CN111559981A - 一种联苯-嘧啶偶联物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种联苯-嘧啶偶联物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种联苯‑嘧啶偶联物及其制备方法和应用，联苯‑嘧啶偶联物的结构通式如式(Ⅰ)所示：
Figure DDA0002452013210000011
R1选自H、卤素、C1‑C3氟代烷基、吗啡啉基、哌嗪基、吡咯烷基或二甲氨基；R2选自卤素、二甲氨基、二乙氨基、吗啡啉基、哌嗪基、吡咯烷基、哌啶基、N‑(3‑二甲基氨基)丙基、N‑(3‑二乙基氨基)丙基、N‑(1‑(3‑氨基丙基)吡咯烷基)、N‑(1‑(3‑氨基丙基)哌啶基)或N‑(1‑(3‑氨基丙基)吗啡啉基)。通过均相时间分辨荧光实验，发现本发明提供的化合物可以抑制PD‑1/PD‑L1的相互作用，恢复T细胞的活性从而具有抗肿瘤的作用。本发明对发现新的抗肿瘤小分子药物，尤其促进联苯‑嘧啶偶联物靶向PD‑1/PD‑L1的临床药物研发提供了重大的参考价值。

Description

一种联苯-嘧啶偶联物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种联苯-嘧啶偶联物及其制备方法和应用，具体为在抗肿瘤药物制备中的应用。
背景技术
癌症一直以来都是人们关注的热点话题，其高发病率和高死亡率给社会带来了巨大的经济损失，并给家庭带来了不可磨灭的痛苦。
传统的抗肿瘤治疗(手术、放疗、化学疗法等)在抑制肿瘤进展方面作用有限。即使通过手术摘除了病灶，也有40％以上的患者出现局部复发或远处转移。如今，实体瘤的治疗仍以手术治疗为主，但手术治疗容易导致肿瘤微转移，增加了肿瘤转移的风险，可能降低患者的生存率。化学疗法可以杀死通过各种途径转移的癌细胞，无论它在哪里隐藏，都可以用化学治疗药物杀死，从而阻止其转移。但是，问题在于化学疗法药物容易产生耐药性，患者在使用一段时间后需要改用新药，并且大多小分子药物毒性很大，靶向性差，因此开发新的药物小分子尤为重要。
程序性死亡受体1(PD-1，也称为CD279)，针对该信号通路设计的药物在临床实验中表现出明显的抗肿瘤作用，但是PD-1/PD-L1的小分子抑制剂目前还没有成功上市的药物，使用氧醚键连接联苯和芳杂环的结构是当下公认的最好的母核结构，众多靶向PD-1/PD-L1的有活性的小分子都具有这个结构。在药物小分子的设计与合成中，我们经常发现嘧啶小分子的存在，它是一类非常重要的六元杂环化合物。一开始嘧啶类小分子是用在农业上作为杀虫剂、除草剂、杀菌剂已经有多年的历史，其特点是高效、低毒和广谱，因此现在对它的生物活性的研究依然是一个热门方向。使用最广泛的嘧啶类药物是5-氟尿嘧啶，用于实体瘤和消化道癌症的治疗，于1957年由Heidelberger 合成，这是真正意义上的小分子，化学结构简单、分子量小，但是其毒性太大、细胞选择性小，不适合人体长时间服用。这些年来嘧啶类小分子药物的研究受到越来越多的公司和实验的关注，大量的有生物活性的小分子被报道，并且上市的嘧啶类药物也不在少数，因此联苯-嘧啶偶联物是否具有抗肿瘤作用也非常值得研究。
发明内容
本发明提供了一种联苯-嘧啶偶联物及其制备方法和应用，本发明对肿瘤细胞进行体外毒理实验的筛选，并选取活性较好的化合物(即联苯-嘧啶偶联物)进行细胞划痕实验，此类化合物能很好的抑制肿瘤细胞的生长。并且通过均相时间分辨荧光实验发现该类化合物可以抑制PD-1/PD-L1 的相互作用，恢复T细胞的活性从而具有抗肿瘤的作用。这项发明对发现新的抗肿瘤小分子药物，尤其促进联苯-嘧啶偶联物靶向PD-1/PD-L1的临床药物研发提供了重大的参考价值。
所述的一种联苯-嘧啶偶联物，其特征在于其结构通式如式(Ⅰ)所示：
Figure BDA0002452013190000021
其中，R1选自H、卤素、C1-C3氟代烷基、吗啡啉基、哌嗪基、吡咯烷基或二甲氨基；R2选自卤素、二甲氨基、二乙氨基、吗啡啉基、哌嗪基、吡咯烷基、哌啶基、N-(3-二甲基氨基)丙基、 N-(3-二乙基氨基)丙基、N-(1-(3-氨基丙基)吡咯烷基)、N-(1-(3-氨基丙基)哌啶基)或N-(1-(3-氨基丙基)吗啡啉基)。
所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于包括以下三种合成路线中的其中一种：
路线一：
Figure BDA0002452013190000022
路线二：
Figure BDA0002452013190000031
路线三：
Figure BDA0002452013190000032
所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线一的过程b中，式(2)所示化合物与2-氨基-4,6-二氯嘧啶发生亲核反应生成式(3)所示化合物，反应的温度为80-100℃，优选为90℃，反应时间5-7小时，优选为6小时，反应过程中选用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂。
所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线一的过程c中，式(3)所示化合物与二甲胺、二乙胺、吡咯烷、哌啶、吗啡啉或哌嗪发生反应生成式4a-f所示化合物；制备化合物 4a时的温度为80-100℃，优选为90℃，反应时间5-7小时，优选为6小时，反应过程中选用N,N- 二甲基甲酰胺作溶剂；制备化合物4b时的温度为回流温度，反应时间11-13小时，优选为12小时，反应过程中选用乙腈作溶剂；制备化合物4c-f时的温度为30-50℃，优选温度为40℃，反应时间 2-4小时，优选为3小时，反应过程中选用乙腈作溶剂。
所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线一的过程d中，式4a-f所示化合物与吡咯烷或吗啡啉反应生成目标产物，反应的温度为140-160℃，优选为153℃，反应时间5-7小时，优选为6小时，反应过程中选用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂。
所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线二的过程c中，反应的温度为 80-100℃，优选为90℃，反应时间11-13小时，优选为12小时，反应过程中选用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂。
所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线三的过程a中，式4a或式4f化合物上枝接Boc基团反应的温度为室温，反应时间2-4小时，优选为3小时，反应过程中选用二氯甲烷作溶剂。
所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线三的过程b中，式13或式14化合物与3-二甲氨基丙胺发生偶联反应，偶联反应的温度100-120℃，优选温度为100°，反应时间11-13 小时，优选为12小时，反应过程中选用甲苯作溶剂。
所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线三的过程c中，偶联反应后的产物与三氟乙酸发生脱Boc反应生成目标产物，脱Boc反应的温度为室温，反应时间11-13小时，优选为12小时，反应过程中选用三氟乙酸做溶剂。
所述的联苯-嘧啶偶联物在抗肿瘤药物中的应用，具体为所述目标化合物与HePG2(肝癌细胞)、Hcc827(非小细胞肺癌细胞)、A549(肺癌细胞)、H1299(肺癌细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、A375(恶性黑色素瘤细胞)、AGS(人胃胰腺癌细胞)、HT-29(人结肠癌细胞)、SK-OV-3(人卵巢癌细胞)的作用，检测化合物对九种人类癌细胞生长抑制能力和细胞迁移能力。
通过采用上述技术，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1.本发明综合反应中针对不同的反应底物选择不同的溶剂、碱、温度、反应时间，在能保证合理反应时间的同时，提高反应产率；
2.本发明以2-甲基-3-苯基苯甲醇为初始原料，经过亲核取代、卤代、Boc基团保护、 Buchwald-Hartwing偶联反应以及Boc基团脱保护反应，得到式(Ⅰ)所示的目标产物联苯-嘧啶偶联物。其制备方法简单、对设备要求低，且所制得的化合物收率和纯度高，其纯度可高达95％以上，其结构通过核磁和质谱均得以验证；
3.本发明实施例提供的化合物从细胞水平对HePG2(肝癌细胞)、Hcc827(非小细胞肺癌细胞)、A549(肺癌细胞)、H1299(肺癌细胞)、MDA-MB-231(人乳腺癌细胞)、A375(恶性黑色素瘤细胞)、AGS(人胃胰腺癌细胞)、HT-29(人结肠癌细胞)、SK-OV-3(人卵巢癌细胞) 以及正常的人胚肺成纤维细胞(MRC-5)进行了毒理活性的研究，结果表明：大部分化合物对四种癌细胞的生长产生了较好的抑制活性，其中化合物15a-d和16b对九种癌细胞产生了明显的毒理活性；
4.本发明通过应用制得的化合物15a-d和16b从细胞水平对HePG2(肝癌细胞)、A549(肺癌细胞)、HT-29(人结肠癌细胞)、SK-OV-3(人卵巢癌细胞)进行了细胞迁移浸润作用的抑制能力的研究，细胞划痕实验结果表明：大部分化合物对三种癌细胞的迁移产生了较好的抑制活性， 0.6μM的16b对A549细胞的迁移率为42.37％，0.6μM的15a对HepG2细胞的迁移率为77.03％， 0.6μM的15c对HT-29细胞的迁移率为78.68％，0.6μM的15d对SK-OV-3细胞的迁移率为 39.65％。此外，15d对SK-OV-3细胞的抑制作用最大，这些结果表明15a，15c，15d和16b可以有效的抑制四种肿瘤细胞的伤口愈合。
5.本发明通过应用制得的化合物(3，4e-f，5a-b，11a-c，12a，12f，15a-d，16a-b)检测其对PD-1/PD-L1相互作用的影响，均相时间分辨荧光实验结果显示所有化合物中抑制作用最强的化合物是16b，IC50值为5.153μM。
附图说明
图1为不同浓度的化合物15a-d和16b对A549细胞迁移率的影响结果对比图；
图2为不同浓度的化合物15a-d和16b对HepG2细胞迁移率的影响结果对比图；
图3为不同浓度的化合物15a-d和16b对HT-29细胞迁移率的影响结果对比图；
图4为不同浓度的化合物15a-d和16b对SK-OV-3细胞迁移率的影响结果对比图；
图5为HTRF方法测定不同浓度、种类的抑制剂小分子对PD-1/PD-L1相互作用的影响能力图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本发明实施例主要有三条合成路线，路线一中说明了化合物3、4a-f和5a-c的合成方法，化合物1与二氯亚砜发生氯化反应获得化合物2(甲苯作溶剂，室温反应1小时)，然后与2-氨基-4,6- 二氯嘧啶在碳酸钾存在的碱性条件下进行亲核取代(N,N-二甲基甲酰胺作溶剂，90℃反应6小时)，得到化合物3。化合物3与边链胺(二甲胺、二乙胺、吡咯烷、哌啶、吗啡啉或哌嗪)在碳酸钾存在的碱性条件下进行亲核取代(N,N-二甲基甲酰胺作溶剂，40-90℃反应3-12小时)，得到化合物 4a-f。化合物4a-f与边链胺(吡咯烷或吗啡啉)在碳酸钾或碳酸铯存在的碱性条件下进行亲核取代 (N,N-二甲基甲酰胺作溶剂，90-153℃反应6-24小时)，最后获得目标化合物，具体实验过程参见本发明的实施例。
Figure BDA0002452013190000061
如路线二所示，化合物1与N-溴代丁二酰亚胺在三苯基膦存在条件下发生溴化反应得到化合物6，将不同的基团连接到嘧啶环上以获得中间体9a-c、10a-f(N,N-二异丙基丙胺或碳酸钾存在的碱性条件下反应，乙腈或N,N-二甲基甲酰胺作溶剂，84-90℃反应4-12小时)，最后用这些中间体9a-c、 10a-f与化合物6在碳酸钾存在的碱性条件下通过取代反应得到目标化合物11a-c和12a-f(N,N-二甲基甲酰胺作溶剂，90℃反应4-12小时)，具体实验过程参见本发明的实施例。
Figure BDA0002452013190000062
在路线三中，首先用Boc基团保护化合物4a和4c-1分别得到中间体化合物13和14，即化合物4a 或4c-1与Boc酸酐、N-溴代丁二酰亚胺在二氯甲烷溶剂中室温反应3小时，分别得到中间体13,14。然后中间体13,14与不同的边链胺发生Buchwald-Hartwig反应，最后除去Boc保护基，得到目标化合物15a-e和16a-b，具体合成路线如下所示，具体实验过程参见本发明的实施例内容。
Figure BDA0002452013190000071
中间体化合物2的制备：将2-甲基-3-苯基苯甲醇(1.00g,5.04mmol)，氯化亚砜(1.18g,10.08 mmol)，甲苯10mL，DMF 5滴依次加入50mL的单口瓶，室温条件下搅拌反应1小时，用旋转蒸发仪浓缩反应液，最后用柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝30:1,v/v)得到白色固体粉末1.07g，收率为98％。化合物2为2-甲基-3-苯基苄氯，白色固体：产率98％，熔点：56-58℃，1H NMR(500 MHz,Chloroform-d)δ7.46-7.42(m,2H),7.40-7.33(m,2H),7.33-7.29(m,2H),7.26-7.23(m,2H),4.71 (s,2H),2.33(s,3H).
实施例1：
化合物3的制备：依次将2-甲基-3-苯基苄氯(300mg,1.38mmol)，2-氨基-4,6-二氯嘧啶(227 mg,1.38mmol)，碳酸钾(383mg,2.77mmol)和5mLDMF加入10mL的单口烧瓶中，在80℃条件下搅拌反应6小时。反应结束后冷却至室温，反应液加入100mL水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，以除去DMF和碳酸钾，浓缩有机相、拌硅胶并用柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝100:1v/v)得到化合物3，白色固体粉末119mg，收率为25％，
化合物3为2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4，6-二氯嘧啶，熔点177-179℃，纯度:96.34％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.47-7.41(m,2H),7.40-7.35(m,1H),7.35-7.29(m, 3H),7.27-7.20(m,2H),6.66(s,1H),5.67(t,J＝5.7Hz,1H),4.69(d,J＝5.6Hz,2H),2.25(s,3H).13C NMR(126MHz,CDCl3)δ161.41,143.16,141.93,136.02,133.86,129.68,129.32,128.11,127.55, 126.89,125.73,109.38,44.45,16.38.HRMScalcd for C18H15Cl2N3:343.06,found:342.00(M-H+), 344.00(M+H+).
实施例2：
化合物4a：2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(二甲胺基)-6-氯嘧啶
化合物4a的制备：依次将化合物3(0.20g,0.59mmol)、二甲胺(0.05g,1.16mmol)，碳酸钾(0.16g,1.16mmol)和4mLDMF加入10mL单口烧瓶中，90℃条件下搅拌反应6小时后，反应液通过旋转蒸发仪减压浓缩，使用DCM重结晶得到白色固体0.16g，收率79％，熔点: 214-215℃，纯度:97.21％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.45(t,J＝7.5Hz,2H),7.40–7.34(m,1H),7.29(d,J＝7.5Hz,3H),7.19(t,J＝7.6Hz,1H),7.11–7.02(m,1H),5.92(s, 1H),4.47(s,2H),2.98(s,6H),2.18(s,3H).MS(ESI)calcd for C20H21ClN4:352.2,found:353.2 (M+H+).
实施例3
化合物4b：2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(二乙氨基)-6-氯嘧啶
化合物4b的制备：依次将化合物3(100mg,0.29mmol)，二乙胺(42mg,0.58mmol)，N,N- 二异丙基丙胺(DIPEA)(75mg,0.58mmol)和2mL乙腈加入到10mL的单口烧瓶中，在回流温度下搅拌反应12小时。反应结束后，用旋转蒸发仪浓缩反应液，最后用柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝50:1v/v)得到白色固体粉末67mg，收率61％，熔点：157-158℃，纯度:96.04％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.43(dd,J＝8.1,6.7Hz,2H),7.39-7.33(m,2H), 7.33-7.29(m,2H),7.22(t,J＝7.5Hz,1H),7.17(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),5.82(s,1H),5.26(m,1H),4.64 (d,J＝5.7Hz,2H),3.44(s,4H),2.25(s,3H),1.15(t,J＝7.1Hz,6H).MS(ESI)calcd for C22H25ClN4: 380.2,found:381.2(M+H+).
实施例4化合物4c的制备
(1)化合物4c的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000081
(2)化学反应步骤：依次将化合物3(0.5g,1.45mmol)，吡咯烷(0.2g,2.90mmol)，碳酸钾(0.4g,2.9mmol)和20mLDMF加入50mL单口烧瓶，在40℃条件下反应3小时。反应结束后冷却至室温，反应液加入200mL水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，以除去DMF和碳酸钾，浓缩有机相、拌硅胶用柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝20:1v/v)得到白色固体粉末0.23g，收率42％，熔点：230-232℃，纯度:98.80％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500 MHz,Chloroform-d)δ7.46-7.39(m,2H),7.39-7.32(m,2H),7.33-7.27(m,2H),7.24-7.15(m,2H),5.74 (s,1H),5.15(s,1H),4.65(d,J＝5.7Hz,2H),3.58(s,2H),3.30(s,2H),2.25(s,3H),2.01(s,2H),1.95(s, 2H).MS(ESI)calcd for C22H23ClN4:378.2,found:379.2(M+H+).
实施例5化合物4d的制备
(1)化合物4d的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000091
(2)化学反应步骤：化合物4d的合成方法与实施例4中化合物4c的合成步骤相同，不同之处仅在于“将吡咯烷替换为同等摩尔量的哌啶”，最终产物白色固体收率64％，熔点：171-172℃，纯度:97.06％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.42(dd,J＝8.1,6.6Hz,2H), 7.38-7.33(m,2H),7.32-7.29(m,2H),7.24-7.16(m,2H),5.93(s,1H),5.09(s,1H),4.63(d,J＝5.6Hz, 2H),3.56(s,4H),2.25(s,3H),1.68(q,J＝5.7Hz,2H),1.58(d,J＝11.5Hz,4H).MS(ESI)calcd for C23H25ClN4:392.2,found:393.2(M+H+).
实施例6化合物4e的制备
(1)化合物4e的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000092
(2)化学反应步骤：化合物4e的合成方法与实施例4中化合物4c的合成步骤相同，不同之处仅在于“将吡咯烷替换为同等摩尔量的吗啡啉”，最终产物白色固体收率78％，熔点：178-180℃，纯度:98.55％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.42(dt,J＝6.8,1.3Hz,2H), 7.39-7.35(m,1H),7.31(ddt,J＝8.0,5.9,1.5Hz,3H),7.23(t,J＝7.5Hz,1H),7.19(dd,J＝7.7,1.7Hz, 1H),5.91(s,1H),5.23(s,1H),4.63(d,J＝5.6Hz,2H),3.75(dd,J＝5.7,4.1Hz,4H),3.58(t,J＝4.8Hz, 4H),2.24(s,3H).MS(ESI)calcd forC22H23ClN4O:394.2,found:395.2(M+H+).
实施例7化合物4f的制备
(1)化合物4f的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000101
(2)化学反应步骤：依次将化合物3(500mg,1.45mmol)，1-Boc-哌嗪(541mg,2.90mmol) 和10mL乙腈加入到25mL的单口烧瓶中，在回流温度下搅拌反应4小时。反应结束后用旋转蒸发仪浓缩反应液，最后用柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝50:1v/v)得到白色固体粉末519mg，收率72％。然后将所得白色固体200mg溶于1mL的三氟乙酸中，室温下搅拌四小时，然后用氮气吹掉过多的三氟乙酸，用饱和的碳酸氢钠水溶液把反应液调制弱碱性(pH约8-9)，然后用二氯甲烷萃取两遍并用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪浓缩有机相，最后用柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝20:1v/v)得到白色固体粉末123mg，收率77％，熔点：71-72℃，纯度:97.11％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.45-7.40(m,2H),7.38-7.32(m,2H),7.32-7.28(m,2H), 7.22(t,J＝7.5Hz,1H),7.18(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),5.92(s,1H),5.33(d,J＝30.7Hz,1H),4.63(d,J＝ 5.6Hz,2H),3.72–3.51(m,4H),2.95–2.84(m,4H),2.24(s,3H),1.98(s,1H).MS(ESI)calcd for C22H24ClN5:393.2,found:394.2(M+H+).
实施例8化合物5a的制备
(1)化合物5a的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000102
(2)化学反应步骤：依次将化合物4a(0.5g,1.42mmol)，吡咯烷(0.20mg,2.83mmol)，碳酸铯(0.92g,2.83mmol)和10mLDMF加入到25mL的单口烧瓶中，110℃条件下搅拌反应 16小时，反应结束后冷却至室温，反应液加入200mL水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，以除去DMF和碳酸铯，浓缩有机相、拌硅胶用柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝20:1v/v)得到黄色固体0.27g，收率49％，熔点：178-180℃，纯度:99.01％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.44-7.39(m,3H),7.37-7.29(m,3H),7.20(t,J＝7.5Hz,1H), 7.15(dd,J＝7.6,1.5Hz,1H),4.79(s,1H),4.67(d,J＝5.7Hz,2H),3.45(s,4H),3.04(s,6H),2.28(s, 3H),2.02–1.90(m,4H).MS(ESI)calcd for C24H29N5:387.3,found:388.3(M+H+).
实施例9化合物5b的制备
(1)化合物5b的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000111
(2)化学反应步骤：化合物5b的合成方法与实施例8中化合物5a的合成步骤相同，不同之处仅在于“将吡咯烷替换为同等摩尔量的吗啡啉”，最终产物为白色固体收率59％，熔点：71-73℃，纯度:96.07％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.45-7.40(m,2H),7.40-7.33 (m,2H),7.33-7.29(m,2H),7.21(t,J＝7.5Hz,1H),7.16(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),5.03(s,1H),4.82(s, 1H),4.65(d,J＝5.7Hz,2H),3.84–3.73(m,4H),3.51(t,J＝4.9Hz,4H),3.04(s,6H),2.27(s,3H).MS (ESI)calcd for C24H29N5O:403.3,found:404.3(M+H+).
实施例10化合物5c的制备
(1)化合物5c的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000112
(2)化学反应步骤：依次将化合物4c(0.3g,0.76mmol)，哌啶(0.10mg,1.53mmol)，碳酸铯(0.50g,1.53mmol)和10mLDMF加入到25mL的单口烧瓶中，153℃条件下搅拌反应6小时。反应结束后冷却至室温，反应液加入200mL水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，以除去DMF和碳酸铯，浓缩有机相、拌硅胶用柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝10:1 v/v)得到白色固体0.18g，收率55％，熔点：108-110℃，纯度:96.64％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.45-7.39(m,3H),7.37-7.33(m,1H),7.33-7.30(m,2H),7.20(t,J＝ 7.6Hz,1H),7.15(dd,J＝7.6,1.5Hz,1H),4.92(s,1H),4.66(d,J＝5.6Hz,2H),3.52(t,J＝5.3Hz,4H), 3.44(s,4H),2.28(s,3H),1.99–1.89(m,4H),1.68–1.62(m,2H),1.59(dd,J＝7.2,4.0Hz,4H).MS (ESI)calcd for C27H33N5:427.3,found:428.3(M+H+).
实施例11化合物5d的制备
(1)化合物5d的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000121
(2)化学反应步骤：化合物5d的合成方法与实施例10中化合物5c的合成步骤相同，不同之处仅在于“将哌啶替换为同等摩尔量的吗啡啉”，最终产物为白色固体收率70％，熔点：163-164℃，纯度:98.65％(HPLC)。表征数据：1H NMR(400MHz,Chloroform-d)δ7.43-7.32(m,4H),7.31-7.26 (m,2H),7.18(t,J＝7.5Hz,1H),7.13(dd,J＝7.7,1.6Hz,1H),4.89(s,1H),4.82(t,J＝5.8Hz,1H),4.63 (d,J＝5.6Hz,2H),3.75(t,J＝4.8Hz,4H),3.47(t,J＝4.8Hz,4H),3.41(s,4H),2.25(s,3H),1.92(q,J ＝3.6Hz,4H).MS(ESI)calcd forC26H31N5O:429.3,found:430.3(M+H+).
中间体6的制备：把20mL的二氯甲烷加入到50mL的三口烧瓶中，冰盐浴降温至0℃，依次加入2-甲基-3-苯基苯甲醇(1.00g,5.04mmol)，三苯基膦(1.98g,7.56mmol)和NBS(1.78g, 10.08mmol)，反应一小时后，旋转蒸发仪浓缩反应液，拌硅胶用柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝10:1v/v)得到白色固体1.19g，收率95％。化合物6为2-甲基-3苯基苄溴，白色固体：产率95％：熔点：70-71℃，1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.48-7.40(m,2H),7.41-7.32(m,2H),7.34-7.28 (m,2H),7.28-7.19(m,2H),4.622(s,2H),2.32(s,3H).
中间体9a的制备：依次将2-氨基-4-氯嘧啶(500mg,3.86mmol)，二甲胺(348mg,7.72mmol)，碳酸钾(1.07g,7.72mmol)和10mLDMF加入到25mL的单口烧瓶中，90℃条件下搅拌反应12 小时，反应结束后冷却至室温，反应液加入200mL水，用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，以除去DMF和碳酸钾，浓缩有机相、拌硅胶用柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝50:1 v/v)得到白色固体99mg，收率19％。化合物9a为2-氨基-4-(二甲氨基)嘧啶，白色固体99mg，收率19％，熔点：156-158℃。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ6.87(d,J＝6.6Hz,1H),5.26(d,J＝6.6 Hz,1H).
中间体9b的制备：依次将2-氨基-4-氯嘧啶(400mg,3.09mmol)，吗啡啉(538mg,6.18mmol)、 DIPEA(798mg,6.18mmol)和10mLMeCN加入到25mL的单口烧瓶中，回流温度下搅拌反应4 小时，反应结束后旋转蒸发仪浓缩反应液，拌硅胶用柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝30:1v/v)得到白色固体786mg，收率95％；
Figure BDA0002452013190000122
化合物9b为2-氨基-4-(1-吗啡啉基)嘧啶，白色固体786mg，收率95％，熔点：157-158℃。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.87(d,J＝6.4Hz,1H),5.96(d,J＝6.4Hz,1H),5.21(s,2H),3.83 –3.73(m,4H),3.66–3.57(m,4H).
中间体9c的制备：化合物9c的合成方法与化合物9b的合成方法相同，不同之处仅在于“将吗啡啉替换为同等摩尔量的1-Boc哌嗪”，产物为白色固体收率75％：
Figure BDA0002452013190000131
化合物9c为2-氨基-4-(4-羧酸叔丁基酯-1-哌嗪基)嘧啶，熔点：205-207℃。1HNMR(500MHz, Chloroform-d)δ7.89(d,J＝6.1Hz,1H),5.95(d,J＝6.2Hz,1H),4.80(s,2H),3.59(dd,J＝6.9,3.8Hz, 4H),3.50(d,J＝5.5Hz,4H),1.49(s,9H).
中间体10a的制备：化合物10a的合成方法与化合物9b的合成方法相同，不同之处仅在于“将 2-氨基-4-氯嘧啶替换为同等摩尔量的2-氨基-4-氯-6-三氟甲基嘧啶，并将吗啡啉替换为同等摩尔量的二甲胺”，产物为白色固体收率55％：
Figure BDA0002452013190000132
化合物10a为2-氨基-4-(二甲氨基)-6-(三氟甲基)嘧啶，熔点：157-159℃。1HNMR(500 MHz,Chloroform-d)δ6.21(s,1H),4.98(s,2H),3.11(s,6H).
中间体10b的制备：化合物10b的合成方法与化合物9b的合成方法相同，不同之处仅在于“将 2-氨基-4-氯嘧啶替换为同等摩尔量的2-氨基-4-氯-6-三氟甲基嘧啶，并将吗啡啉替换为同等摩尔量的二乙胺”，产物为白色固体收率89％：
Figure BDA0002452013190000133
化合物10b为2-氨基-4-(二乙氨基)-6-(三氟甲基)嘧啶，熔点：124-125℃。1H NMR(500 MHz,Chloroform-d)δ6.16(s,1H),4.93(s,2H),3.51(d,J＝5.5Hz,4H),1.19(t,J＝7.1Hz,6H).
中间体10c的制备：化合物10c的合成方法与化合物9b的合成方法相同，不同之处仅在于“将 2-氨基-4-氯嘧啶替换为同等摩尔量的2-氨基-4-氯-6-三氟甲基嘧啶，并将吗啡啉替换为同等摩尔量的吡咯烷”，产物为白色固体收率88％：
Figure BDA0002452013190000141
化合物10c为2-氨基-4-(1-吡咯烷基)-6-(三氟甲基)嘧啶，熔点：126-127℃。1HNMR(500 MHz,Chloroform-d)δ6.08(s,1H),5.22(s,2H),3.59(s,2H),3.39(s,2H),2.08–1.95(m,4H).
中间体10d的制备：化合物10d的合成方法与化合物9b的合成方法相同，不同之处仅在于“将 2-氨基-4-氯嘧啶替换为同等摩尔量的2-氨基-4-氯-6-三氟甲基嘧啶，并将吗啡啉替换为同等摩尔量的哌啶”，产物为白色固体收率89％：
Figure BDA0002452013190000142
化合物10d为2-氨基-4-(1-哌啶基)-6-(三氟甲基)嘧啶，熔点：171-173℃。1H NMR(500 MHz,Chloroform-d)δ6.28(s,1H),4.91(s,2H),3.62(s,4H),1.71(qd,J＝5.8,3.5Hz,2H),1.62–1.61 (m,2H).
中间体10e的制备：化合物10e的合成方法与化合物9b的合成方法相同，不同之处仅在于“将 2-氨基-4-氯嘧啶替换为同等摩尔量的2-氨基-4-氯-6-三氟甲基嘧啶”，产物为白色固体收率79％：
Figure BDA0002452013190000143
化合物10e为2-氨基-4-(1-吗啡啉基)-6-(三氟甲基)嘧啶，熔点：177-178℃。1HNMR(500 MHz,Methanol-d4)δ6.42(s,1H),3.74(dd,J＝5.8,3.9Hz,4H),3.68(q,J＝4.7,3.9Hz,4H).
中间体10f的制备：化合物10f的合成方法与化合物9b的合成方法相同，不同之处仅在于“将 2-氨基-4-氯嘧啶替换为同等摩尔量的2-氨基-4-氯-6-三氟甲基嘧啶，并将吗啡啉替换为同等摩尔量的1-Boc哌嗪”，产物为白色固体收率72％：
Figure BDA0002452013190000151
化合物10f为2-氨基-4-(4-羧酸叔丁基酯-1-哌嗪基)-6-(三氟甲基)嘧啶，熔点：207-209℃。1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ6.27(s,1H),5.02(s,2H),3.65(d,J＝6.3Hz,4H),3.52(t,J＝5.3 Hz,4H),1.50(s,9H).
实施例12化合物11a的制备
(1)化合物11a的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000152
(2)化学反应步骤：依次将2-甲基-3苯基苄溴(240mg,0.92mmol)，2-氨基-4-(二甲氨基) 嘧啶(即化合物9a)(127mg,0.92mmol)，碳酸钾(254mg,1.84mmol)和4mLDMF加入10mL的单口烧瓶中，90℃条件下搅拌反应5h，反应结束后冷却至室温，反应液加入200mL水，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤三次，以除去DMF和碳酸钾，浓缩有机相、拌硅胶用柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝50:1,v/v))得到白色固体40mg，收率13％，熔点：152-153℃，纯度:96.79％(HPLC)。表征数据:1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.15(s,1H),7.89(d,J＝7.7Hz, 1H),7.48(dd,J＝8.2,6.8Hz,2H),7.44-7.38(m,1H),7.33-7.28(m,3H),7.21(d,J＝7.6Hz,1H),6.65 (dd,J＝10.1,7.6Hz,2H),5.24(s,2H),3.24(s,3H),3.20(s,3H),2.17(s,3H).MS(ESI)calcd for C20H22N4:318.2,found:319.2(M+H+).
实施例13化合物11b的制备
(1)化合物11b的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000153
(3)化学反应步骤：化合物11b的合成方法与实施例12中化合物11a的合成方法相同，不同之处仅在于“将化合物9a替换为同等摩尔量的化合物9b”，最终产物为白色固体收率56％，熔点： 250-252℃，纯度:98.17％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.44-7.39(m, 2H),7.38-7.34(m,2H),7.27-7.25(m,3H),7.13(dd,J＝7.1,2.0Hz,1H),6.28(d,J＝7.8Hz,1H),5.58 (s,2H),3.99(t,J＝4.8Hz,2H),3.78(dd,J＝5.6,4.1Hz,4H),3.59(d,J＝5.0Hz,2H),2.18(s,3H),MS (ESI)calcd for C22H24N4O:360.2,found:361.2(M+H+).
实施例14化合物11c的制备
(1)化合物11c的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000161
(2)化学反应步骤：依次将2-甲基-3苯基苄溴(260mg,1.0mmol)，2-氨基-4-(4-羧酸叔丁基酯-1-哌嗪基)嘧啶(278mg,1.0mmol，即化合物9c)，DIPEA(257mg,2.00mmol)和4mL乙腈加入到10mL的单口烧瓶中，回流搅拌反应4小时后，反应液用旋转蒸发仪旋干。随后加入三氟乙酸0.9ml，苯甲醚0.05ml和甲基苯基硫醚0.05ml室温搅拌反应12小时，然后用氮气吹掉过多的三氟乙酸，用饱和的碳酸氢钠水溶液把反应液调制弱碱性(pH约8-9)，然后用二氯甲烷萃取两遍并用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪浓缩有机相，最后用柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝100:1 v/v)得到白色固体粉末202mg，收率56％，熔点：156-158℃，纯度:98.04％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.45-7.39(m,2H),7.38-7.34(m,1H),7.29(d,J＝2.0Hz,1H), 7.26(t,J＝1.5Hz,1H),7.19–7.11(m,3H),6.15(d,J＝7.8Hz,1H),5.40(s,2H),4.00(s,2H),3.58(s, 2H),3.01(d,J＝5.7Hz,4H),2.14(s,3H).MS(ESI)calcdfor C22H25N5:359.2,found:360.2(M+H+).
实施例15化合物12a的制备
(1)化合物12a的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000162
(2)化学反应步骤：依次将2-甲基-3苯基苄溴(200mg,0.77mmol)，2-氨基-4-(二甲氨基) -6-(三氟甲基)嘧啶(158mg,0.76mmol，即化合物10a)，碳酸钾(212mg,1.53mmol)和4mL DMF加入到10mL的单口烧瓶中，90℃条件下搅拌反应12小时，反应结束后冷却至室温，反应液加入200mL水，用二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤三次，以除去DMF和碳酸钾，浓缩有机相、拌硅胶用柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝50:1v/v))得到白色固体74mg，收率25％，熔点：143-145℃，纯度:97.77％(HPLC)。表征数据：1HNMR(500MHz,Chloroform-d) δ7.46–7.40(m,2H),7.39–7.33(m,2H),7.32–7.29(m,2H),7.22(t,J＝7.5Hz,1H),7.18(dd,J＝7.6, 1.6Hz,1H),6.16(s,1H),5.26(s,1H),4.68(d,J＝5.7Hz,2H),3.12(s,6H),2.26(s,3H).MS(ESI) calcd for C21H21F3N4:386.2,found:387.2(M+H+).
实施例16化合物12b的制备
(1)化合物12b的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000171
(2)化学反应步骤：化合物12b的合成方法与实施例15中化合物12a的合成方法相同，不同之处仅在于“将化合物10a替换为同等摩尔量的化合物10b”，最终产物为白色固体收率56％，熔点：94-96℃，纯度:96.94％(HPLC)。表征数据：1HNMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.45-7.40 (m,2H),7.38-7.34(m,2H),7.33-7.29(m,2H),7.22(t,J＝7.5Hz,1H),7.17(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H), 6.11(s,1H),5.28(s,1H),4.65(d,J＝5.7Hz,2H),3.49(s,4H),2.26(s,3H),1.17(s,6H).MS(ESI) calcd for C23H25F3N4:414.2,found:415.2(M+H+).
实施例17化合物12c的制备
(1)化合物12c的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000172
(2)化学反应步骤：化合物12c的合成方法与实施例15中化合物12a的合成方法相同，不同之处仅在于“将化合物10a替换为同等摩尔量的化合物10c”，最终产物为白色固体收率42％，熔点：118-120℃，纯度:98.83％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.45-7.40 (m,2H),7.39-7.33(m,2H),7.32-7.29(m,2H),7.24-7.16(m,2H),6.03(s,1H),5.28(s,1H),4.68(d,J＝ 5.7Hz,2H),3.62(s,2H),3.38(s,2H),2.26(s,3H),2.01(d,J＝32.2Hz,4H).MS(ESI)calcd for C23H23F3N4:412.2,found:413.2(M+H+).
实施例18化合物12d的制备
(1)化合物12d的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000181
(2)化学反应步骤：化合物12d的合成方法与实施例15中化合物12a的合成方法相同，不同之处仅在于“将化合物10a替换为同等摩尔量的化合物10d”，最终产物为白色固体收率40％，熔点：113-114℃，纯度:98.83％(HPLC)。表征数据：1HNMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.46-7.40 (m,2H),7.39-7.33(m,2H),7.33-7.29(m,2H),7.22(t,J＝7.5Hz,1H),7.18(dd,J＝7.7,1.6Hz,1H), 6.23(s,1H),5.24(s,1H),4.66(d,J＝5.7Hz,2H),3.63(s,4H),2.26(s,3H),1.70(q,J＝6.1Hz,2H), 1.65–1.59(m,4H).HRMS calcd for C24H25F3N4:425.2085,found:426.2085(M+H+).
实施例19化合物12e的制备
(1)化合物12e的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000182
(2)化学反应步骤：化合物12e的合成方法与实施例15中化合物12a的合成方法相同，不同之处仅在于“将化合物10a替换为同等摩尔量的化合物10e”，最终产物为白色固体收率48％，熔点：184-186℃，纯度:98.32％(HPLC)。表征数据：1HNMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.46-7.40 (m,2H),7.39-7.33(m,2H),7.32-7.28(m,2H),7.25-7.17(m,2H),6.21(s,1H),5.36(s,1H),4.66(d,J＝ 5.6Hz,2H),3.77(dd,J＝5.7,4.0Hz,4H),3.65(s,4H),2.25(s,3H),MS(ESI)calcd for C23H23F3N4O: 428.2,found:429.2(M+H+).
实施例20化合物12f的制备
化合物12f：2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(1-哌嗪基)-6-(三氟甲基)嘧啶
(1)化合物12f的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000191
(2)化学反应步骤：依次将2-甲基-3苯基苄溴(900mg,3.45mmol)，2-氨基-4-(4-羧酸叔丁基酯-1-哌嗪基)-6-(三氟甲基)嘧啶(855mg,2.46mmol),碳酸钾(680mg,4.92mmol)和20mL DMF加入到50mL的单口烧瓶，90℃条件下搅拌反应12小时后，反应液用旋转蒸发仪旋干。随后加入三氟乙酸0.9ml，苯甲醚0.05ml和甲基苯基硫醚0.05ml室温搅拌反应12小时，然后用氮气吹掉过多的三氟乙酸，用饱和的碳酸氢钠水溶液把反应液调制弱碱性(pH约8-9)，然后用二氯甲烷萃取两遍并用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪浓缩有机相，最后用柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝50:1v/v)得到白色固体粉末收率13％，熔点：70-72℃，纯度:98.90％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.43(tt,J＝8.1,1.5Hz,2H),7.36(tt,J＝7.8,1.5Hz,2H), 7.32-7.28(m,2H),7.22(t,J＝7.5Hz,1H),7.18(dd,J＝7.7,1.7Hz,1H),6.22(s,1H),4.65(d,J＝5.6Hz, 2H),3.73(d,J＝24.5Hz,4H),2.99(t,J＝5.1Hz,4H),2.25(s,3H)321.MS(ESI)calcd for C23H24F3N5: 427.2,found:428.2(M+H+).
中间体13的制备：依次将化合物4e(1g,2.53mmol)，Boc酸酐(1.11mg,5.06mmol)，NBS (0.451mg,2.53mmol)和10mLDCM加入到25mL的单口烧瓶中，室温搅拌反应3小时后，旋转蒸发仪浓缩反应液，拌硅胶用柱色谱分离(石油醚：乙酸乙酯＝10:1v/v)得到白色固体收率85％；
Figure BDA0002452013190000192
实施例21化合物15a的制备
化合物15a：2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(1-吗啡啉基)-6-N-(3-(二甲基氨基)丙基)嘧啶
(1)化合物15a的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000201
(2)化学反应步骤：在10mL的单口烧瓶中依次加入2mL甲苯，2-(N-羧基叔丁基酯-2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(1-吗啡啉基)-6-氯嘧啶(140mg,0.28mmol，即化合物13),3-二甲氨基丙胺(58mg,0.566mmol)和碳酸铯(184mg,0.566mmol)，用氮气置换瓶中的气体三次，在氮气的保护下加入Pd2(dba)3(52mg,0.056mmol)和X-phos(27mg,0.056mmol)，110℃条件下搅拌反应12小时，反应液用旋转蒸发仪旋干。随后加入三氟乙酸0.9ml，苯甲醚0.05ml和甲基苯基硫醚0.05ml室温搅拌反应12小时，然后用氮气吹掉过多的三氟乙酸，用饱和的碳酸氢钠水溶液把反应液调制弱碱性(pH约8-9)，然后用二氯甲烷萃取两遍并用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪浓缩有机相，最后用柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝100:1v/v)得到棕黄色油状液体38mg，收率 33％，纯度:96.61％(HPLC)。表征数据：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.44-7.39(m,2H),7.35(tt,J＝7.9,1.5Hz,2H),7.32-7.28(m, 2H),7.20(t,J＝7.5Hz,1H),7.16(dd,J＝7.7,1.6Hz,1H),5.00(s,1H),4.62(d,J＝5.7Hz,2H),3.75(t, J＝4.9Hz,4H),3.56(t,J＝4.8Hz,4H),3.33(t,J＝6.5Hz,2H),2.59(t,J＝6.6Hz,2H),2.40(s,6H), 2.25(s,3H),1.86(p,J＝6.6Hz,2H),13C NMR(126MHz,CDCl3)δ163.26,162.98,142.96,141.97, 136.30,133.46,129.33,128.06,127.23,126.84,125.51,117.74,115.42,66.39,55.90,45.77,44.92,44.87, 43.51,39.50,24.44,16.45.HRMS calcd for C27H36N6O:460.3023,found:461.3023(M+H+).
实施例22化合物15b的制备
化合物15b：2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(1-吗啡啉基)-6-N-(3-(二乙基氨基)丙基)嘧啶
(1)化合物15b的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000202
(2)化学反应步骤：化合物15b的合成方法与实施例21中化合物15a的合成方法相同，不同之处仅在于“将3-二甲氨基丙胺替换为同等摩尔量的3-二乙氨基丙胺”，产物为棕黄色油状液体收率36％，纯度:97.23％(HPLC)。表征数据：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.44-7.39(m,2H),7.38-7.32(m,2H),7.31-7.28(m,2H),7.20 (t,J＝7.5Hz,1H),7.16(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),5.10(s,1H),4.61(d,J＝5.7Hz,2H),3.77-3.72(m, 4H),3.53(t,J＝4.8Hz,4H),3.47(t,J＝6.4Hz,2H),2.91(m,6H),2.25(s,3H),2.06-1.95(m,2H),1.26 (t,J＝7.2Hz,6H),13C NMR(126MHz,CDCl3)δ162.91,162.63,142.86,141.95,133.41,129.28, 129.21,128.01,127.17,126.77,125.44,117.74,115.41,66.37,49.73,46.41,44.81,43.47,39.38,23.83, 16.37,8.52.HRMS calcd for C29H40N6O:488.3336,found:489.3340(M+H+)。
实施例23化合物15c的制备
化合物15c：2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(1-吗啡啉基)-6-N-(1-(3-氨基丙基)吡咯烷基) 嘧啶
(1)化合物15c的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000211
(2)化学反应步骤：化合物15c的合成方法与实施例21中化合物15a的合成方法相同，不同之处仅在于“将3-二甲氨基丙胺替换为同等摩尔量的1-(3-氨基丙基)吡咯烷”，产物为棕黄色油状液体收率30％，纯度:97.93％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.45-7.39(m, 2H),7.38-7.33(m,2H),7.32-7.29(m,2H),7.23-7.14(m,2H),5.02(t,J＝5.5Hz,1H),4.98(s,1H),4.79 (t,J＝5.7Hz,1H),4.61(d,J＝5.6Hz,2H),3.82–3.73(m,4H),3.55–3.45(m,4H),3.30(q,J＝6.4Hz, 2H),2.56(t,J＝7.0Hz,2H),2.51(ddt,J＝7.5,5.1,2.5Hz,4H),2.25(s,3H),1.79(dq,J＝6.7,3.3Hz, 6H),13C NMR(126MHz,CDCl3)δ161.89,154.41,152.47,142.87,141.83,135.92,133.41,129.32, 129.24,127.97,127.26,126.75,125.44,66.30,53.73,52.53,45.82,43.38,39.27,23.23,16.44,8.54. HRMS calcd for C29H38N6O:486.3180,found:487.3201(M+H+).
实施例24化合物15d的制备
化合物12e：2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(1-吗啡啉基)-6-N-(1-(3-氨基丙基)哌啶基) 嘧啶
(1)化合物15d的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000221
(2)化学反应步骤：化合物15d的合成方法与实施例21中化合物15a的合成方法相同，不同之处仅在于“3-二甲氨基丙胺替换为同等摩尔量的1-(3-氨基丙基)哌啶”，产物为棕黄色油状液体收率23％，纯度:97.54％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.44-7.39(m, 2H),7.38-7.33(m,2H),7.32-7.28(m,2H),7.23-7.13(m,2H),5.36(s,1H),4.96(s,1H),4.83(d,J＝5.8 Hz,1H),4.61(d,J＝5.6Hz,2H),3.80-3.73(m,4H),3.50(t,J＝4.9Hz,4H),3.28(q,J＝5.8,5.3Hz,2H), 2.41(q,J＝5.5,4.1Hz,6H),2.25(s,3H),1.76(p,J＝6.7Hz,2H),1.60(p,J＝5.6Hz,4H),1.46(q,J＝ 5.9Hz,2H),13C NMR(126MHz,CDCl3)δ162.79,162.52,142.82,141.85,136.14,133.37,129.22, 127.95,127.18,126.73,125.41,117.72,115.39,66.28,54.49,53.30,44.80,43.36,39.27,23.47,22.61,21.91,16.39.HRMS calcd for C30H40N6O:500.3336,found:501.3347(M+H+).
实施例25化合物15e的制备
化合物15e：2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(1-吗啡啉基)-6-N-(1-(3-氨基丙基)吗啡啉基) 嘧啶
(1)化合物15e的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000222
(2)化学反应步骤：化合物15e的合成方法与实施例21中化合物15a的合成方法相同，不同之处仅在于“3-二甲氨基丙胺替换为同等摩尔量的1-(3-氨基丙基)吗啡啉”，产物为棕黄色油状液体收率43％，纯度:97.02％(HPLC)。表征数据：1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.44-7.39(m, 2H),7.37-7.32(m,2H),7.31-7.28(m,2H),7.23-7.16(m,2H),4.92(s,1H),4.63(d,J＝5.7Hz,2H),3.78 (dt,J＝17.4,4.8Hz,8H),3.62(d,J＝5.7Hz,4H),3.35(s,2H),2.56(d,J＝6.9Hz,6H),2.25(s,3H), 1.88(q,J＝6.6Hz,2H).MS(ESI)calcd for C29H38N6O2:502.3,found:503.3(M+H+).
实施例26化合物16a的制备
化合物16a：2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(1-哌啶基)-6-N-(3-(二甲基氨基)丙基)嘧啶
(1)化合物16a的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000231
(2)化学反应步骤：在10mL的单口烧瓶中依次加入4mL甲苯，2-(N-羧基叔丁基酯-2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(4-羧酸叔丁基酯-1-哌嗪基)-6-氯嘧啶(300mg,0.50mmol，即化合物14), 3-二甲氨基丙胺(103mg,1.01mmol)和碳酸铯(329mg,1.01mmol)，用氮气置换瓶中的气体三次，在氮气的保护下加入Pd2(dba)3(92mg,0.10mmol)和X-phos(48mg,0.10mmol)，110℃条件下搅拌反应12小时，反应液用旋转蒸发仪旋干。随后加入三氟乙酸0.9ml，苯甲醚0.05ml 和甲基苯基硫醚0.05ml室温搅拌反应12小时，然后用氮气吹掉过多的三氟乙酸，用饱和的碳酸氢钠水溶液把反应液调制弱碱性(pH约8-9)，然后用二氯甲烷萃取两遍并用无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪浓缩有机相，最后用柱色谱分离(二氯甲烷：甲醇＝100:1,v/v)得到棕黄色油状液体80 mg，收率34％，纯度:98.68％(HPLC)。表征数据：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.42(dd,J＝8.1,6.7Hz,2H),7.37–7.32(m,2H),7.32-7.29 (m,2H),7.20(t,J＝7.5Hz,1H),7.16(dd,J＝7.6,1.5Hz,1H),4.99(s,1H),4.62(d,J＝5.7Hz,2H), 3.55(t,J＝5.0Hz,4H),3.31(t,J＝6.8Hz,2H),2.92(t,J＝5.1Hz,4H),2.47(t,J＝6.7Hz,2H),2.31(s, 6H),2.25(s,3H),1.80(p,J＝6.7Hz,2H).MS(ESI)calcdfor C27H37N7:459.3,found:460.3(M+H+)。
实施例27化合物16b的制备
化合物16b：2-(2-甲基-3-苯基苄氨基)-4-(1-哌啶基)-6-N-(3-(二乙基氨基)丙基)嘧啶
(1)化合物16b的化学结构式：
Figure BDA0002452013190000232
(2)化学反应步骤：化合物16b的合成方法与实施例26中化合物16a的合成方法相同，不同之处仅在于“将3-二甲氨基丙胺替换为同等摩尔量的3-二乙氨基丙胺”，产物为棕黄色油状液体收率26％，纯度:97.36％(HPLC)。表征数据：
1H NMR(500MHz,Chloroform-d)δ7.44-7.39(m,2H),7.38-7.32(m,2H),7.32-7.29(m,2H),7.20 (t,J＝7.5Hz,1H),7.15(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),5.26(s,1H),4.97(s,1H),4.85(s,1H),4.62(d,J＝5.6 Hz,2H),3.59-3.43(m,4H),3.27(t,J＝6.7Hz,2H),2.98-2.87(m,4H),2.53(q,J＝7.2Hz,6H),2.25(s, 3H),1.74(p,J＝6.7Hz,2H),1.04(t,J＝7.1Hz,6H),13C NMR(126MHz,DMSO)δ164.30,162.85, 161.42,141.84,141.65,139.64,132.35,129.13,128.14,127.76,126.72,125.09,48.79,46.00,42.55, 42.31,41.09,37.88,23.89,15.92,8.94.HRMS calcd for C29H41N7:487.3496,found:488.3479(M+H+).
实施例28.本发明27个化合物对癌细胞细胞毒性的影响，CCK-8实验分析：
将本发明实施例1-27制备的27个化合物均标记为待测药物。将待测试的肿瘤细胞在RPMI 1640、10％FBS、penicillin-streptomycine培养基里于5％CO2中37℃恒温培养。使用对数生长期的肿瘤细胞，以每孔5000个细胞数量铺板(96孔板)，铺板的体积95μL，往96孔板周围一圈的孔里加入100μLPBS缓冲液(pH＝7.4)。另外设置空白的对照孔(只加入培养液)，将肿瘤细胞放置在37℃培养箱中培养20h待用。再次，配置相应浓度的待测药物，每孔加药1μL与培养液混匀，以避免药物浓度分布不匀。对照组用1％浓度的DMSO，随后继续培养24h。孵育结束后，取出96 孔板，每个孔中加入10μL CCK-8试剂，轻轻摇动孔板使试剂能分布均匀，37℃培养箱中培养1h。用酶标仪Molecular Devices M4读取96孔板每孔在450nm光波长下的吸光度值，计算细胞的增殖活力，三次实验结果平均值±SD作为实验最终结果。紫衫醇(Paclitaxel)作为阳性对照。
肿瘤细胞的增殖活力计算公式：细胞活力(％)＝[A(加药组)-A(空白组)]/[A(0加药组)-A(空白组)]×100；其中，A(加药组)：具有肿瘤细胞、CCK-8试剂和待测药物溶液的孔的吸光度；A(空白组)：具有培养基和CCK-8试剂而没有肿瘤细胞的孔的吸光度；A(0加药组)：具有肿瘤细胞、CCK-8 试剂、1％DMSO而没有待测药物溶液的孔的吸光度。其中化合物15a-d和16b对A549(肺癌细胞)、HePG2(肝癌细胞)、HT-29(人结肠癌细胞)、SK-OV-3(人卵巢癌细胞)以及正常的人胚肺成纤维细胞(MRC-5)的毒理活性测试结果最好，本发明实施例制备的27个化合物的毒性实验结果如表1半数抑制浓度IC50(μM)。
表1化合物对九种癌细胞和正常的人胚肺成纤维细胞半数抑制浓度IC50(μM)
Figure BDA0002452013190000251
实施例29
测试化合物15a-d和16b对癌细胞细胞迁移作用的影响，细胞划痕实验分析：将化合物15a-d 和16b均标记为待测药物。铺板之前在孔板底部统一横向画线，方便后期的拍照以及实验结果的一致性。将处于对数生长期的肿瘤细胞接种在12孔板上，每孔大概10-20万个细胞。当单层细胞的融合度达到70-80％的时候，使用移液枪枪头沿着用记号笔画好的线垂直在孔板底部再画一条线，尽量保证每次划痕的宽度状态一致。随后用PBS缓冲液(pH＝7.4)清洗多余的细胞，记录划痕的位置并且拍照记录。设置三个浓度梯度分别为0.1μM，0.2μM，0.4μM，实验组中加入待测药物，对照组中加入无血清培养液，培养箱孵育24h。孵育结束后取出肿瘤细胞，用光学显微镜拍照，记录划痕的位置。计算前后测量的相对位置，得到待测药物干预下肿瘤细胞的迁移抑制率。通过抑制率公式:抑制率(％)＝(对照组细胞的平均迁移距离-实验组细胞的平均迁移距离)/对照组细胞平均迁移距离，计算不同浓度的待测药物对肿瘤细胞迁移的抑制能力，三次实验得到的数据取平均值±SD作为最终的细胞迁移抑制率。
通过划痕实验检测不同浓度的15a-d和16b对A549细胞、HepG2细胞、HT-29细胞和SK-OV-3 细胞迁移的影响。0.6μM的16b对A549细胞的迁移率为42.37％，0.6μM的15a对HepG2细胞的迁移率为77.03％，0.6μM的15c对HT-29细胞的迁移率为78.68％，0.6μM的15d对SK-OV-3 细胞的迁移率为39.65％。此外，15d对SK-OV-3细胞的抑制作用最大，这些结果表明15a，15c， 15d和16b可以有效的抑制四种肿瘤细胞的伤口愈合，对癌症的转移有良好的抑制作用，实验结果如图1-4所示。其中图1-4中的1％DMSO为无血清培养液中加入1wt％DMSO对照组的测试结果。
实施例30.本发明15个化合物影响PD-1/PD-L1结合的能力：
将化合物3、4e-f、5a-b、11b-c、12a、12c、15a-d和16a-b这15个化合物均标记为抑制剂小分子，BMS-202作为抑制剂小分子的对照实验。
首先将蛋白稀释到各自要求的浓度，解冻Tag1-PD-L1蛋白溶液，用缓冲稀释液(diluent)稀释5倍；解冻Tag2-PD1蛋白溶液，用缓冲稀释液稀释5倍；解冻anti-Tag1-Eu3+溶液，用检测缓冲液(detection buffer)稀释100倍；解冻anti-Tag2-XL665溶液，用检测缓冲液稀释25倍。然后在 96孔板中实验组每孔分别加入2μL不同梯度的抑制剂小分子溶液和对照抗体溶液，4μL PD-L1-Tag1，4μL PD1-Tag2。室温保存15min。再加入5μL anti-Tag1-Eu3+和5μL anti-Tag2-XL665 的混合液，密封室温保存2h。且设置多个对照组：阳性对照(无抑制剂)，阴性对照(无抑制剂和Tag1-PD-L1)，Eu3+螯合物对照(仅有anti-Tag1-Eu3+)，检测缓冲液对照，使得每孔溶液体积都为20μL，操作同实验组。最后检测荧光发射，处理数据。结果显示化合物16b具有最好的抑制 PD-1/PD-L1相互作用的能力，IC50值为5.153μM，具有良好的生物活性，HTRF方法测定不同浓度、种类的抑制剂小分子对PD-1/PD-L1相互作用的影响能力结果如图5所示，在图5中纵坐标的吸光值比值＝665nm处地吸光值除以620nm处地吸光值的计算结果。
本说明书所述的内容仅仅是对发明构思实现形式的列举，本发明的保护范围不应当被视为仅限于实施例所陈述的具体形式。

Claims (10)

1.一种联苯-嘧啶偶联物，其特征在于其结构通式如式(Ⅰ)所示：
Figure FDA0002452013180000011
其中，R1选自H、卤素、C1-C3氟代烷基、吗啡啉基、哌嗪基、吡咯烷基或二甲氨基；R2选自卤素、二甲氨基、二乙氨基、吗啡啉基、哌嗪基、吡咯烷基、哌啶基、N-(3-二甲基氨基)丙基、N-(3-二乙基氨基)丙基、N-(1-(3-氨基丙基)吡咯烷基)、N-(1-(3-氨基丙基)哌啶基)或N-(1-(3-氨基丙基)吗啡啉基)。
2.如权利要求1所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于包括以下三种合成路线中的其中一种：
路线一：
Figure FDA0002452013180000012
路线二：
Figure FDA0002452013180000021
路线三：
Figure FDA0002452013180000022
3.如权利要求2所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线一的过程b中，式(2)所示化合物与2-氨基-4,6-二氯嘧啶发生亲核反应生成式(3)所示化合物，反应的温度为80-100℃，优选为90℃，反应时间5-7小时，优选为6小时，反应过程中选用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂。
4.如权利要求2所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线一的过程c中，式(3)所示化合物与二甲胺、二乙胺、吡咯烷、哌啶、吗啡啉或哌嗪发生反应生成式4a-f所示化合物；制备化合物4a时的温度为80-100℃，优选为90℃，反应时间5-7小时，优选为6小时，反应过程中选用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂；制备化合物4b时的温度为回流温度，反应时间11-13小时，优选为12小时，反应过程中选用乙腈作溶剂；制备化合物4c-f时的温度为30-50℃，优选温度为40℃，反应时间2-4小时，优选为3小时，反应过程中选用乙腈作溶剂。
5.如权利要求2所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线一的过程d中，式4a-f所示化合物与吡咯烷或吗啡啉反应生成目标产物，反应的温度为140-160℃，优选为153℃，反应时间5-7小时，优选为6小时，反应过程中选用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂。
6.如权利要求2所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线二的过程c中，反应的温度为80-100℃，优选为90℃，反应时间11-13小时，优选为12小时，反应过程中选用N,N-二甲基甲酰胺作溶剂。
7.如权利要求2所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线三的过程a中，式4a或式4f化合物上枝接Boc基团反应的温度为室温，反应时间2-4小时，优选为3小时，反应过程中选用二氯甲烷作溶剂。
8.如权利要求2所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线三的过程b中，式13或式14化合物与3-二甲氨基丙胺发生偶联反应，偶联反应的温度100-120℃，优选温度为100°，反应时间11-13小时，优选为12小时，反应过程中选用甲苯作溶剂。
9.如权利要求8所述的一种联苯-嘧啶偶联物的制备方法，其特征在于路线三的过程c中，偶联反应后的产物与三氟乙酸发生脱Boc反应生成目标产物，脱Boc反应的温度为室温，反应时间11-13小时，优选为12小时，反应过程中选用三氟乙酸做溶剂。
10.如权利要求1所述的联苯-嘧啶偶联物在制备抗肿瘤药物中的应用。
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