CN111557947A - 田蓟苷在制备提高LXR-α的表达的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了田蓟苷在制备提高LXR‑α的表达的药物中的应用，属于医药技术领域，以H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤为模型，以LXR‑α作为分子靶标，确定了田蓟苷在LXR‑α表达中的调控，为寻找开发有效地防治心脑血管疾病的药物提供了依据。

Description

田蓟苷在制备提高LXR-α的表达的药物中的应用

技术领域

本发明涉及田蓟苷的新用途，具体涉及田蓟苷在制备提高LXR-α的表达的药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

田蓟苷(Tilianin)是新疆维吾尔药材香青兰(Dracocephalum Moldevica L.)的主要活性成分，属于黄酮类化合物，化学名为：金合欢素-7-O-葡萄糖苷，分子式为C₂₂H₂₂O₁₀，分子量为446.40，结构式如下式：

研究发现田蓟苷对大鼠心肌缺血/再灌注损伤有显著保护作用，并且对大鼠动脉粥样硬化等病理状态均有显著改善作用。

缺血性心脏病是危害人类健康的首要疾病，临床治疗虽然可以通过溶栓、介入疗法、冠状动脉旁路移植术等手段提高患者的生存率，但随之而来的缺血/再灌注损伤(myocardium ischemia/reperfusion injury，MIRI)却加剧了心肌损伤和心功能紊乱，并使冠脉再通或灌流重建的疗效显著降低。因此，探索抗缺血/再灌注损伤有效靶点及开发新型高效低毒的防治药物，成为心血管药物研发和临床心脏病学最活跃的热点。

肝X受体(LXRs)是核受体家族成员之一，主要具有抑制细胞炎症、细胞凋亡及调节体内脂肪代谢、糖代谢等作用。在心血管方面的研究中，发现LXRs与缺血/再灌注损伤、胆固醇逆向转运、动脉粥样硬化、心肌肥厚等关系密切。

LXRs包括两种同源亚型LXR-α和LXR-β。研究发现，正常心肌组织中LXR-α和LXR-β均有表达，但LXR-α在缺血/再灌注过程中明显上调而LXR-β无变化。近期研究表明，给予LXRs激动剂能明显减少细胞凋亡和梗死面积并改善收缩功能。作用机制研究发现，在心肌缺血/再灌注过程中，激活LXRs可以明显改善心肌组织的氧化应激、硝化应激和炎症反应，通过减少促凋亡的p38MAPK磷酸化和增加促进细胞存活的Akt、ERK的磷酸化信号通路抑制内质网应激和线粒体介导的内源性细胞凋亡程序。

进一步研究发现，在心肌缺血/再灌注损伤过程中，LXR-α通过抗氧化/硝化应激和抗炎作用从而抑制内质网应激和线粒体介导的内源性细胞凋亡程序。由此可见，LXR-α是机体抗心肌缺血/再灌注损伤的重要防御因子，它将成为新的治疗缺血性心脏病的分子靶点。因此，靶向LXR-α信号转导途径将为抗心肌缺血/再灌注损伤的药物研究提供有效靶点和关键途径。

在此背景下，寻找LXRs受体活性调节剂化合物具有重要的意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了田蓟苷在制备提高LXR-α的表达的药物中的应用，以H9c2心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤为模型，以LXR-α作为分子靶标，确定了田蓟苷在LXR-α表达中的调控，为寻找开发有效地防治心脑血管疾病的药物提供了依据。

为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

田蓟苷在制备提高LXR-α的表达的药物中的应用。

具体的，田蓟苷或其药学上可接受的盐或含有它们中任何一种的药物组合物在制备提高LXR-α的表达的药物中的应用。

附图说明

图1为本发明实施例1倒置荧光显微镜观察细胞形态图；

图2为本发明实施例2田蓟苷对GSK2033干预后的H/R的H9c2细胞存活率的影响结果图；

图3为本发明实施例3田蓟苷对GSK2033干预后的H/R的H9c2细胞凋亡的抑制作用结果图；

图4为本发明实施例4qRT-PCR检测不同药物干预对H9c2细胞LXRαmRNA表达水平的影响结果图；

图5为本发明实施例5不同药物干预对H9c2细胞LXR-α蛋白水平影响结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1、H9c2心肌细胞培养与分组

H9c2心肌细胞培养于含10％胎牛血清的低糖DMEM培养液，37℃、5％CO₂的恒温培养箱中，取对数生长期细胞进行实验。

将正常生长的细胞作为空白对照组、模型组(H/R组)、LXRs拮抗剂(H/R+GSK2033)组、Tilianin组(H/R组+Tilianin)、LXRs拮抗剂+Tilianin组(H/R+GSK2033+Tilianin)。空白对照组和H/R组不给予任何药物，每孔加入完全培养基；H/R+GSK2033组：对H/R组用GSK2300(100nM)的无血清DMEM孵育细胞；H/R+Tilianin组：对H/R组用Tilianin(浓度为10μg·mL^-1)进行干预；H/R+GSK2033+Tilianin组：在H/R+GSK2033组的基础上加用Tilianin(浓度为2.5，5，10，20μg·mL^-1)进行干预，GSK2300预处理均为1h，之后Tilianin预处理均为3h。

2、缺氧/复氧细胞模型的构建

用无糖无血清DMEM培养基作为细胞培养液，置于放有厌氧安宁包的密封盒中，缺氧6h，然后弃去旧培养基，加入10％胎牛血清的低糖DMEM完全培养基37℃、5％CO₂条件下培养进行复氧处理，复氧3h。

3、细胞形态的观察

取对数生长期细胞，以1×10⁵个/mL接种于6孔板中，每孔2mL，培养24h后，实验分为空白组、H/R+GSK2033组、H/R+GSK2033+Tilianin组(Tilianin浓度为5、10μg·mL^-1)进行培养，培养结束后弃去培养液，经PBS溶液冲洗2次后用4％多聚甲醛固定20min，通过倒置光学显微镜观察细胞形态并照相保存。

通过倒置荧光显微镜观察细胞形态，空白对照组细胞形态及生存状态未见异常：细胞数最较多，形态完整，细胞呈完整梭形，单层簇状生长；而H/R+GSK2033组，细胞呈现明显的病理性形态学变化：细胞呈现明显的皱缩，有漂浮的死细胞，胞浆出现空泡；与H/R+GSK2033组相比，HG+GSK2033+Tilianin各组细胞形态呈不同程度好转，其中Tilianin浓度为10μg·mL^-1时，效果最为显著，结果见图1，图1中，a为空白组，b为H/R+GSK2033组，c为H/R+GSK2033+Tilianin，Tilianin浓度为5μg·mL^-1，d为H/R+GSK2033+Tilianin组，Tilianin浓度为10μg·mL^-1。

实施例2

CCK-8检测细胞存活率

6孔板每孔加入10μLCCK-8检测液，置于37℃恒温细胞培养箱避光孵育1h，用酶标仪检测各孔吸光度OD值(检测波长为450nm)，在不含细胞的培养液中加入等量CCK-8溶液，按相同方法测定吸光度作为空白对照孔。并按公式计算细胞存活率：细胞存活率％＝[(实验孔-空白孔)/(对照孔-空白孔)]×100％，结果如图2。

图2显示，与正常组比较，H/R组细胞的存活率明显下降(P<0.01)。H/R+GSK2033组，在H/R组基础上使用GSK2033，细胞的存活率明显小于H/R组(P<0.01)。H/R+Tilianin组与H/R组相比，细胞存活率明显增大(P<0.01)，说明Tilianin具有提高H9c2心肌细胞增殖活力的效用。HG+GSK2033+Tilianin组，与H/R+GSK2033组相比，细胞存活率明显增大(P<0.01)，说明Tilianin明显改善了细胞增殖抑制的作用；与H/R+Tilianin组相比，细胞存活率均低于HG+Tilianin组，但没有显著性差异(P>0.05)，当Tilianin浓度分别为2.5，5，10，20μg·mL^-1时，4个Tilianin给药组之间相比，细胞存活率没有明显差异。

实施例3

Annexin-VFITC/PI双染法观察细胞凋亡情祝

取对数生长期的H9c2心肌细胞，以1×105个/mL接种于直径为35mm的培养皿中，接种到6孔板中，于37℃、5％CO₂培养箱培养。PBS润洗2遍，加1mL胰酶消化100s，离心(1000r·min^-1)5min，弃去上清，收集细胞，用400μL的Annexin-VBindingBuffer重悬细胞，按照Annexin-vFITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书标记细胞，利用流式细胞术检测细胞凋亡率，结果如图3。

图3显示，与正常组比较，H/R后心肌细胞凋亡水平明显提高(P<0.01)；H/R+GSK2033组与H/R组相比，心肌细胞凋亡水平有一定提高(P<0.05)；HG+GSK2033+Tilianin组与H/R+GSK2033组相比，心肌细胞凋亡水平明显降低(P<0.01)，说明Tilianin明显改善细胞凋亡；H/R+Tilianin组与HG+GSK2033+Tilianin组相比，心肌细胞凋亡水平明显降低(P<0.01)。

实施例4

qRT-PCR法检测各组LXR-αmRNA表达

收集细胞，按照TRIzoI试剂盒提取总RNA，检RNA的纯度及浓度。按Trans-Script^TMOne-StepRT-PCRSuperMix试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增反应，按照

PremixExTaq^TMII试剂盒配制PCR体系，引物序列见表1。PCR反应体系：按照QiaGen

Green PCR试剂盒说明书，取各组cDNA样品100ng至200μL去RNA酶EP管中，各加入目的基因0.7μL上引物与0.7μL下引物混匀后，再各加10μL2×SYBERGreen试剂，最后，分别加ddH2O至总体积为20μL，具体条件如表2所示。实验数据根据目的基因和内参基因GAPDH的Ct值，采用2-ΔΔCt法计算出各样本中LXR-αmRNA的相对表达量。

表1 PCR引物序列

表2 RT-qPCR实验条件

与空白组比较，H/R可使组LXR-αmRNA水平轻微上调，但无统计学差异(P>0.05)。与H/R组相比：H/R+GSK2033组LXR-αmRNA表达水平明显受到抑制(P<0.01)，而H/R+Tilianin组LXR-αmRNA表达明显上调(P<0.01)。但在GSK2033干预的基础上使用Tilianin，与H/R+GSK2033组比较，明显上调LXR-αmRNA表达的作用(P<0.01)，但与H/R+Tilianin组相比，LXR-αmRNA表达无统计学差异(P>0.05)，结果见图4。

实施例5

Westernblot检各组LXR-α蛋白表达

收集细胞，提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳分离总蛋白，转移至PVDF膜，含5％脱脂牛奶的TBST溶液封闭，加入相应一抗(1:1000稀释)，4℃孵育过夜，次日用TBST摇洗3次，每次10min，加入二抗(1:2000稀释)，室温避光孵育2h，TBST洗涤3次，每次10min，加入显色剂，放入凝胶成像仪曝光，拍照保存。实验结果用ImageLab进行灰度分析，实验重复3次，目的蛋白表达水平＝(目的蛋白/内参蛋白)，结果如图5。

图5表明，与空白组比较，H/R可使LXR-α蛋白表达水平轻微上升，但无统计学差异(P>0.05)。与H/R组相比：H/R+GSK2033组LXR-α蛋白表达受到明显抑制(P<0.01)，H/R+Tilianin组LXR-α蛋白表达明显上调(P<0.01)，而在LXRs拮抗剂干预的基础上使用Tilianin则能发挥Tilianin上调LXRa蛋白表达的作用(P<0.01)，而与H/R+Tilianin组相比LXRα蛋白表达明无统计学差异(P>0.05)。

由上实施例可知，本发明通过H/R处理模拟心肌细胞缺血再灌注过程，从细胞水平探讨Tilianin对LXRs拮抗剂(GSK2033)干预后的H/R的H9c2细胞保护作用。实验结果表明，实验H/R+GSK2033+Tillianin组，在使用GSK2033的基础上再用Tilianin干预，与H/R+GSK2033相比，能明显降低H/R对H9c2心肌细胞增殖活力的抑制及细胞凋亡率。说明Tilianin可以通过影响LXRs的表达来提升心肌细胞的增殖活力，降低细胞凋亡率。

通过qRT-PCR和Western blot测定结果显示，无论是在mRNA，还是蛋白水平，与空白组相比：H/R组LXR-α水平轻微上调，但无统计学差异；与H/R组相比：Tilianin干预可以明显上调LXR-α表达；GSK2033则发挥着明显的抑制作用，但在使用GSK2033的基础上，再用Tilianin干预，LXR-α的表达抑制明显缓解。

证明在LXRs拮抗剂干预的基础上使用Tilianin，可以较大程度抑制LXRs拮抗剂的拮抗作用，提高LXR-α的表达，说明Tillianin预处理减轻H9c2心肌细胞缺氧/复氧损伤作用。

Claims (2)

1.田蓟苷在制备提高LXR-α的表达的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，田蓟苷或其药学上可接受的盐或含有它们中任何一种的药物组合物在制备提高LXR-α的表达的药物中的应用。

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