CN108834604A - 马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种远缘杂交的方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种远缘杂交的方法，包括：培育砧木；培育接穗；嫁接；远缘杂交，获得实生种子；其中，砧木为二倍体野生马铃薯种；接穗为马铃薯四倍体栽培种。该方法将马铃薯栽培种与二倍体野生种嫁接为一体，二者通过营养物质和遗传物质的相互交流，生理上无限接近，使得接穗四倍体栽培种作为母本开花后，对父本砧木二倍体野生种的花粉亲和性增强，杂交座果率显著增加，并获得远缘杂交种子。
Description
技术领域
本发明属于马铃薯远缘杂交育种技术领域，是一种解决马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种杂交结实困难的方法。本方法适用于从事植物科研育种及生产的单位、公司和个人。
背景技术
马铃薯是全球第三大重要的粮食作物，2015年被我国列为第四大主粮作物，但我国马铃薯单产低于世界平均水平，产量的提高依赖于优良品种，生产上应用马铃薯四倍体栽培种具有遗传背景狭窄，抗性基因库贫乏，亲缘关系近的特点，因而拓宽马铃薯育种的遗传基础显得尤为重要。
马铃薯原产南美洲安第斯山，不同倍性种质资源在自然界中大量存在，马铃薯为多倍性作物，染色体基数n＝12，有二倍体(2n＝24)，三倍体(2n＝36)，四倍体(2n＝48)，五倍体(2n＝60)和六倍体(2n＝72)。根据霍克斯的研究，在所有能结块茎的“种”中，约有74％为二倍体，四倍体占11.5％，其他倍性的“种”所占比例很小。其中四倍体栽培种马铃薯是高度杂合、无性繁殖作物，二倍体种中包含了绝大多数的原始栽培种和野生种，这些“种”在原产地生活了数千年，长期的自然选择形成了对病虫害的高度抗性和不良环境的耐性，是马铃薯抗病、抗虫、耐不良环境条件和其它专用品种选育的重要资源。野生种在育种工作中的巨大潜力，愈来愈被世界各国的育种家所重视，欧洲各国和美国育成的品种中已渗入一个或多个野生种的亲缘。
在开展种间杂交过程中，由于种间杂交所存在的种种障碍，能成功地利用于马铃薯育种工作中的“种”是极少数的，据统计不超过5％。杂交是否亲和，不能以授粉后雌蕊是否受精或母本是否结果而定，主要是杂交后能够产生有生命力的后代，只有产生了正常的后代，才视为杂交亲和。
种间杂交不亲合的内部因素主要有：在相异的柱头上或花柱中，花粉粒发芽不正常或花粉管生长受阻，或花粉管在花柱中破裂；花粉管虽然能在花柱中生长，但不能受精；能受精但胚不能正常发育或胚乳败育而不能形成种子；形成瘪缩种子而不能发芽等。科研实践中常采用以下途径解决种间杂交不亲和的难题：
(1)采用桥梁品种；(2)亲本的正反交；(3)染色体加倍；(4)利用体细胞杂交或细胞融合；(5)倍性水平控制。其中倍性水平控制在马铃薯常规育种中成果显著，它包括两方面内容，双单倍体和2n配子的利用。1985年皮洛昆证明二倍体水平是种间杂交和传递有用基因的最有效的倍性。因此，育成的优良栽培品种的2x无性系(即双单倍体)，不仅可与许多二倍体种杂交，且可与异源多倍体种杂交。二倍体水平上育种，虽然能有效地结合多抗性等有用基因，但根据马铃薯杂种优势理论，基因的相互作用影响丰产性，更由于四倍体杂合性强，适应性广，够在多种环境下稳产高产。对产量和农艺性状来说，马铃薯最佳倍性水平是四倍体。因此，最终须使二倍体转化为四倍体，才有利用价值。2n配子的利用，指四倍体与具有FDR(第一次分裂重组)的2n配子的花粉的二倍体植株进行杂交，产生4x-2x杂种。利用FDR产生的2n配子的2x作亲本可把80％的杂合性传递给后代，减少4x杂种分离程度，为实生种子(TPS)利用提供了新的途径。
自然条件下马铃薯野生种产生2n配子的频率很低，而且限制在几个特殊的种内，马铃薯野生资源的开发利用受到限制。
因此，如果二倍体野生种能与四倍体栽培种有较强的杂交亲和性，那么将会产生较多品质优良、抗逆性强的马铃薯新种质材料，这将为拓宽常规马铃薯育种的遗传背景奠定物质基础。
发明内容
本申请的目的在于提供一种马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种远缘杂交获得实生种子的方法，提高座果率和结实率。
为达到上述目的，本申请提供一种马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种远缘杂交获得实生种子的方法，包括：培育砧木；培育接穗；嫁接；远缘杂交，获得实生种子；砧木为二倍体野生马铃薯种；接穗为马铃薯四倍体栽培种。远缘杂交父本为砧木品种，母本为嫁接连接体。
优选地，其中，砧木的培育为：二倍体野生马铃薯种放于室温散射光下进行催芽处理，待嫩芽长1-2mm时，穴播于基质为草炭土的营养钵中，覆土15cm；白天保持20℃-25℃，夜间10℃-15℃；砧木培育过程中，马铃薯幼苗长至1-5片成熟叶时，作为砧木准备嫁接。
优选地，其中，接穗的培育为：将马铃薯四倍体栽培种播种于苗盘中，基质为草炭土，覆土厚度为5cm-8cm；四倍体栽培种为选用马铃薯品种冀张薯8号、冀张薯12号的脱毒苗后代原原种；接穗培育过程中，幼苗出土约1cm-10cm时，作为接穗准备嫁接。
优选地，其中，嫁接为：嫁接前先用75％的酒精擦拭刀片和手，进行消毒；准备砧木：去除砧木的顶芽，保留下面1-2片叶，采用劈接法，用双面刀片从砧木顶端切除砧木的生长点，然后纵切，刀口深度约1.0-1.5cm；准备接穗：用刀片将接穗幼苗从基部切下，摘去全部叶片，然后用刀片将接穗削成楔形，楔面大小与砧木切口大小一致，保持楔面干净整洁；嫁接：将接穗插入砧木切口，使二者切口对齐，然后用嫁接夹固定砧木与接穗。
优选地，其中，还包括：嫁接后，用50％多菌灵1g/L溶液对砧木和接穗及周围环境进行消毒，套上消毒的塑封袋，进行保湿保温处理，保持温室湿度在75％以上，温度白天保持在25-30℃，夜间15-18℃；嫁接后2-3天，及时清除感染病苗，发病较轻的去除有病叶片，及时用50％多菌灵800倍液喷施防治；一周后，当接穗开始生长时，去除塑封袋，此时湿度维持在70％，白天保持25-28℃，夜间14-15℃；15天后，当接穗马铃薯长出2-3片叶时，表示嫁接成活，去掉嫁接夹，正常栽培管理，生长期间，及时去除砧木新生长的侧芽。
优选地，其中，远缘杂交包括：母本去雄：选择嫁接苗接穗的肥大花蕾，开花前的花蕾，拨开花瓣后，用眼科镊子去除雄蕊，注意不要碰断花柱；每去除一朵花雄蕊，镊子均需要在75％酒精中进行浸泡杀雄后，再进行下一朵花去雄处理，以防自花授粉；采集父本花粉：采集父本的花粉，先收集花药，放在硫酸纸上于阴凉出晾3-5小时，待花药隔打开，硫酸纸包裹花药进行摔打，花粉散出在硫酸纸上，收集于1.5ml的离心管中，编号，放4℃冰箱中备用；授粉，套袋，挂牌：毛笔尖沾匀提前收集的父本花粉，依次均匀涂抹在嫁接苗的接穗母本柱头上，待一个父本母本组合授粉完毕，75％酒精清洗毛笔，换另一支毛笔进行下一组合授粉，授粉完毕后，套袋挂标签，注明杂交日期。
优选地，其中，砧木培育过程中，马铃薯幼苗长至2-3片成熟叶时，作为砧木准备嫁接。
优选地，其中，接穗培育过程中，幼苗出土约2cm-5cm时，作为接穗准备嫁接。
优选地，其中，接穗培育过程中，幼苗出土约3cm-5cm时，作为接穗准备嫁接。
本发明有益效果：
(1)杂交果膨大，坐果率调查：
同时设计未嫁接的四倍体与二倍体进行杂交授粉，统一授粉朵数，统计未嫁接授粉与嫁接苗授粉坐果率。发现嫁接苗的授粉坐果率高于对照未嫁接授粉，不同杂交组合间座果率最高为60％，17个授粉组合中，嫁接促进座果率提高的有11组，占比65％。
(2)收获实生种子
开花授粉后5-7d子房开始膨大，经过30-40d浆果果皮由绿色逐渐变成黄白色或白色，由硬变软，并散发出香味，即达到成熟。收获后浆果在室内放置15-20天，进行洗籽。17个授粉组合中其中既促进座果率提高，又促进实生籽率提高的有8组，自然杂交不能结实而嫁接杂交获得种子的有3组。
(3)实生种子发芽
马铃薯种子有休眠期，当年采收的种子，多数没有通过休眠期，但经过一年以上贮存的种子，发芽率和发芽势显著提高，只需10天即可达到充分发芽。经过2‰的硝酸钾溶液浸泡24小时后，无菌水冲洗2-3遍放置MS营养基上进行发芽。试验证明，嫁接获得的远缘杂交种子经过充分后熟具备较高的发芽能力。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请的马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种远缘杂交获得实生种子的方法的流程图。
具体实施方式
下面结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本试验中涉及名词为嫁接当代，是指杂交父本为砧木，杂交母本为接穗，嫁接成功获得的嫁接连接体；
本申请提供了马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种远缘杂交获得实生种子的技术方法，如图1所示，该方法包括如下步骤：
S110:培育砧木
选用二倍体野生种为砧木。具体地，砧木为二倍体野生马铃薯种，在温室育苗。马铃薯种放于室温散射光下进行催芽处理，待嫩芽长1-2mm即可播种。穴播于基质为草炭土的营养钵中，覆土15cm。白天保持20℃-25℃，夜间10℃-15℃。
出苗后加强水肥管理。当马铃薯幼苗长至成熟叶时，作为砧木准备嫁接。砧木生长过小，茎紧贴地面，嫁接易污染，影响成活率；砧木生长过大，茎中空，不利于嫁接苗成活。
砧木培育过程中，马铃薯幼苗长至1-5片成熟叶时，作为砧木准备嫁接；优选为2-3片。砧木不宜生长过大否则茎中空，影响与接穗愈合。
S120：培育接穗
选用马铃薯四倍体栽培种作为接穗，具体地，选用马铃薯品种冀张薯8号、冀张薯12号的脱毒苗后代原原种(该级别种薯生长势强，且不带病毒)作为接穗，播种于苗盘中，基质为草炭土，覆土厚度为5cm-8cm。
当幼苗出土约1cm-10cm时，作为接穗准备嫁接；优选为2cm-5cm；更优选为3cm-5cm。接穗不宜生长过大，否则茎中空，影响与砧木的嫁接愈合。S130：嫁接
嫁接前先用75％的酒精擦拭刀片和手，进行消毒，每完成一组嫁接后，均要用酒精消毒刀片和手，待酒精完全挥发干后，方能进行下一步操作。嫁接包括如下步骤：
(1)准备砧木
去除砧木的顶芽，保留下面1-2片叶，采用劈接法，用双面刀片从砧木顶端切除砧木的生长点，然后纵切，刀口深度约1.0-1.5cm。
(2)准备接穗
用刀片将接穗幼苗从基部切下，摘去全部叶片，然后用刀片将接穗削成楔形，楔面大小与砧木切口大小一致，保持楔面干净整洁。
(3)嫁接
将接穗插入砧木切口，使二者切口对齐，然后用嫁接夹固定砧木与接穗。
(4)嫁接后管理
用50％多菌灵1g/L溶液对砧木和接穗及周围环境进行消毒，套上消毒的塑封袋，进行保湿保温处理，保持温室湿度在75％以上，温度白天保持在25-30℃，夜间15-18℃。
嫁接后2-3天，及时清除感染病苗，发病较轻的去除有病叶片，及时用50％多菌灵800倍液喷施防治。一周后，当接穗开始生长时，去除塑封袋，此时湿度维持在70％，白天保持25-28℃，夜间14-15℃。15d后，当接穗马铃薯长出2-3片叶时，表示嫁接成活，去掉嫁接夹，正常栽培管理，生长期间，及时去除砧木新生长的侧芽。
S140：远缘杂交
(1)母本去雄：
选择嫁接苗接穗(四倍体植株)的肥大花蕾，开花前的花蕾，拨开花瓣后，用眼科镊子去除雄蕊，注意不要碰断花柱；每去除一朵花雄蕊，镊子均需要在75％酒精中进行浸泡杀雄后，再进行下一朵花去雄处理，以防自花授粉。
(2)采集父本花粉：
将与砧木相同的二倍体野生种作为父本，采集父本(同砧木的二倍体野生种)的花粉，先收集花药，放在硫酸纸上于阴凉处晾3-5小时，待花药隔打开，硫酸纸包裹花药进行摔打，花粉散出在硫酸纸上，收集于1.5ml
的离心管中，编号，放到4℃冰箱中备用。
(3)授粉，套袋，挂牌：
毛笔尖沾匀提前收集的父本花粉，依次均匀涂抹在嫁接苗的接穗母本柱头上，待一个父本母本组合授粉完毕，用75％酒精清洗毛笔，换另一支毛笔进行下一组合授粉，授粉完毕后，套袋挂标签，注明杂交日期，父本母本品种名称，示例如下：砧木(二倍体)+接穗(四倍体)×二倍体。
与现有技术方法相比，本申请将马铃薯栽培种(为接穗)与二倍体野生种(为砧木)嫁接为一体，二者通过营养物质和遗传物质的相互交流，生理上无限接近，使得接穗四倍体栽培种作为母本开花后，对父本砧木二倍体野生种的花粉亲和性增强，杂交座果率显著增加，并获得远缘杂交种子。
实施例1
一、供试材料
四倍体马铃薯：冀张薯8号(下文简称G8)；
二倍体马铃薯：马铃薯栽培种BD38-7、BD54-8、BD39-1、BD40-7、BD7-5、BD60-8、BD44-6共7个材料。
二、试验方法
在杂交之前通过嫁接方法，使二者营养物质和遗传物质进行交流预先亲和。以二倍体野生马铃薯材料为砧木，以栽培种四倍体“冀张薯8号”为接穗进行嫁接，每个嫁接组合种植20株，对照种植10株，野生种植10株，以备采粉用。以未嫁接品种作为对照。马铃薯幼苗长至2-3片成熟叶时，作为砧木准备嫁接；当幼苗出土约3cm-5cm时，作为接穗准备嫁接；
嫁接砧木、接穗选择野生马铃薯偏上部分嫩枝、马铃薯栽培种幼苗，嫁接每株不超过2分钟。选用插接、砧木、接穗结合处直径相近，钢针在结合处横穿固定，后用塑料条包扎或夹子夹住。注意嫁接后的日常管理，如温度、湿度、光照等。在嫁接苗生长的不同阶段进行观察并记录。待野生马铃薯与马铃薯栽培种的嫁接苗开花期，选择还未开放的花朵，用镊子将母本花药夹掉，四倍体受二倍体的花粉。
同时设置未嫁接植株直接进行杂交的品种作对照，对比结实率、座果率并记录。
三、试验结果
1、嫁接当代对冀张薯8号与二倍体材料远缘杂交座果率的影响。
表1为嫁接当代对冀张薯8号与二倍体材料远缘杂交座果率的影响。如表1所示，7个当代嫁接组合中除却BD7-5的组合无花粉外，嫁接组合与对照组相比较，嫁接起到正向作用，有效提高座果率的有4组，比率为66.7％；嫁接起到反作用的有1组(BD54-8)，但与对照差异不显著；另外1组(BD38-7)未获得杂交果，说明二者间遗传距离较远，杂交不亲和。
起到正向作用的4组分别为BD39-1、BD40-7、BD60-8、BD44-6，较对照组分别增加4％、14％、7％、6％，且与对照组差异显著。特别是冀张薯8号与BD60-8,常规杂交不能获得杂交果，而嫁接杂交后可以获得杂交果。由此可见，通过先嫁接再杂交的方式，对于远缘杂交的座果率的提高起到促进作用。
表1嫁接当代对冀张薯8号与二倍体材料远缘杂交座果率的影响
2、嫁接当代对冀张薯8号与二倍体材料远缘杂交结实率的影响
表2为嫁接当代对冀张薯8号与二倍体材料远缘杂交结实率的影响。如表2所示，除去BD7-5无粉没有获得杂交种子、BD38-7无杂交果，没有杂交种子外，嫁接当代与对照组相比较，有1组为BD54-8起反向作用，结籽率降低38％，且差异显著；有3组起到正向作用，占比60％，分别是BD39-1、BD40-7、BD44-6，较对照组分别增加9％、6％、9％，且与对照差异显著；BD60-8嫁接获得果实，但没有获得杂交种子。这与杂交座果率表现规律基本一致。对于BD39-1、BD44-6组，嫁接后获得珍贵的远缘杂交种子一粒，而常规杂交不能得到，实现了零的突破。由此可见，嫁接对于远缘杂交亲和性较差的组合，能够显著提高结实率。
表2嫁接当代对冀张薯8号与二倍体材料远缘杂交结实率的影响
实施例2
一、试验材料
供试四倍体马铃薯为冀张薯12号，供试二倍体马铃薯分别为BD23-2、BD44-6、BD29-6、BD39-1、BD66-6、BD40-7、BD54-8、BD1-5、BD7-2、BD6-8、BD38-2共11个材料。
二、试验方法
2017年5月-8月，在张北试验基地西温室大棚和河北北方学院西校区进行了整个试验。结合2016年马铃薯中心的试验结果，将与冀张薯12号亲和性高的二倍体资源材料与其进行嫁接(二倍体材料+冀张薯12号)。马铃薯幼苗长至2-3片成熟叶时，作为砧木准备嫁接；当幼苗出土约3cm-5cm时，作为接穗准备嫁接；以嫁接体冀张薯12号为母本，对应砧木二倍体材料为父本，进行杂交。设置为未嫁接的冀张薯12号和二倍体资源材料为对照，分别将嫁接组和对照组进行杂交授粉，统计各处理马铃薯的座果率和结实率。
三、试验结果
1、嫁接当代对冀张薯12号与二倍体材料远缘杂交座果率的影响
表3为嫁接当代对冀张薯12号与二倍体材料远缘杂交座果率的影响。如表3所示，11个授粉组合中，嫁接当代与对照比较，提高座果率的有8组，占比72％；起到反向作用的有2组，占18％；1组嫁接未起到作用。G12与BD54-8组合嫁接效果最为显著，座果率提高了39％，G12与BD23-2组合座果率降低，比对照降低了3％。按其嫁接当代与对照的座果率比较从大到小依次为BD54-8、BD40-7、BD66-6、BD39-1、BD6-8、BD1-5、BD7-2、BD38-2、BD44-6、BD29-6、BD23-2。嫁接当代与对照比较，座果率提高的嫁接材料为BD54-8、BD40-7、BD66-6、BD39-1、BD6-8、BD1-5、BD7-2、BD38-2，嫁接当代与对照比较，座果率分别增加39％、30％、29％、14％、12％、6％、2％、1％由此可见，通过先嫁接再杂交，接穗的遗传物质和营养物质进入砧木的无性块茎中，两者相互交流，生理无限接近，使得远缘杂交座果率的提高起正向作用。
表3嫁接当代对冀张薯12号与二倍体材料远缘杂交座果率的影响
2、嫁接当代对冀张薯12号与二倍体材料远缘杂交结实率的影响
表4为嫁接当代对冀张薯12号与二倍体材料远缘杂交结实率的影响。如表4所示，11个授粉组合中，嫁接当代与对照比较，促进结实率提高的有6组，占比55％；自然杂交不能结实而嫁接获得杂交种子的有2组；嫁接起反向作用的有1组。G12与BD54-8、BD7-2、BD66-6、BD6-8、BD1-5、BD40-7六个组合均表现为嫁接促进作用；G12与BD23-2、BD29-6两个组合均表现为嫁接反向作用；G12与BD44-6、BD38-2两个对照组合没有结实率。G12与BD39-1组合嫁接当代与对照比较结实率降低。共收获四倍体与二倍体杂交种子701粒，但除去特殊因子G12与BD54-8的实生籽数605粒，共获得96粒，当代嫁接获得47粒，对照获得39粒。由此可见，嫁接当代对冀张薯12号与二倍体材料远缘杂交起到正向作用。
表4嫁接当代对冀张薯12号与二倍体材料远缘杂交结实率的影响
尽管已描述了本申请的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本申请范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本申请进行各种改动和变型而不脱离本申请的精神和范围。这样，倘若本申请的这些修改和变型属于本申请权利要求及其等同技术的范围之内，则本申请也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (9)
1.一种解决马铃薯四倍体栽培种与二倍体野生种远缘杂交的方法，其特征在于，包括：
培育砧木；
培育接穗；
嫁接；
远缘杂交，获得实生种子；
其中，所述砧木为二倍体野生马铃薯种；接穗为马铃薯四倍体栽培种。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述砧木的培育为：
二倍体野生马铃薯种放于室温散射光下进行催芽处理，待嫩芽长1-2mm时，穴播于基质为草炭土的营养钵中，覆土15cm；白天保持20℃-25℃，夜间10℃-15℃；
所述砧木培育过程中，马铃薯幼苗长至1-5片成熟叶时，作为砧木准备嫁接。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述接穗的培育为：
将马铃薯四倍体栽培种播种于苗盘中，基质为草炭土，覆土厚度为5cm-8cm；
所述四倍体栽培种为选用马铃薯品种冀张薯8号、冀张薯12号的脱毒苗后代原原种；
所述接穗培育过程中，幼苗出土约1cm-10cm时，作为接穗准备嫁接。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述嫁接为：
嫁接前先用75％的酒精擦拭刀片和手，进行消毒；
准备砧木：去除砧木的顶芽，保留下面1-2片叶，采用劈接法，用双面刀片从砧木顶端切除砧木的生长点，然后纵切，刀口深度约1.0-1.5cm；
准备接穗：用刀片将接穗幼苗从基部切下，摘去全部叶片，然后用刀片将接穗削成楔形，楔面大小与砧木切口大小一致，保持楔面干净整洁；
嫁接：将接穗插入砧木切口，使二者切口对齐，然后用嫁接夹固定砧木与接穗。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包括：
嫁接后，用50％多菌灵1g/L溶液对砧木和接穗及周围环境进行消毒，套上消毒的塑封袋，进行保湿保温处理，保持温室湿度在75％以上，温度白天保持在25-30℃，夜间15-18℃；
嫁接后2-3天，及时清除感染病苗，发病较轻的去除有病叶片，及时用50％多菌灵800倍液喷施防治；
一周后，当接穗开始生长时，去除塑封袋，此时湿度维持在70％，白天保持25-28℃，夜间14-15℃；
15天后，当接穗马铃薯长出2-3片叶时，表示嫁接成活，去掉嫁接夹，正常栽培管理，生长期间，及时去除砧木新生长的侧芽。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，远缘杂交包括：
母本去雄：选择嫁接苗接穗的肥大花蕾，开花前的花蕾，拨开花瓣后，用眼科镊子去除雄蕊，注意不要碰断花柱；每去除一朵花雄蕊，镊子均需要在75％酒精中进行浸泡杀雄后，再进行下一朵花去雄处理，以防自花授粉；
采集父本花粉：采集父本的花粉，先收集花药，放在硫酸纸上于阴凉出晾3-5小时，待花药隔打开，硫酸纸包裹花药进行摔打，花粉散出在硫酸纸上，收集于1.5ml的离心管中，编号，放4℃冰箱中备用；
授粉，套袋，挂牌：毛笔尖沾匀提前收集的父本花粉，依次均匀涂抹在嫁接苗的接穗母本柱头上，待一个父本母本组合授粉完毕，75％酒精清洗毛笔，换另一支毛笔进行下一组合授粉，授粉完毕后，套袋挂标签，注明杂交日期。
7.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述砧木培育过程中，马铃薯幼苗长至2-3片成熟叶时，作为砧木准备嫁接。
8.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述接穗培育过程中，幼苗出土约2cm-5cm时，作为接穗准备嫁接。
9.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述接穗培育过程中，幼苗出土约3cm-5cm时，作为接穗准备嫁接。
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| 陈丛斌: "马铃薯与二倍体野生种杂交后代的雄性可育性和耐寒性", 《国外农学-杂粮作物》 * |
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