体的磁珠，将收集的各组细胞裂解液进行免疫共沉淀；对照组，采用结合IgG抗体的磁珠进行免疫共沉淀。最后使用免疫印迹法检测各组TRAF2的蛋白表达水平及VEGI-251-Flag蛋白表达水平。采用免疫印迹法检测收集的各组细胞裂解液(Input)，以表明各组细胞中TRAF2蛋白表达量相近。结果显示，细胞中VEGI-251能够与TRAF2衔接蛋白相互结合。

Claims (4)

1.VEGI-251在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述抗肿瘤药物靶向肿瘤相关巨噬细胞。

3.VEGI-251在制备肿瘤相关巨噬细胞抑制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述肿瘤相关巨噬细胞抑制剂为肿瘤相关巨噬细胞的凋亡诱导制剂。

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