CN111567398A - 一种锦葵科作物远缘杂交的方法 - Google Patents

一种锦葵科作物远缘杂交的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业领域，尤其涉及一种锦葵科作物远缘杂交的方法。所述锦葵科作物远缘杂交的方法为：以所述陆地棉幼苗为砧木，金花葵幼苗为接穗进行嫁接，得到嫁接苗；所述嫁接苗开花时，将所述嫁接苗的花蕾全部去掉雄蕊，将陆地棉的花粉涂抹于所述嫁接苗的花蕾柱头上，将营养液注射于所述嫁接苗雌蕊的基部；获得并收集杂交铃的种子；所述营养液，包括：0.1～2份芸苔素内酯；0.1～2份胺鲜酯；0.1～3份吲哚‑3‑乙酸；0.1～2份萘乙酸；0.1～2份氯吡苯脲；10～50份C2～C5的醇；50000～120000份水。所述方法获得陆地棉和金花葵远缘杂交种子和杂交植株，提高了杂交幼铃的结实率，降低幼铃脱落率。

Description

一种锦葵科作物远缘杂交的方法
技术领域
本发明涉及农业领域，尤其涉及一种锦葵科作物远缘杂交的方法。
背景技术
陆地棉，属锦葵科一年生草本植物，是一种国家重要战略物资。棉铃虫曾在我国各大棉区大面积发生，转Bt抗虫棉的种植，已基本控制了棉铃虫的发生。然而，蚜虫和红蜘蛛等次生害虫逐渐成为危害棉花生长的主要害虫，严重影响棉花产量和品质。目前生产上主要依靠农药控制，一方面增加了植棉成本，另一方面容易造成环境污染。因此，培育抗蚜虫和红蜘蛛的棉花品种，利用作物自身的抗性防治蚜虫和红蜘蛛一直是育种家努力攻克的难题。
金花葵，又名菜芙蓉、野芙蓉,是属锦葵科、秋葵属的一年生草本植物,和棉花一样具有无限开花结果习性。其对蚜虫和红蜘蛛具有一定程度上天然的抗性，可在叶柄和叶背面分泌一种盐晶状颗粒物，但其对棉铃虫不具有抗性。金花葵与陆地棉同属锦葵科作物，亲缘关系较近，具有相似的花器官和结构。相较于陆地棉，金花葵的果实较为早熟。因此，利用远缘杂交技术将金花葵的抗蚜虫和红蜘蛛基因导入陆地棉，是培育抗蚜虫和红蜘蛛的早熟陆地棉新品种的有效途径。
但是远缘杂交存在技术和遗传基础上的障碍，陆地棉和金花葵杂交后，所结的金花葵幼铃通常可以正常生长发育，3天后开始出现脱落，5-7天达到脱落高峰期，最终仅有约3％的杂交铃可发育为正常铃。但是，即使看似发育正常的杂交铃，待果实成熟后将其剥开，具体参见图1，可发现一排排败育的幼胚，没有正常的杂交种子产生。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提供一种锦葵科作物远缘杂交的方法，可实现陆地棉和金花葵远缘杂交，并获得杂交种子和杂交植株。
本发明提供了一种锦葵科作物远缘杂交的方法，包括以下步骤：
步骤S1：以陆地棉幼苗为砧木，金花葵幼苗为接穗进行嫁接，得到嫁接苗；
步骤S2：所述嫁接苗开花时，将所述嫁接苗的花蕾全部去掉雄蕊，将陆地棉的花粉涂抹于所述嫁接苗的花蕾柱头上，将营养液注射于所述嫁接苗雌蕊的基部；
步骤S3：获得并收集杂交铃的种子；
所述营养液，包括如下重量份的组分：
0.1～2份的芸苔素内酯；
0.1～2份的胺鲜酯；
0.1～3份的吲哚-3-乙酸；
0.1～2份的萘乙酸；
0.1～2份的氯吡苯脲；
10～50份的C2～C5的醇；
50000～120000份的水。
优选地，在所述步骤S1前，还包括：
用缩节胺溶液分别处理金花葵和陆地棉种子，采用处理后的金花葵种子和陆地棉种子培育幼苗；
金花葵幼苗和陆地棉幼苗高于3cm后，喷洒缩节胺溶液2～3次。
优选地，所述缩节胺溶液的浓度为100～200mg.kg-1。
优选地，所述100～200mg.kg-1浓度的缩节胺溶液处理金花葵和陆地棉种子的时间为10～72小时。
优选地，所述步骤S2中，将营养液注射于所述嫁接苗雌蕊基部的5～10个点，每个点注射5～8微升。
优选地，所述C2～C5的醇为乙醇。
优选地，所述营养液包括：
0.5～1.5份的芸苔素内酯；
0.5～1.5份的胺鲜酯；
0.5～2.5份的吲哚-3-乙酸；
0.5～1.5份的萘乙酸；
0.5～1.5份的氯吡苯脲；
10～30份乙醇；
80000～100000份的水。
优选地，所述营养液包括：
0.7～1.2份的芸苔素内酯；
0.5～1.2份的胺鲜酯；
0.8～2份的吲哚-3-乙酸；
0.8～1.3份的萘乙酸；
0.8～1.4份的氯吡苯脲；
10～20份的乙醇；
85000～95000份的水。
优选地，获得嫁接苗后，对所述嫁接苗进行炼苗，然后将未开花的所述嫁接苗和未开花的陆地棉幼苗移栽至封闭环境中。
与现有技术相比，本发明的锦葵科作物远缘杂交的方法，包括以下步骤：
以所述陆地棉幼苗为砧木，金花葵幼苗为接穗进行嫁接，得到嫁接苗；
所述嫁接苗开花时，将所述嫁接苗的花蕾全部去掉雄蕊，将陆地棉的花粉涂抹于所述嫁接苗的花蕾柱头上，将营养液注射于所述嫁接苗雌蕊的基部；
获得并收集杂交铃的种子；
所述营养液，包括如下重量份的组分：0.1～2份的芸苔素内酯；0.1～2份的胺鲜酯；0.1～3份的吲哚-3-乙酸；0.1～2份的萘乙酸；0.1～2份的氯吡苯脲；10～50份的C2～C5的醇；50000～120000份的水。
本发明的锦葵科作物远缘杂交的方法，可实现陆地棉和金花葵远缘杂交，并获得杂交种子和杂交植株，而且有效提高了远缘杂交的幼铃的结实率，降低远缘杂交幼铃脱落率。
附图说明
图1表示陆地棉和金花葵嫁接苗杂交注射营养液后发育成的杂交铃的照片；
图2表示陆地棉和金花葵嫁接苗杂交后正常发育但败育的杂交铃的照片；
图3表示自然生长金花葵自花授粉后发育成的金花葵成铃的照片；
图4表示本发明杂交种子发育后获得的杂交植株的照片。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明的实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明的限制。
本发明的实施例公开了一种锦葵科作物远缘杂交植株的处理方法，包括以下步骤：
步骤S1：以陆地棉幼苗为砧木，金花葵幼苗为接穗进行嫁接，得到嫁接苗；
步骤S2：所述嫁接苗开花时，将所述嫁接苗的花蕾全部去掉雄蕊，将陆地棉的花粉涂抹于所述嫁接苗的花蕾柱头上，将营养液注射于所述嫁接苗雌蕊的基部；
步骤S3：获得并收集杂交铃的种子；
所述营养液，包括如下重量份的组分：
0.1～2份的芸苔素内酯；
0.1～2份的胺鲜酯；
0.1～3份的吲哚-3-乙酸；
0.1～2份的萘乙酸；
0.1～2份的氯吡苯脲；
10～50份的C2～C5的醇；
50000～120000份的水。
本发明通过杂交配合营养液刺激，诱导陆地棉和金花葵进行远缘杂交并获得杂交种子和杂交植株。
按照本发明，按照步骤详细说明如下：
步骤S1：以所述陆地棉幼苗为砧木，金花葵幼苗为接穗进行嫁接，得到嫁接苗。
该步骤控制金花葵幼苗和陆地棉幼苗达到嫁接标准后，再进行嫁接，促进两种植株营养物质和遗传物质的交流，提高二者开花期做杂交时的亲和性。
优选地，待金花葵幼苗和陆地棉幼苗的主茎达到2.5～3mm后，以所述陆地棉幼苗为砧木，金花葵幼苗为接穗进行嫁接。
优选地，获得嫁接苗后，对所述嫁接苗进行炼苗，然后将未开花的所述嫁接苗和未开花的陆地棉幼苗移栽至封闭环境中。在封闭环境中可避免形成假杂交铃。
更优选地，在半阴半阳的环境中进行炼苗。
优选地，在所述步骤S1前，还包括：
用缩节胺溶液分别处理金花葵和陆地棉种子，采用处理后的金花葵种子和陆地棉种子培育幼苗；
金花葵幼苗和陆地棉幼苗高于3cm后，喷洒缩节胺溶液2～3次。
所述缩节胺溶液的浓度优选为100～200mg.kg-1，所述100～200mg.kg-1浓度的缩节胺溶液处理金花葵和陆地棉种子的时间优选为10～72小时。采用缩节胺溶液处理，有利于防止出现高脚苗，提高嫁接成功率。优选地，所述金花葵和陆地棉错期播种和培育幼苗，以实现金花葵幼苗和陆地棉幼苗主茎的直径相似。更优选地，所述金花葵种子播种后72～100小时后，陆地棉种子再播种育苗。
所述培育幼苗的条件优选为28～35℃，光照和黑暗环境交替，直至金花葵和陆地棉的幼苗长出。每个周期内，所述光照环境的时间为10～15小时，黑暗环境的时间为10～15小时。
金花葵幼苗和陆地棉幼苗高于3cm后，喷洒缩节胺溶液2～3次。
该步骤中，所述缩节胺溶液的浓度优选为100～200mg.kg-1。该步骤是都幼苗进行化控，促进幼苗主茎变粗，为嫁接做好准备。
步骤S2：所述嫁接苗开花时，将所述嫁接苗的花蕾全部去掉雄蕊，将陆地棉的花粉涂抹于所述嫁接苗的花蕾柱头上，将营养液注射于所述嫁接苗雌蕊的基部。
将所述嫁接苗的花蕾全部去掉雄蕊具体为：将花冠从基部撕下，保留花萼，用刀片将花丝和花药全部从花柱上自上而下轻轻刮下。去掉雄蕊的过程不损伤花柱和柱头。
陆地棉的花粉涂抹于所述嫁接苗的花蕾猪头上后，利用营养液对其进行刺激。
本发明的营养液是用于锦葵科远缘杂交的授粉期间。所述营养液涉及多种促生长激素活生长调节剂，多种组分协同作用，以提高远缘杂交的幼铃结实率，降低幼铃脱落率。
其中，芸苔素内酯是高效植物激素，能显著地增加植物的营养体生长和促进受精作用。本发明的营养液中包括0.1～2份的芸苔素内酯；优选地包括0.5～1.5份的芸苔素内酯；更优选地，包括0.7～1.2份的芸苔素内酯。
胺鲜酯可用于促进细胞分裂和伸长。本发明的营养液中包括0.1～2份的胺鲜酯，优选地，包括0.5～1.5份的胺鲜酯；更优选地，包括0.5～1.2份的胺鲜酯。
吲哚-3-乙酸对于花粉的发芽、促进花粉管的伸长、侧根或花芽的形成具有积极作用，能引起单性结实和受精后的果实发育。本发明的营养液中包括0.1～3份的吲哚-3-乙酸，优选地，0.5～2.5份的吲哚-3-乙酸；更优选地，包括0.8～2份的吲哚-3-乙酸。
萘乙酸是一种广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，防止落果，改变雌、雄花比率等。本发明的营养液中包括0.1～2份的萘乙酸，优选地，包括0.5～1.5份的萘乙酸；更优选地，包括0.8～1.3份的萘乙酸。
氯吡苯脲具有影响植物芽的发育、加速细胞有丝分裂、促进细胞增大和分化，防止果实和花的脱落的作用。本发明的营养液中包括0.1～2份的氯吡苯脲，优选地，包括0.5～1.5份的氯吡苯脲；更优选地，包括0.8～1.4份的氯吡苯脲。
按照本发明，以C2～C5的醇和水作为溶剂，将上述组分进行溶解。所述C2～C5的醇优选为乙醇。
按照本发明，优选地，所述营养液包括：
0.5～1.5份的芸苔素内酯；
0.5～1.5份的胺鲜酯；
0.5～2.5份的吲哚-3-乙酸；
0.5～1.5份的萘乙酸；
0.5～1.5份的氯吡苯脲；
10～30份的乙醇；
80000～100000份的水。
按照本发明，优选地，所述营养液包括：
0.7～1.2份的芸苔素内酯；
0.5～1.2份的胺鲜酯；
0.8～2份的吲哚-3-乙酸；
0.8～1.3份的萘乙酸；
0.8～1.4份的氯吡苯脲；
10～20份的乙醇；
85000～95000份的水。
在所述步骤S2中，优选地，将营养液注射于所述嫁接苗雌蕊基部的5～10个点，每个点注射5～8微升。
步骤S3：获得并收集杂交铃的种子。
嫁接苗生长杂交铃后，需要记录杂交铃的生长发育情况，包括正常发育和脱落的杂交铃的数量等相关信息。
待嫁接苗杂交铃由绿色变为黑色，将每个杂交铃单独存放，直至自然开裂，去除外壳，收集杂交铃的种子。
为了研究获得的杂交种子的性能，优选地，将杂交种子单粒播种，放置于光照培养箱内，温度25～35℃，光照和黑暗环境各12小时进行交替，记录杂交种子的出苗日期和发芽率。待杂交种子发芽后，将杂交种子金花葵种子和陆地棉种子同时单粒播种于大田中，记录各物种的出苗日期和出苗率。每日观察记录杂交种苗是否出现亲本(即金花葵和陆地棉)的表性特征。待杂交种子、金花葵和陆地棉长出真叶后，提取叶片的DNA，筛选引物，检测杂交种是否为阳性。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的锦葵科作物远缘杂交的方法进行详细说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1
用150mg.kg-1浓度的缩节胺溶液分别处理金花葵(金花葵品种为金花葵3号，由邯郸市农业科学院早熟棉科室提供)和陆地棉种子(陆地棉品种为邯818，由邯郸市农业科学院早熟棉科室提供)24小时以上。
二者错期播种育苗，陆地棉于金花葵播种后72小时播种，播种后放置于光照培养箱中，设置温度为30℃，光照和黑暗环境各12小时，直至陆地棉幼苗和金花葵幼苗长出。
金花葵幼苗和陆地棉幼苗长出后，待幼苗长至3cm高时，喷洒100mg.kg-1浓度的缩节胺2次。
待金花葵幼苗和陆地棉幼苗的主茎达到2.5～3mm后，以所述陆地棉幼苗为砧木，金花葵幼苗为接穗进行嫁接，得到嫁接苗。
待嫁接苗完全成活后，转移至室内靠近窗户的地方，在半阴半阳的环境中进行炼苗，3～5天后待嫁接苗足够强壮时，将金花葵嫁接苗、陆地棉幼苗和自然生长金花葵幼苗分别移栽至三个防虫网大棚中。
待嫁接苗和陆地棉均开花时，于每天下午17-19时之间，将当天嫁接苗的花蕾全部剥开去雄，记录去雄数量，具体方法如下：用手将花冠从基部撕下，保留花萼，用刀片将花丝和花药全部从花柱上自上而下轻轻刮下，不要损伤花柱和柱头。将吊牌悬挂于去雄花蕾花柄的基部并记录去雄日期。仔细检查每一棵嫁接苗，确保无遗漏花蕾。
于第二天上午10时左右，待陆地棉花粉散开后，取下花朵，撕下花冠和花萼，将花粉均匀涂抹于已去雄的金花葵嫁接苗花蕾的柱头上，然后将配制的用于提高远缘杂交结实率的营养液用微型注射器在雌蕊的基部注射5个点，每个点5～8ul，将陆地棉花冠用剪刀剪成2cm*2cm大小的方块，把陆地棉花粉均匀涂抹此方块上，最后用此方块将嫁接苗的柱头包裹，用红绳连同柱头、涂抹方块和花萼一起捆扎，避免离体花粉直接暴露在太阳紫外线中而过早失去活力。只要气候条件允许，连续去雄和授粉10～15天，确保去雄和授粉杂交铃数量在200个以上。
所述营养液包括：0.1份的吲哚-3-乙酸，0.1份的萘乙酸，0.1份的氯吡苯脲，10份的乙醇，0.1份的芸苔素内酯，0.1份的胺鲜酯和50000份的水。
每日记录杂交铃的生长发育情况，包括正常发育和脱落杂交铃的数量等相关信息。
35天后，待嫁接苗杂交铃由绿色变为黑色即将炸裂前，将每个杂交铃连同吊牌一起单独装入一个网沙袋中，放置太阳光下晾晒直至杂交铃自然开裂，将外壳去除，收集杂交铃种子待用。实施例2
杂交步骤与实施例1相同，选用的营养液包括：3份的吲哚-3-乙酸，2份的萘乙酸，2份的氯吡苯脲，50份的乙醇，2份的芸苔素内酯，2份的胺鲜酯和120000份的水。
实施例3
杂交步骤与实施例1相同，选用的营养液包括：0.7份的吲哚-3-乙酸，1份的萘乙酸，0.8份的氯吡苯脲，10份的乙醇，0.5份的芸苔素内酯，0.5份的胺鲜酯和80000份的水。
实施例4
杂交步骤与实施例1相同，选用的营养液包括：2.5份的吲哚-3-乙酸，1.5份的萘乙酸，1.5份的氯吡苯脲，15份的乙醇，1份的芸苔素内酯，1.5份的胺鲜酯和90000份的水。
实施例5
杂交步骤与实施例1相同，选用的营养液包括：1.5份的吲哚-3-乙酸，1.2份的萘乙酸，1份的氯吡苯脲，20份的乙醇，1份的芸苔素内酯，1份的胺鲜酯和100000份的水。
对陆地棉和金花葵进行远缘杂交后不施加营养液，陆地棉与金花葵远缘杂交后施加营养液，金花葵自花授粉的三种情况获得的杂交种子的情况进行统计，统计结果参见表1。实施例1中获得的其中一个杂交铃的照片如图1所示，陆地棉和金花葵嫁接苗杂交后正常发育但败育的杂交铃的照片如图2所示，自然生长金花葵自花授粉后发育成的金花葵成铃的照片如图3所示。
表1.不同处理方法成铃率比较
Figure BDA0002521792550000091
Figure BDA0002521792550000101
将实施例1～5中获得的杂交种子单粒播种，放置于光照培养箱内，温度25～35℃，光照和黑暗环境各12小时进行交替，记录杂交种子的出苗日期和发芽率。待杂交种子发芽后，将杂交种子金花葵种子和陆地棉种子同时单粒播种于大田中，记录各物种的出苗日期和出苗率。每日观察记录杂交种苗，杂交种苗具有金花葵和陆地棉的表性特征。待杂交种子、金花葵和陆地棉长出真叶后，提取叶片的DNA，筛选引物，检测杂交种为阳性。
杂交植株具有双亲性状，具体参见图4。由图4可见，本发明获得的杂交种子具有育性，可继续用于筛选，以得到纯合的新种植资源。对比例1
杂交步骤与实施例1相同，利用混合液1施用于嫁接苗上。混合液1的制备方法为：将1.5份的萘乙酸，1.5份的氯吡苯脲加入15份的乙醇中，完全溶解后加入1份的芸苔素内酯，1.5份的胺鲜酯和90000份的水，得到混合液1。
对比例2
杂交步骤与实施例1相同，利用混合液2施用于嫁接苗上。混合液2的制备方法为：将2.5份的吲哚-3-乙酸，1.5份的氯吡苯脲加入15份的乙醇中，完全溶解后加入1份的芸苔素内酯，1.5份的胺鲜酯和90000份的水，得到混合液2。
对比例3
杂交步骤与实施例1相同，利用混合液3施用于嫁接苗上。混合液3的制备方法为：将2.5份的吲哚-3-乙酸，1.5份的萘乙酸，1.5份的氯吡苯脲加入15份的乙醇中，完全溶解后加入1.5份的胺鲜酯和90000份的水，得到混合液3。
对比例4
杂交步骤与实施例1相同，利用混合液4施用于嫁接苗上。混合液4的制备方法为：将2.5份的吲哚-3-乙酸，1.5份的萘乙酸加入15份的乙醇中，完全溶解后加入1.5份的胺鲜酯和90000份的水，得到混合液4。
对分别施加对比例1～4制备的混合液后，获得的杂交种子的情况进行统计，统计结果参见表2。
表2.对比例1～4不同处理方法成铃率比较
对比例1 对比例2 对比例3 对比例4
授粉铃数(个) 210 210 216 205
发育铃数(个) 14 12 11 13
成铃率(％) 6.7 5.7 5.1 6.3
杂交种子(粒) 40 42 38 46
单铃获种子数(个) 2.86 3.5 3.45 3.5
由实施例和对比例的实验结果可见，本发明制备的营养液，各组分之间可实现协同作用，有效提高了陆地棉与金花葵远缘杂交的幼铃的结实率，降低了远缘杂交幼铃脱落率。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (9)

1.一种锦葵科作物远缘杂交的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤S1：以陆地棉幼苗为砧木，金花葵幼苗为接穗进行嫁接，得到嫁接苗；
步骤S2：所述嫁接苗开花时，将所述嫁接苗的花蕾全部去掉雄蕊，将陆地棉的花粉涂抹于所述嫁接苗的花蕾柱头上，将营养液注射于所述嫁接苗雌蕊的基部；
步骤S3：获得并收集杂交铃的种子；
所述营养液，包括如下重量份的组分：
0.1～2份的芸苔素内酯；
0.1～2份的胺鲜酯；
0.1～3份的吲哚-3-乙酸；
0.1～2份的萘乙酸；
0.1～2份的氯吡苯脲；
10～50份的C2～C5的醇；
50000～120000份的水。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤S1前，还包括：
用缩节胺溶液分别处理金花葵和陆地棉种子，采用处理后的金花葵种子和陆地棉种子培育幼苗；
金花葵幼苗和陆地棉幼苗高于3cm后，喷洒缩节胺溶液2～3次。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述缩节胺溶液的浓度为100～200mg.kg-1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述100～200mg.kg-1浓度的缩节胺溶液处理金花葵和陆地棉种子的时间为10～72小时。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，将营养液注射于所述嫁接苗雌蕊基部的5～10个点，每个点注射5～8微升。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述C2～C5的醇为乙醇。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养液包括：
0.5～1.5份的芸苔素内酯；
0.5～1.5份的胺鲜酯；
0.5～2.5份的吲哚-3-乙酸；
0.5～1.5份的萘乙酸；
0.5～1.5份的氯吡苯脲；
10～30份乙醇；
80000～100000份的水。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养液包括：
0.7～1.2份的芸苔素内酯；
0.5～1.2份的胺鲜酯；
0.8～2份的吲哚-3-乙酸；
0.8～1.3份的萘乙酸；
0.8～1.4份的氯吡苯脲；
10～20份的乙醇；
85000～95000份的水。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，获得嫁接苗后，对所述嫁接苗进行炼苗，然后将未开花的所述嫁接苗和未开花的陆地棉幼苗移栽至封闭环境中。
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