JP5231466B2 - 小さい果実を作出する四倍体スイカ - Google Patents

Description

本発明は、スイカの育種の分野におけるものであり、具体的には、三倍体種子を作出するために使用される四倍体スイカ植物及び実質的に小さいサイズの種無しスイカ果実の作出のための植物に関するものである。

スイカは、野菜作物に充てられた世界中の面積の２％を占める重要な園芸作物である。１９９７年には、世界中で生育されたスイカは６，０２４，０００エーカー（２４，３７８，２８４．６４ｋｍ²）であり、そして米国で生育されたスイカは１８７，０００エーカー（７５６，７６２．８２ｋｍ²）であった。アジアは、世界の面積の７２％及び世界の作出量の７７％を占めるはるかに最も重要なスイカの作出拠点である(FAO Production Yearbook 51, 1998)。予想される年間の世界のスイカの額は、１９９５〜１９９７年の米国の平均価格を用いた場合、７６億ドルを超えた。米国のスイカ作物は、１７４，０００エーカー（７０４，１５３．６４ｋｍ²）超の収穫面積から４１，０００，０００ｃｗｔ（２，０８２，８９４，３００ｋｇ）に達し、そして２．６６億ドル超の農場価値に達し、これは米国の生鮮野菜産業の収穫面積（エーカー）の９．２％、作出量の１０．０％、及び３．５％の上記価値を占めた(USDA Agricultural statistics 2001)。カリフォルニアは、スイカが産地から出荷される際の価値において先進の州であり、これはカリフォルニアで生育した高率の三倍体の種無しスイカに起因して、２００年には７２００万ドルを超えた。種無しスイカは、市場において、種のあるスイカを優に超す平均価格を得ている。三倍体種無しスイカはまた、二倍体の種有りスイカよりも高収率で作出される。

三倍体の種無しスイカは、雌親としての四倍体スイカと、雄親としての二倍体スイカとの間の真のＦ１雑種である(Kihara, H. 1951. Triploid Watermelons. Proceedings of American Society for Horticultural Science 58 : 217-230)。通常のスイカである、タネの有る二倍体スイカは、それらの体細胞内に２２の染色体を有する（２Ｎ＝２Ｘ＝２２）。四倍体スイカは、それらの体細胞内に４４の染色体を有する（２Ｎ＝４Ｘ＝４４）。四倍体植の雌花が通常の二倍体植物の雄花と他家授粉される場合、四倍体植物の果実中に作出される種子は三倍体の種子である。三倍体の種子は三倍体の種子を作出する。三倍体植物を同一の畑で通常の二倍体植物と一緒に生育する場合、当該三倍体植物は種無しの果実を作出する。三倍体スイカの種の状態は、１つの体細胞当たり通常２つであるところ３つの相同染色体のセットの結果である。３つの相同染色体のセットを有する細胞は三倍体と言われ、そして３Ｘと表される。三倍体の種無しスイカは、それらの体細胞の中に３３個の染色体（２Ｎ＝３Ｘ＝３３）を有する。三倍体の接合子が正常な生育可能な配偶子（花粉及び卵細胞）を作出できないことにより、三倍体果実における種子の不在が生じる。典型的に、種無しスイカは、未成熟のキュウリのものに類似の、小さな食べられる白い胚珠を含む。

三倍体種無しスイカは、１９８０年代後期から米国で商業的に生育されてきた。種無しスイカの人気は米国でのその商業的な導入以来増大してきた。２００１年にカリフォルニアで作出されたスイカの多くが、三倍体の種無しスイカであった。三倍体品種は、植物当たりより多くの果実及びより長期の収穫期間に起因して、二倍体種有り品種よりも高収率で作出される。三倍体種無しスイカは、実質的に種が無い高品質な果肉のため、特別価格をつけている。

本発明は、高水準の果実の味及び質感を維持しつつ、より小さな種無し果実を作出する三倍体スイカの必要性に取り組む。しかしながら、果実のサイズを小さくする場合、果実の果皮の比率が増大し、食べられる果肉のスペースが極めて小さくなる。このように、高い果肉の含量を有する小さい種無しスイカを作出するスイカを開発することも本発明の目的である。本発明はまた、そのような小さい種無し果実を作出する三倍体スイカの親として使用され得る、四倍体スイカ植物の必要性に取り組む。

従って、本発明は、新規で且つ独特の四倍体スイカを提供する。本発明の四倍体スイカは、好ましくは四倍体自殖系統であり、そして三倍体雑種スイカの親として特に適している。本発明の四倍体スイカは非常に薄い果皮を有する小さい果実を作出する。本発明の四倍体スイカの果実は、好ましくは高含量の可溶性固形物を有する。重要なことに、本発明の四倍体スイカは、二倍体スイカと交配した場合に、これらの所望の特性をそれらの三倍体の子孫に伝達することができる。従って、本発明はまた、実質的に種がなく、且つ非常に薄い果皮を有する小さいサイズの果実を作出する三倍体スイカを開示する。そのような種無しスイカの果実は、匹敵するサイズのスイカと比較した場合に優れた味及び質感を有する、より多くの食べることができる果肉を有するという利点を有し、それ故に消費者にとって特に魅力的である。

好ましい態様において、本発明の四倍体スイカ植物は、約１．５ｋｇ〜約２．５ｋｇ、好ましくは約１．５ｋｇ〜約２ｋｇ、好ましくは約２ｋｇの重さの果実を作出する。別の好ましい態様において、本発明の四倍体スイカの果皮は、約４ｍｍ〜約１０ｍｍの厚さ、好ましくは約４ｍｍ〜約７ｍｍの厚さである。別の好ましい態様において、本発明の四倍体スイカは優れた結果(fruit set)を有する。別の好ましい態様において、本発明の四倍体スイカは高い糖含量を有する。別の好ましい態様において、本発明に従う四倍体スイカ植物は、１０００個の種子当たり約２０ｇ〜約３５ｇ、好ましくは１０００個の種子当たり約２３ｇ〜約３３ｇ、好ましくは１０００個の種子当たり約３１ｇ、別の態様においては１０００個の種子当たり約２５ｇ、の重さの種子を作出する。別の好ましい態様において、本発明に従う四倍体スイカ植物は、果実当たり最大約１５０個の種子、好ましくは果実当たり約５０〜約１５０個の種子、好ましくは果実当たり約７０〜約１５０個の種子、更に好ましくは果実当たり約８０〜約１５０個の種子、を作出する。別の好ましい態様において、前記植物は、植物当たり約３〜４個の果実を作出する。別の好ましい態様において、前記植物の果実は、約１２〜約１４％の可溶性固形物を含んでなり、好ましくは約１３％である。別の好ましい態様において、前記植物の果実は、開花から約２４〜約２７日後に成熟する。

別の好ましい態様において、本発明の四倍体スイカは、１又は複数の以下の特徴を有する：
ａ）常用の四倍体の果実よりも有意に小さい、常用の四倍体の約１／３のサイズの果実を作出すること：
ｂ）優れた結果能を示すこと、
ｃ）温室環境で植物当たり３〜４個の果実を作出すること、
ｄ）花から果実への成熟を測定した場合に、通常の四倍体よりも７〜１０日早く成熟すること、
ｅ）種子が常用の四倍体の種子よりも遥かに小さいサイズであること、
ｆ）果皮が通常の四倍体の約１／２〜１／３であること、
ｇ）種子の収率が同じ技術で作った多くの四倍体よりも有意に優れていること。

更に別の好ましい態様において、本発明は、９０−４１９４と表記され、上記特徴を有する、新規で且つ独特の自殖四倍体スイカ系統に関する。

別の好ましい態様において、本発明の四倍体スイカが三倍体スイカの作出のための親として使用される場合、前記三倍体スイカは、非常に薄い皮を有する小さな種無し果実を作出する。好ましくは、当該種無し果実は、約２ｋｇ〜約３ｋｇの重さである。別の好ましい態様において、当該種無し果実の皮は約４ｍｍ〜約１３ｍｍの厚さ、好ましくは約７ｍｍ〜約１１ｍｍの厚さである。

別の好ましい態様において、本発明の四倍体スイカが三倍体スイカの作出のための親として使用される場合、前記三倍体スイカは１又は複数の以下の特徴を有する：
ａ）小さな果実のサイズ、
ｂ）植物当たりより多くの果実、
ｃ）より高い糖含量を有する果実、
ｄ）常用の三倍体の厚さの通常１／２乃至１／３の薄い皮、
ｅ）現在入手可能な三倍体の種無しスイカ果実よりも約７〜１０日早く成熟する三倍体果実、
ｆ）本発明の三倍体が、現在入手可能な三倍体種無しスイカ果実と比較して、空洞病に対してより耐性があること、
ｇ）優れた結果能、
ｈ）約１１％超、好ましくは約１１％〜約１３％の可溶性固形含量。

本発明はまた、本発明の四倍体スイカ系統の種子を含む。本発明はまた、本発明の四倍体スイカの花粉、胚珠、果実、並びに本発明の四倍体スイカ系統を用いた雑種三倍体スイカ種子の作出方法、を含む。本発明は更に、本発明の四倍体スイカ系統と二倍体スイカ系統とを交配することによって作出される三倍体雑種スイカ種子、及びそのような種子から得られる植物、を含み、その果実も含む。

本発明は更に、本発明の四倍体スイカ系統の遺伝的特徴を全て有する種子の作出方法、本発明の四倍体スイカ系統を用いた新規の自殖四倍体系統の発育方法、及び二倍体スイカ系統を用いた四倍体スイカ系統の作出方法、を含む。

本発明は更に：本発明の四倍体スイカ植物と二倍体スイカ植物とを交配することによって三倍体の雑種スイカ種子を作出する方法、を提供する。好ましくは、前記四倍体植物は雌親である。好ましくは、前記二倍体植物は雄親である。

上記方法によって作出される三倍体雑種スイカ種子。

本発明は更に：
三倍体雑種スイカ種子を作出するための方法であって：
ａ）授粉する近さで本発明に従う四倍体スイカ植物の種子及び二倍体スイカ植物の種子を植える段階；
ｂ）前記四倍体スイカ植物の種子よりも７〜１０日早く前記二倍体スイカ植物の種子を植える段階；
ｃ）前記植物が第二の雌花をつけるまでに、前記種子から生じるスイカ植物を栽培する段階；
ｄ）前記雌花が開く日の直前の午後に、前記四倍体スイカ植物の雌花を覆う段階；
ｅ）前記雌花が開く日の早朝に、前記二倍体スイカ植物の雄花を回収する段階；
ｆ）前記雌花に、段階ｅ）で回収した前記雄花を授粉する段階；及び
ｇ）段階ｆ）で授粉した前記雌花から作出される種子を収穫する段階、
を含んで成る方法、を提供する。

本発明は更に：
本発明に従う三倍体スイカ種子を作出する方法であって：
ａ）本発明に従う四倍体スイカ植物の種子及び二倍体スイカ植物の種子を、２列の四倍体スイカ植物対１列の二倍体スイカ植物の列のパターンで畑に植える段階；
ｂ）前記四倍体スイカ植物を、植物当たり約２〜３の枝にまで剪定する段階；
ｃ）前記四倍体スイカ植物の植物上の実質的に全ての雄花及び雄花芽を除雄する段階；
ｄ）前記四倍体スイカ植物の雌花に、前記二倍体スイカ植物の花粉を授粉させる段階；
ｅ）除雄期間の間に授粉した雌花に印をつける段階；及び
ｆ）四倍体スイカ植物の印をつけた果実から種子を収穫する段階、
を含んで成る方法、を提供する。

本発明は更に：
四倍体スイカ種子を作出する方法であって：ａ）本発明に従う四倍体スイカ植物を生育すること；ｂ）前記四倍体スイカ植物に自家授粉させること；ｃ）段階ｂ）の植物から果実を得ること；ｄ）前記果実から四倍体スイカ種子を抜き取ること、を含んで成る方法、を提供する。好ましくは、当該方法は更に、前記種子を洗浄して乾燥させることを含んで成る。

本発明は更に：
植物育種技術を用いた、スイカ植物育種プログラムにおいて四倍体スイカ系統を発育する方法であって、植物育種材料の供給源として、スイカ植物、又はその一部を使用することを含み：育種材料の供給源として、本発明のスイカ植物、又はその一部を得ることを含んで成る方法、を提供する。

本発明は更に：四倍体スイカ植物を作出する方法であって：
ａ）薄皮を有する小さいサイズの果実を作出する二倍体スイカ系統を得ること、
ｂ）前記二倍体スイカ系統の植物を、四倍体変換にかけて四倍体スイカ植物を作出すること、
ｃ）段階ｂ）で得られた四倍体スイカ植物を選択すること、ここで、前記四倍体スイカ植物は、約１．５ｋｇ〜約２．５ｋｇの重さで、且つ約４ｍｍ〜約１０ｍｍの厚さを有する皮を有する果実を作出する、
を含んで成る方法、を提供する。

好ましい態様において、四倍体スイカは、約１．５ｋｇ〜約２ｋｇ、好ましくは約２ｋｇの重さの果実を作出する。別の好ましい態様において、本発明の四倍体スイカの果皮は、約４ｍｍ〜約７ｍｍの厚さである。別の好ましい態様において、四倍体スイカ系統は、１０００個の種子当たり約２０ｇ〜約３５ｇの重さの種子を作出する。別の好ましい態様において、当該四倍体スイカ系統は、果実当たり最大約１５０個の種子、好ましくは果実当たり約５０〜約１５０個の種子、好ましくは果実当たり約７０〜約１５０個の種子、更に好ましくは果実当たり約８０〜約１５０個の種子、を作出する。別の好ましい態様において、当該四倍体スイカ系統は、植物当たり約３〜４個の果実を作出する。別の好ましい態様において、当該四倍体スイカ系統の果実は、約１２〜約１４％の可溶性固形物を含んでなる。別の好ましい態様において、前記四倍体スイカ系統の果実は、開花から約２４〜約２７日後に成熟する。別の好ましい態様において、当該スイカの四倍体系統は、本明細書に開示した特徴のいずれか１つを含んで成る。

別の好ましい態様において、前記二倍体スイカ系統は、二倍体自殖スイカ系統、好ましくは二倍体自殖スイカ系統ＨＤ又は二倍体自殖スイカ系統ＨＤの特徴を有する二倍体自殖スイカ系統、である。別の好ましい態様において、当該二倍体系統は、オリザリンプロトコールを用いて四倍体系統に変換される。

別の好ましい態様において、当該方法は更に、上記段階ｃ）で選択された四倍体スイカ植物に自家授粉することを含んで成る。別の好ましい態様において、当該方法は更に、変異が子孫に観察されなくなるまで、上記段階ｃ）で選択された四倍体スイカ植物を自家授粉することを含んで成る。

本発明は更に：
本発明の四倍体スイカ系統の花粉、胚珠、果実を含む、直前に開示した方法によって得ることができる四倍体スイカ植物、を提供する。

三倍体スイカ種子の商業的作出において、四倍体と二倍体の親の系統は、同一の畑に植えられる。四倍体系統の雌親系統と、二倍体系統の雄親系統との間の他家授粉は、手又はハチ授粉のいずれかによって達成される。三倍体スイカ種子は、二倍体植物の花粉で受精される四倍体植物のメロンにおいてのみ作出される。全ての商業的に生育された種有りスイカは二倍体であり；それ故に二倍体の親としての使用のために多くの二倍体系統が存在する。種無しスイカ品種の開発に対する主要な制限は、有用な四倍体の親系統の入手可能性にある。通常、二倍体の特徴を基に四倍体のスイカ植物の性能を予測することは困難である。良好な二倍体スイカは、良好な四倍体を必ずしも作出しない。更に、良好な園芸学的性質を有する四倍体は、良好な三倍体スイカ雑種を必ずしも作出しない。

四倍体スイカ系統は、通常の二倍体スイカ系統の染色体を倍加することによって発育される。染色体の倍加は、毒性のアルカロイドコルヒチンにより、コルヒチンを新規に出芽したスイカの実生の生長点に散布することによって最初に達成された。組織培養法もZhang, X. P. , B. B. Rhodes, H. T. Skorupska, W. C. Bridges, 1995, Generating Tetraploid Watermelon Using Colchicine in Vitro, G. Lester & J. Dunlap et al. (eds. ), Cucurbitaceae'94: 134-139により開発されてきた。ジニトロアニリンは染色体数を倍加するために使用されており、そしてそれらの有効性はこれまでスイカ以外の作物と比較されてきた。Li等(Li, Ying, J. F.Whitesides, B. Rhodes, 1999, In vitro generation of tetraploid watermelon with two different dinitroanilines and colchicines, Cucurbit Genetics Cooperative Rpt 22: 38-40)は、コルヒチン並びにジニトロアニリン、エタルフルラリン（Ｎ−エチル−Ｎ−２−メチル−２−プロペニル）−２，６−ジニトロ−４−（トリフルオロメチル）ベンザニン）、及びオリザリン（３，５−ジニトロ−Ｎ４，Ｎ４−ジプロピルスルファニルアミド）を用いてin vitroでの染色体の倍加の有効性を比較し、そしてエタルフルラリン又はオリザリンのいずれかがコルヒチンより好ましいと結論付けた。

複数の処理方法が、上文で言及した化学物質を用いて、二倍体から四倍体を誘導するために使用される。１つの方法は、播種の前に種子を処理することである。当該種子は、きれいな水の中に５〜６時間浸され、そして次に当該種子は、コルヒチン溶液（０．２％）又はジニトロアニリン（例えば、３５μＭのオリザリン）のいずれかの中に２４時間浸される。当該種子は、播種前に簡単にすすがれる。乾燥した種子も、前記水にあらかじめ浸すことなく前記化学物質の溶液中に直接浸されることもある。この処理は行うのが単純であり、そして種子の提供に制限がない場合に使用するのに良い方法である。第二の方法は、新規に出芽した苗を処理することである。二倍体の自殖系統は、温室内の苗用の平箱に播種される。土壌の温度は、迅速且つ均一な発芽のために２９〜３１℃で維持される。１滴のコルヒチン（０．１％）又はジニトロアニリン（例えば、３５μＭ）の溶液を、苗が土壌から出芽したらすぐに子葉間の茎頂に添加される。前記コルヒチン溶液を３日間連続で朝又は夜に生長点に散布する。我々は、オリザリンの１回の散布に由来する良好な染色体の倍加を認めた。別の方法は、発芽した種子が土壌内に植えられた後に、発芽した種子の茎頂を処理することである。当該種子は、インキュベーター内で３０℃で発芽する。根(radical)が約２ｃｍ長である場合、発芽した種子の胚軸上の部分は、コルヒチン（０．１％）又はジニトロアニリン（３５μＭのオリザリン）中に逆さまで１０〜１５時間３０℃でインキュベーター内で浸される。当該処理は、根(radical)／根(root)が乾燥されないことを保証するために、高湿度のチャンバー又は箱において実施されるべきである。当該種子は続いて洗浄され、そして土壌内に植えられる。最後の２つの方法は、使用するのがより面倒ではあるが、根系が当該処理によって影響を受けないので、通常四倍体の事象のより良い回復をもたらす。

次の段階は、個々の変換事象から四倍体の系統を発育させることである。形態学的な発現に基づいて選択した四倍体の個体は、自家授粉され、生じた種子は系統として次の世代に植えられる。これらの系統は再び自家授粉され、そして稔性及び園芸学的性質について比較される。これらの系統間に差異がある場合、所望の系統だけが選択される。所望の系統は、当該系統内及び選択した系統間に変動がない場合にまとめて収穫されうる。更なる種子の増大が、隔離ブロックにおいて実施されうる。集団選択が当該隔離プロットにおいて且つその後に、この増大のために実施されうる。当該四倍体の粘性は、次の世代において改善されうる。

四倍体スイカ植物を繁殖させるための組織培養の使用は、Adelberg, J. W. , B. B. Rhodes, Micropropagation from zygotic tissue of watermelon, C. E. Thomas (ed. ) Proc. of the Cucurbitaceae 89 : Evaluation and enhancement of cucurbit germplasm, Charleston S. C., USA;及びZhang et al., Shoot regeneration from immature cotyledon of watermelon, Cucurbit Genetics Coop. 17: 111-115(1994)において更に例示される。

２つの異なる四倍体の交配及び続く組換え育種の経由も、新規な四倍体系統をもたらすことがある。より長期の育種期間が、このアプローチを用いて安定な四倍体系統を発育するのに必要とされる。これは、四倍体が作出する、より多数の組み合わせ及びより少ない種子によるものである。しかしながら、育種者によっては、このアプローチをとることによってより良い進行を達成する。

減数分裂は同質四倍体において時に不規則であるので、二倍体及び異数体がそれらの子孫において生じる。四倍体の葉、花及び花粉粒は、形態学的に二倍体と異なる（Zhang, X. P. , B. B. Rhodes, H. T. Skorupska, W. C. Bridges, 1995, Generating Tetraploid Watermelon Using Colchicine in Vitro, G. Lester & J. Dunlap et al. (eds. ), Cucurbitaceae '94: 134-139）。これらの形態学的な性質は、育種者が有性繁殖の間に四倍体の個体群において生じる二倍体及び異数体を排除するのを助けることができる。

三倍体の種子は、２つの方法、ハチ授粉法及び人工授粉法を用いて現在作出されている。米国においては、ハチ授粉法は、三倍体スイカ種子を作出するために使用されている。ほぼ全ての米国の三倍体スイカ種子の作出が北カリフォルニアでなされている。作出地には、典型的に２列の四倍体雌系統対１列の二倍体雄系統の比率で植えられる。全ての雄花芽が成熟して雌の四倍体植物から摘まれる。この過程は摘芽(de-budding)として知られている。雌花はハチによって自然授粉される。摘芽期間の結果に印をつけ、そして四倍体雑種種子用に収穫する。雄芽は成熟すると四倍体の雌の蔓から授粉の季節を通じて摘まれる。雄性不稔性四倍体系統が入手可能である場合、労働者は、四倍体の雌の列にある雄性不稔性植物をはるかに短い時間と努力で容易に取り除くことができる。当該雄性不稔性植物上の全ての結果が雑種三倍体種子用に収穫され得る。印をつけた雄性不稔性系が使用される場合、採種者は、当該雌四倍体系統及び雑種三倍体種子に雌のオフ型(off-type)が存在しないことを保証し得る(Zhang, X. P. and B. B. Rhodes, 2000, Method using male sterility and a marker to produce hybrid seeds and plants ; U. S. Patent 6,018,101)。

人工授粉は、隔離が利用できず、且つ複数の三倍体雑種が同一の畑のブロックで作出される領域において三倍体スイカ種子を作出するために主に使用される。自殖雄親系統は、自殖雌四倍体親系統よりも７〜１０日早く植えられる。当該雄親は、通常交配ブロックの外側に配置される。雄親当たり約４〜１０の四倍体雌親が、適当な授粉を保証するために植えられる。当該雄親は、雄花が回収される前にその均一性について慎重に検査される。植物の形態学及び胚珠の特徴に基づいて認識されうるあらゆるオフ型が取り除かれる。授粉は、当該四倍体の雌親の第二の雌花が開花の準備ができたときに開始する。当該四倍体雌親系統の雌花芽が同定され、そしてそれらが次の朝に咲く前に、紙コップ又は小さい紙袋で覆われる。二倍体雄親系統の雄花は、ハチ又は他の花粉媒介昆虫が花を訪れる前に早朝に回収される。覆われた雄花芽は、続いて覆いが取られ、そして回収した新鮮な雄花を用いて授粉される。授粉された雌花は続いて回収され、そして印がつけられる。雌親植物上の自然授粉した果実は、人工授粉した果実の発育を保証するために定期的に取り除かれる。雄株は、授粉が完了した後、雌親由来の果実のみが収穫されることを保証するために、畑から取り除かれる。

本発明の四倍体系統の発育
二倍体スイカ系統の四倍体系統への変換で通常見られる問題は、当該四倍体系統の受精率が劇的に低下するということである。このことは低い結果をもたらし、そしてしばしば遅い結果及び遅い果実の熟成と相関する。その結果、四倍体スイカ種子の作出は効率が悪く、且つ費用がかかり、そして四倍体スイカは三倍体雑種種子の作出にとって通常良好な親ではない。本発明の目的は、それ故に、これらの受精の問題を克服し、同時に本願に開示されている有利な特徴を有し、且つこれらの特徴をそれらの三倍体子孫に完全に又は少なくとも部分的に伝達することができる四倍体スイカを作出することである。

二倍体自殖スイカ系統ＨＤは、二倍体種有りスイカ雑種の作出のための親系統として使用される、所有者がＳｙｎｇｅｎｔａの系統であり、これは四倍体変換の候補として同定された。二倍体系統ＨＤは、薄皮を有する小さいサイズの種有り果実を作出し、且つ優れた結果を有する。更に、二倍体系統ＨＤは、高い糖含量を有する果実を作出し、そして堅い果肉を有する。二倍体スイカ系統ＨＤを四倍体変換にかけた。

自殖系統９０−４１９４は、二倍体自殖系統ＨＤを四倍体スイカに変換することによって北カリフォルニアで開発された。二倍体（２Ｘ）から四倍体（４Ｘ）への変換は、以下の段階を含んで成るオリザリンプロトコールを用いて達成された：

１９９９年１１月、ＨＤの種子を温室内の５０個の細胞のプラスチック製実生トレイ中に播種した。１滴の３５μＭオリザリンを、新規に出芽した実生のそれぞれの２つの子葉間の分裂組織の先に添加した。オリザリンによる全ての実生の処理は、植えてから約１０日後に完了した。

苗に定期的に水を与えて受精させた。

１９９９年の１２月の終わりに、推定される四倍体を、温室内の、Ｐｒｏ−Ｍｉｘ ＢＸの土壌を用いない土壌(soil-less soil)で満たした２ガロンの鉢内に移植した。植物の発育の経過の間、二倍体（未変換）の植物及び枝は、葉の形態学及び雄花の特徴に基づき取り除かれた。

続いては、四倍体スイカ系統、例えば自殖系統９０−４１９４、の発育の年代順である：

世代 季節／年 説明
Ｔ₀ 春／２００年 実生の移植段階で、７２個の推定上の四倍体が温室内の２ガロンの鉢内に移植された。変換していない植物及び枝を、葉の形態学及び雄花の特徴に基づいて同定し、そして取り除いた。約２０個の四倍体が同定され、そして真の四倍体植物／枝由来の雌花のみが自家授粉された。完全に果実が成熟したとき、大きな果頂部の傷跡（その二倍体版のものの２〜３倍）を有する果実が収穫され、そして果実当たりの種子の数によって示唆されるような稔性について試験された。四回の個別の選択、４ＸＨＤ−１，−２，−３,及び−４及び１回の一まとめの選択、４ＸＨＤ−ＢがＴ₁世代を植えるために行われた。

Ｔ₁ 夏／２０００年 ４ＸＨＤ−１及び４ＸＨＤ−２を更なる選択及び種子の増大のために温室内に植えた。４ＸＨＤ−３及び４ＸＨＤ−４を畑の観察及び種子の増大のために畑内に植えた。４ＸＨＤ−Ｂは、三倍体雑種を生成するために、畑内の交配ブロックに植えられた。４ＸＨＤ−２は、実生段階で４ＸＨＤ−１ほど良くなく、そして排除された。４ＸＨＤ−１の４２個の植物は、温室内で成熟するまで生育された。４ＸＨＤ−１の全ての種子が一まとめで収穫され、そして変動がこの系統で観察されなかったので４ＸＨＤ−１−Ｂとして標識された。４ＸＨＤ−３内及び４ＸＨＤ−４内並びにそれらの間で変動は観察されなかった。従って、種子も一まとめで収穫され、そして４ＸＨＤ−３／４と標識された。

秋／２０００年 ４ＸＨＤ−Ｂ由来の５つの三倍体雑種がフロリダで評価された。３つの雑種が独特で且つ有望な三倍体雑種であった。

Ｔ₂ 春／２００１年 約７００個の植物の４ＸＨＤ−１−Ｂを、世代の進行及び種子の増大のためにプラスチック製の温室内に植えた。人工授粉を行った。変動は観察されなかった。全ての果実が均一で、純種であった。種子を一まとめで収穫し、そして９０−４１９４と命名した。

Ｔ₃ 夏／２００１年 約３５００個の植物の９０−４９４を、ハチ授粉を用いて、原種のために１エーカーの隔離プロットに移植した。１２００個の植物の９０−４１９４を、人工授粉によって、原種の増大のために２つのネットで覆われた籠の中に植えた。籠及び畑の栽植からの変化は観察されなかった。育種工程が完了し、そして収穫された種子は原種としての役割を果たす。

本発明の四倍体スイカ系統、例えば自殖系統９０−４１９４の独特の特徴は、以下の用に説明される。以下に示す値は、北カリフォルニアでの夏の条件下で生育した植物についてのものである。当該植物が実質的に異なる条件下で生育した場合、変化が観察されることもある。

本発明の四倍体スイカ系統は、非常に早期に成熟する四倍体のスイカである。例えば、９０−４１９４の果実は、北カリフォルニアの夏の条件下で開花から２４〜２７日後に成熟した。他の市販の四倍体は、同一条件下で少なくとも３５日かかる。

本発明の四倍体スイカ系統の果実は非常に小さく、約１．５ｋｇ〜約２．５ｋｇ、好ましくは約１．５ｋｇ〜約２ｋｇ、好ましくは約２ｋｇであり、これは商業的に使用されている四倍体のサイズのわずかに約１／４〜１／３である。果実の形状は丸く、そして皮の色は、緑色の鉛筆の線が入った薄緑色である。果肉は堅く、そして屈折計（％）で約１２％〜約１４％、好ましくは約１３％の可溶性固形物（大部分が糖）の赤味を有する。

本発明の四倍体スイカ系統の種子は小さく、好ましくは１０００個の種子当たり約２０ｇ〜約３５ｇ、好ましくは１０００個の種子当たり約２３ｇ〜約３３ｇ、好ましくは１０００個の種子当たり約３１ｇ、別の好ましい態様においては１０００個の種子当たり約２５ｇであり、これは商業的に使用されている四倍体の約１／２〜１／３である。

本発明の四倍体系統は、良好な種子の収率を有する。種子の収率は、当該四倍体系統が自家授粉される場合、又は当該四倍体系統が、三倍体種子を作出するために二倍体の雄親により授粉される場合に高い。好ましい態様において、本発明の四倍体系統は、果実当たり最大１５０個の種子、好ましくは果実当たり約５０〜約１５０個の種子、好ましくは果実当たり約７０〜約１５０個の種子、更に好ましくは果実当たり約８０〜約１５０個の種子、を作出する。別の好ましい態様において、本発明の四倍体系統は、果実当たり平均約８０個の種子を作出する。種子の色はメディウムブラウンである。

皮は非常に薄く、約４ｍｍ〜約１０ｍｍ、好ましくは約４ｍｍ〜７ｍｍであり、これは商業的に使用されている四倍体の約１／２〜１／３である。この薄い皮は、大きな相対湿度の変動がある乾燥条件下で容易に裂ける。

本発明の四倍体系統は、貧しい環境的条件下で優れた結果能を有する。９０−４１９４が、プラスチック製の温室内で、補光無しに２００１年の初春にＳｙｎｇｅｎｔａのウッドランドリサーチステーションで他の２３の二倍体及び１つの四倍体育種系統と生育したとき、それは、普通に結果した唯一のスイカ系統であった。スイカ系統の多くが、貧しい生育条に起因して全く果実を作出しなかった。

本発明の四倍体系統は、植物当たり多数の果実を作出することができる。例えば、９０−４１９４の１つの植物は、植物当たり４個ほどの果実をつけることができる。本発明の四倍体系統はまた、長期間果実を作出することができる。例えば、９０−４１９４は、原種の増大の間、２００１年夏に北カリフォルニアにおいて１回の栽植から２つ作物を作出した。最初の結果の収穫後、９０−４１９４は、優れた種子の収率で第二の結果を作出した。

本発明の四倍体系統は、約３ｋｇ以下、好ましくは約２．５ｋｇ以下の果実のサイズを有する三倍体雑種を作出する。全ての伝統的な三倍体雑種が遥かに大きい果実を有し、大部分が６ｋｇ超である。好ましくは、当該三倍体雑種の果実は、更に以下の特徴のうちの１つを含んで成る：小さい果実のサイズ、植物当たりより多くの果実（好ましくは、植物当たり３〜４個の果実）、より高い糖含量、薄皮（種無し果実の皮は、約４ｍｍ〜約１３ｍｍ、好ましくは約７ｍｍ〜約１１ｍｍである）、常用の三倍体の通常の１／２〜１／３の厚さ、当該三倍体の果実が、通常の三倍体種無しスイカ果実よりも約７〜１０日早く成熟すること、本発明から発育した三倍体が空洞病に対してより耐性があること、優れた結果能、約１１％超、好ましくは約１１％〜約１３％の可溶性固形物含量。

本発明の四倍体スイカ自殖系統は、栄養繁殖及び有性繁殖を介して増殖し得る。栄養繁殖は、好ましくは新茎の貫生を介して行われ、そして次に組織培養において発根する。詳細な方法は、Zhang等によって説明されている（Zhang, X. P. , B. B. Rhodes, H. T. Skorupska, W. C. Bridges, 1995, Generating Tetraploid Watermelon Using Colchicine in Vitro, G. Lester & J. Dunlap et al. (eds. ), Cucurbitaceae'94: 134-139）。この方法を以下に簡単に説明する：Ａ）温室、畑又は研究室で生育した９０−４１９４の植物から茎頂及びえき芽を回収する。水道水(tape water)で３０分から１時間茎頂及びえき芽をすすぐ。１０％の家庭用漂白剤で８〜１０分間茎頂及びえき芽を滅菌する。茎頂及びえき芽を滅菌蒸留水中で３回すすぐ。Ｂ）新茎の貫生のために１０μＭのＢＡを含むムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地上で茎頂及びえき芽を培養する。継代培養を３〜４週ごとに行う。Ｃ）５〜１０μＭのＩＢＡを含むＭＳ培地上で貫生した茎の芽を約２週間発根させる。Ｄ）発根した小植物を温度及び湿度を制御した温室内で順化させる。Ｅ）隔離プロット内で微細繁殖した植物を生育し、そしてこれらの植物から種子を収穫する。

四倍体スイカは、通常種子を介して有性繁殖される。我々は、温室内で、ネットで覆われた籠内で、且つ露地で自殖系統９０−４１９４を繁殖させるのに成功した。種子増大用の畑は、当該種子の増大が露地で行われる場合、少なくとも１．５ｋｍあらゆる他のスイカから隔離されるべきである。良好な害虫管理及び栽培の慣習が使用されるべきである。より高レベル（市販の雑種果実の作出に使用されているものよりも２０〜３０％高い）のリン酸塩及びカリウムの肥料が、高い種子の作出及び良好な種子の品質にとって有益である。カルシウムは、果実が割れることに起因する果実の損失を最小化するために、低カルシウムで畑に添加される。ハチの巣箱が、種子の作出にとって重要な生物学的事象である良好な授粉を保証するために種子作出用の畑に置かれる。果実は、好ましくは果実が割れ、そして劣化する前に収穫される。収穫された果実は、続いて、果実から種子を抜き取る前の期間室温で保存され、更なる胚の発育及び種子の成熟を当該果実内で行わせる。当該種子は、果肉から抜き取った後、徹底的に洗浄され、そして強制空気乾燥機を用いて種子の生存性を最良に維持するために素早く乾燥される。

四倍体スイカの主な使用は、種無し果実を作出する三倍体雑種スイカを生成することにある。当該四倍体系統は、二倍体スイカ系統の雄親の系統と交配するための雌親として使用される。所望の三倍体雑種の作成は、四倍体の親の性能、特に種子の作出能、及び組み合わせ能力に大きく依存する。本発明の四倍体スイカ自殖系統、例えば９０−４１９４系統は、優れた果実の品質、小さい果実のサイズ（２〜３ｋｇの個人用サイズ）、早い成熟度及び優れた結果能、を有する三倍体種無しスイカ雑種を作るための新規な四倍体系統である。

小さい果実、理想としては８ポンド（３．６３ｋｇ）未満、好ましくは６ポンド（２．７２ｋｇ）未満、のサイズを基に二倍体の雄親を選択することが好ましい。尚、三倍体のスイカについて望まれる皮の色及びストライプのパターンは、本発明の四倍体の皮の色及びストライプのパターン（無し）が、他の全ての皮の色及びストライプのパターンに対して劣性であるので、二倍体の雄親から選択される。二倍体の雄親はまた、三倍体果実中の白い種子の胚珠のサイズを小さくするために、それらの小さい種子のサイズについて選択される。

多くの四倍体は、それらが温室で生育された場合に三倍体の種子を作出することが非常に困難であるか、あるいは作出することを失敗する。しかしながら、自殖系列９０−４１９４は、温室において良好な種子の収率で三倍体の種子を作出した。自殖系列９０−４１９４はまた、畑においても三倍体の種子を作出した。本発明の四倍体スイカ系統は、三倍体雑種を作るのに非常に良好な組み合わせ能を有する。例えば、制限付きの調査により、５つの所望の三倍体雑種が、９０−４１９４自殖系統と、異なる二倍体雄系統とを交配することによって作られた。

一旦適切な組み合わせを決定すると、本発明の四倍体自殖系統から三倍体種子を作出するために複数の方法が使用されうる。２つの一般的に使用される方法を、例として９０−４１９４系統に関して本明細書で説明する。これらの方法に対する変更は、実際の作出状況に従い行われ得る。

人工授粉法。これは、９０−４１９４から三倍体種子を作出するために最も頻繁に使用される方法である。自殖の四倍体雌親９０−４１９４及び自殖の二倍体雄親系統は、同一の畑に植えられる。自殖の雄親は、授粉時に適当な花粉の供給を保証するために、雄親の９０−４１９４よりも７〜１０日早く植えられる。雄親及び雌親９０−４１９４は、１の雄親対４〜１０の雌親の比率で植えられる。二倍体の雄親は、授粉の間に効率的な雄花の回収のために畑の最上部に植えられてもよい。授粉は、四倍体の雌親９０−４１９４上に第二の雌花が開花する準備ができたときに開始される。次の日に開花する予定の雌花芽は同定され、雌花に対してハチ又はあらゆるほかの昆虫が訪問するのを防ぐ紙コップ又は小さい紙袋で覆われ、そして次の朝容易に理解できるあらゆる種類の材料で印をつけられる。この過程は、最良には午後行われる。二倍体雄親の雄花は、それらが開いて花粉媒介昆虫が訪問する前に早朝に回収される。開花した、四倍体雌親の覆われた雄花は、覆いが取られ、そして二倍体雄親の回収された新鮮な雄花により、当該雄花が花粉を落としたらすぐに開始して授粉される。授粉された雌花は、ハチ及びあらゆる他の昆虫の訪問を防ぐために再び授粉後に覆われる。授粉された雌花はまた印を付けられる。印を付けた果実のみが、三倍体雑種の種子を抜き取るために収穫される。

ハチ授粉法。ハチ授粉法を用いて、四倍体雌親９０−４１９４と二倍体雄親は、通常２列の四倍体親対１列の雌親の比率で植えられる。雌性の四倍体植物は、２〜３の枝にまで剪定される。雌性の四倍体親植物上の全ての雌花芽が成熟したら、授粉期の間毎日取り除かれる（摘芽過程）。ハチの巣箱は、雄親から雌親の雌花への、ハチによる花粉の移動のために、畑に置かれる。この摘芽期間の間の結果に印を付ける。印を付けた果実だけが雑種の三倍体種子を抜き取るために収穫される。

自殖系統の９０−４１９４の果実は、それらが成熟に達したとき、その極度に薄い皮に起因して容易に割れる。これは、種子の作出が劇的な湿度の変動条件下で行われるときには深刻な問題となりうる。従って、当該果実は割れる直前に収穫され、そして日陰で又は蔓のもとで２〜３週間保存される。皮は、果実が蔓から取り除かれたときには長持ちし、そして胚は収穫された果実内で発育しつづけ、より良い種子の品質をもたらす。

本発明の四倍体の自殖系統は、新規な四倍体系統を発育するための親系統として使用される。本発明の四倍体スイカ系統、例えば９０−４１９４系統の独特で望ましい性質は、新規な四倍体自殖系統の発育における親系統としてそれを非常に有用なものにする。そのような系統は、別の自殖又は雑種の四倍体と交配して新規な四倍体自殖系統を開発するための、雌親又は雄親のいずれかとして使用されうる。

実施例１：四倍体自殖系統９４−４１９４の説明
果実： 丸くて小さい
最良の適用領域： ほとんどの領域
開花の発生： 市販の四倍体品種９０−４２３１よりも５日早い
授粉から成熟： 市販の四倍体品種９０−４２３１よりも７日早い
倍数性： 四倍体
子葉： 平坦
性別： 雌雄同種
主茎数： 樹冠で３つ
最初の結果時の花の数： １８個の雄花
４個の雌花
茎： 丸くて毛じのある、第二の節が７ｍｍの直径のもの
節間の長さ： ７ｃｍ
最初の結果時の花： ３ｃｍの直径の雄花
３ｃｍの直径の雌花
黄色
成熟した果実のサイズ： 丸い、１５ｃｍの長さの、１５ｃｍの中央部分の直径の
２ｋｇの平均重量の、滑らかな、鉛筆の線の斑／網を有
する薄緑色の皮のもの
皮： 脆い、４ｍｍの厚さの果頂部、７ｍｍの厚さの側面
果肉： サクサクした、小さな線維により堅さのある、メディウ
ムレッドの、１３％の可溶性固形物のジュースの、空洞
病、胎座剥離又は横割れの無いもの
種子： ７ｍｍの長さの、５ｍｍの幅の、２ｍｍの厚さの、指数
（長さ÷幅×１０）が１４の、１０００個の種子当たり
３１ｍｇの、果実当たり８０個の種子の、暗褐色のもの日焼け： 抵抗性あり

対照的に、市販の四倍体系統９０−４２３１は、約６〜７ｋｇの果実のサイズを有し、そして空洞病、胎座剥離及び、横割れを発現する。

要約すると、本発明の自殖四倍体スイカ系統９０−４１９４の独特さには、以下のものが含まれる：ａ）四倍体９０−４１９４は、常用の四倍体の果実よりも有意に小さい、常用の四倍体の約１／３のサイズの果実を作出すること；ｂ）四倍体９０−４１９４は、特別な結果能を示すこと。ホンジュラスにおいては、四倍体９０−４１９４は、１回の栽植から３つの作物（四倍体植物からの三倍体種子の収穫）を作出することができるが、常用の四倍体植物は、そのような収穫でわずかに１つ可能である。同様に、カリフォルニア、ペルー、及びチリにおいて、本発明の９０−４１９４は一回の栽植から２つの作物を作出する。ｃ）四倍体９０−４１９４は、温室の設定において植物当たり３〜４個の果実を作出するが、常用の四倍体は典型的に、植物当たり平均１個未満の果実を作出すること。ｄ）四倍体９０−４１９４は、花から果実への成熟を測定した場合、通常の四倍体よりも７〜１０日早く成熟すること。ｅ）本発明の９０−４１９４の四倍体の種子は、常用の種子よりもサイズが遥かに小さいこと。常用の四倍体スイカの１２〜１７個の種子で１ｇとなる。対照的に、本発明の９０−４１９４の３５〜３９個の種子で１ｇとなる。ｆ）９０−４１９４の果皮が通常の四倍体の約１／２〜１／３であること。ｇ）９０−４１９４の四倍体植物の種の収率が、同一の技術で作られる多くの四倍体よりも有意に良いこと。９０−４１９４は、二倍体の雄親で授粉された場合、果実当たり１５０個ほどの三倍体の種子を作出する。最近開発された四倍体スイカの多くが、典型的に、二倍体雄親で授粉した場合、果実当たり約１０〜７５個の三倍体の種子を作出する。

実施例２：三倍体スイカ果実
本発明の四倍体植物によって作出された三倍体種子から生育される三倍体スイカ果実は、商業的に重要で且つ新規な性質を示す。

例えば、本発明に従う９０−４１９４によって作出される三倍体の独特さは、常用の種無しスイカと比較して、ａ）小さい果実のサイズ、ｂ）植物当たりより多くの果実、ｃ）より高い糖含量（ＳＳＣ）（以下の表１を参照のこと）、ｄ）常用の三倍体の通常１／２乃至１／３の厚さの薄い皮、ｅ）通常の三倍体種無しスイカ果実よりも約７〜１０日早い三倍体果実の成熟、ｆ）本発明の四倍体から発育する三倍体が、三倍体種無しスイカの一般的な欠点である空洞病に対してより耐性があること。三倍体種無しスイカＲＷＴ８１２３及びＲＷＴ８１２４に対する空洞病は観察されていない。ＲＷＴ８１２３及びＲＷＴ８１２４は、９０−４１９４によって作出される三倍体である。及びｇ）優れた結果能、を含む。

表１は、平均重量（Ａｖｇ．Ｗｔ．）、植物当たりの果実の数（Ｆｒｔ／ｐｌａｎｔ）及び果肉中の可溶性固形物の量（大部分が糖）（ＳＳＣ％）を示す。Ｔｒｉ−Ｘ−３１３は、雌親として常用の四倍体スイカを用いた、標準的なサイズの商業的な三倍体種無しスイカである。ＲＷＴ８１２３及びＲＷＴ８１２４は、本発明の四倍体９０−４１９４を雌親として用いた、三倍体種無しスイカである。Ｔｒｉ−Ｘ−３１３、ＲＷＴ８１２３、及びＲＷＴ８１２４の雄性の二倍体の親は、それらの有意に異なる表現型について選択された。

以下の表２は、ＲＷＴ８１２４の果実（上文を参照のこと）が通常の三倍体スイカよりも遥かに小さいこと、及びＲＷＴ８１２４の結果が、植物当たりの果実数で表すように、市販の種無しスイカのものよりも遥かに多いこと、を示す。

本発明の方法によると、小さい、理想としては８ポンド（３．６３ｋｇ）未満の、果実のサイズに基づいて二倍体の雄親を選択することが好ましい。尚、当該三倍体スイカに望まれる皮の色及びストライプのパターンは、９０−４１９４の皮の色及びストライプのパターン（無し）が、他の全ての皮の色及びストライプのパターンに対して劣性であるので、二倍体の雄親から選択される。二倍体の雄親はまた、三倍体果実中の白い種子の胚珠のサイズを小さくするために、それらの小さい種子のサイズについて選択される。

前述の発明はやや詳細にこの文書において説明されているが、特許請求の範囲によってのみ限定するように、変更及び修正が本発明の範囲内で行われ得ることは自明であろう。

寄託
出願人は、二倍体自殖スイカ系統ＨＤ[ＨＤ（２Ｘ９０−４１９４）]の少なくとも２５００個の種子をAmerican Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Virginia, 20110-2209 U.S.Aに寄託した。ＡＴＣＣ寄託番号はＰＴＡ−５１４６である。二倍体自殖スイカ系統ＨＤのこの寄託は、公共の寄託機関であるＡＴＣＣ寄託機関において、３０年間、又は最も新しい請求から５年間、又は特許の有効期間、のいずれか長い間維持され、そしてその期間の間に死滅したような場合には置き換えられる。更に、出願人は、試料の生存性の指針の提供を含む、37 C.F.R. §§1.801〜1.809の要求を全て満たしている。出願人は、ＡＴＣＣ由来の寄託材料の生存性に何ら制限を設けていないが、出願人は、生物学的材料の譲渡又はその商業目的の輸送に対し法によって課されているあらゆる制限を撤回する権限はない。出願人は、本特許又は植物新種保護法(7 USC 2321以下参照)のもと許諾されている権利のあらゆる侵害を見過ごさない。

前述の発明は、明確性及び理解のための例示及び実施例によって詳細に説明した。しかしながら、若干の変化及び変更、例えば１つの遺伝子の修飾及び突然変異、ソマクローナル変異、インスタントな近交系の植物の大きな個体群から選択される変異個体等が、特許請求の範囲によってのみ限定されているような本発明の範囲内で実施されうることは自明である。このように、前述の特許は本文書においてある程度詳細に説明したが、変化及び変更は、特許請求の範囲によってのみ限定されるような本発明の範囲内で実施されうることは自明である。

本明細書で引用した全ての文献は、引用によってその全体が本明細書に組み入れられる。

Claims (11)

1. 四倍体スイカ植物を作出する方法であって：
   ａ）代表的な種子がＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５１４６のもと寄託されている、二倍体スイカ系統を得ること、
   ｂ）前記二倍体スイカ系統の植物を、四倍体変換にかけて四倍体スイカ植物を得ること、
   ｃ）段階ｂ）で得られた四倍体スイカ植物を選択すること、
   を含んで成る方法。
2. 前記段階ｂ）が、前記植物をオリザリン処理にかけることを含んで成る、請求項１に記載の方法。
3. ｄ）段階ｃ）で選択される四倍体スイカ植物を自家授粉すること、を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
4. ｄ）段階ｃ）で選択される四倍体スイカ植物を、子孫において変化が観察されなくなるまで自家授粉すること、を更に含んで成る、請求項３に記載の方法。
5. 三倍体スイカ種子を作出する方法であって：
   ａ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で作出された四倍体雌親スイカ系統９０−４１９４の種子及び二倍体雄親スイカ植物の種子を畑に植える段階；
   ｂ）前記種子から生じたスイカ植物を栽培する段階；
   ｃ）前記四倍体雌親スイカ系統９０−４１９４の植物上の雄花及び雄花芽を除雄する段階；
   ｄ）前記四倍体雌親スイカ系統９０−４１９４の雌花に、前記二倍体スイカ植物の花粉を授粉させる段階；
   ｅ）授粉した雌花の果実に印をつけ、印のついた果実を作出する段階；及び
   ｆ）印のついた果実から種子を収穫する段階、
   を含んで成る方法。
6. 前記四倍体雌親スイカ系統９０−４１９４の種子と前記二倍体雄親スイカ植物の種子とが２列の雌親対１列の雄親の列のパターンで植えられる、請求項５に記載の方法。
7. 段階ｃ）の前に、前記雌親四倍体スイカ系統９０−４１９４の植物を、植物当たり約２〜３の枝にまで剪定する段階を更に含んで成る、請求項５に記載の方法。
8. 四倍体スイカ植物を作出する方法であって：
   ａ）代表的な種子がＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５１４６のもと寄託されている、自殖二倍体スイカ系統ＨＤを得ること、
   ｂ）前記二倍体スイカ系統の植物を、四倍体変換にかけて四倍体スイカ植物を得ること、ｃ）段階ｂ）で得られた四倍体スイカ植物を選択すること、
   を含んで成り、ここで、前記四倍体スイカ植物は、約１．５ｋｇ〜約２．５ｋｇの重さで、且つ約４ｍｍ〜約１０ｍｍの厚さを有する皮を有する果実を作出する、
   方法。
9. 前記段階ｂ）が、前記植物をオリザリン処理にかけることを含んで成る、請求項８に記載の方法。
10. ｄ）段階ｃ）で選択される四倍体スイカ植物を自家授粉すること、を更に含んで成る、請求項８に記載の方法。
11. ｄ）段階ｃ）で選択される四倍体スイカ植物を、子孫において変化が観察されなくなるまで自家授粉すること、を更に含んで成る、請求項１０に記載の方法。