CN111557306A

CN111557306A - 一种纳米药物制剂及其在防控香蕉枯萎病中的应用

Info

Publication number: CN111557306A
Application number: CN202010433325.4A
Authority: CN
Inventors: 谢江辉; 孙德权; 陆新华; 李普旺; 胡会刚
Original assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Current assignee: South Subtropical Crops Research Institute CATAS
Priority date: 2020-05-21
Filing date: 2020-05-21
Publication date: 2020-08-21
Anticipated expiration: 2040-05-21
Also published as: CN111557306B

Abstract

本发明公开了一种纳米药物制剂及其在防控香蕉枯萎病中的应用，属于生物技术领域，本发明通过研究纳米介孔二氧化硅颗粒(MSNs)、5x‑2细菌发酵液乙醇萃取物、MSNs装载5x‑2细菌发酵液乙醇萃取物及其装载处理后的上清液对香蕉枯萎病的抑菌效果，以及接菌后MSNs和MSNs装载处理组对香蕉枯萎病的防治效果以及生理生化的影响；发现MSNs对香蕉枯萎病菌4号小种抑菌率为13.25％‑16.55％；MSNs和MSNs装载处理可降低其发病率和病情指数，为研制新型防控香蕉枯萎病纳米农药奠定基础。

Description

一种纳米药物制剂及其在防控香蕉枯萎病中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种纳米药物制剂及其在防控香蕉枯萎病中的应用。

背景技术

香蕉枯萎病是一种具有强毁灭性且危害极广的土传性植物真菌病害，是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporuin f.sp.cubense,Foc)侵染而引起的。近年来，香蕉枯萎病菌已被划分为4个生理小种，其致病性也存在差异，其中致病性最强的是4号生理小种。目前，尚未有彻底、有效的防治香蕉枯萎病的方法，对其的防控措施主要采用化学防治、生物防治和选育抗病品种等。化学防治主要采用杀菌剂等化学农药来对其进行防治，而长期使用杀菌剂会造成环境的污染、损害人类身体健康以及产生抗药菌株等问题。利用种群间的相互作用抑制病原菌生长的生物防治，能够持续有效地控制病害，大幅减少环境污染，同时成本也相对较低，因而得到广泛推广应用。目前，香蕉枯萎病的生物防治主要通过筛选有效的拮抗菌，例如枯草芽孢杆菌、放线菌、解淀粉芽孢杆菌等。

近年来，纳米技术的快速发展为解决农业生产上的一些问题提供了新的有效途径。采用纳米技术与传统的植物保护手段相结合，可以有效地预警病虫害、提高药物利用率，显著降低病虫害对农作物造成的不利影响。在众多人工合成的纳米材料中，介孔二氧化硅纳米粒(mesoporous silica nanoparticles，MSNs)由于其具有孔径大、表面积大、毒性小、稳定性高、形貌可控、易于表面功能化等独特性能，受到越来越多的关注，因此利用纳米材料制备的控释型农药成为新型农药研发的主流。Chen报道了一种利用介孔纳米颗粒作为载体制备的潜在生物农药藤黄绿菌素的缓释配方，以避免其快速降解。将杀虫剂吡虫啉有效地装载到不同孔径、形态的MSNs中，用于白蚁防治。此外，有研究表明病原菌与植物互作的过程中，硅元素能诱导植物体内相关的防卫基因表达，从而使其体内相关抗氧化酶(POD、PAL、SOD、PPO等)的活性提高，进而使植物抗病性增强。而纳米硅材料由于其独特的特性能够使植物对营养素进行有效的吸收和利用，从而使植物的抗逆能力增强，例如有研究表明MSNs特殊的物理特性和结构特点导致其对番茄早疫病菌的抗真菌效果很高，降低了病情指数。Suriyaprabha等研究发现，纳米二氧化硅(20-40nm)处理使玉米对尖孢镰刀菌和黑曲霉菌的抗性显著增强。而MSNs对于香蕉枯萎病的作用尚未有报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种药物制剂及其在防控香蕉枯萎病中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明通过研究MSNs、5x-2细菌发酵液乙醇萃取物、MSNs装载5x-2细菌发酵液乙醇萃取物及其装载处理后的上清液对香蕉枯萎病的抑菌效果，以及MSNs和MSNs装载处理后香蕉植株盆栽实验，以期为香蕉枯萎病菌安全有效的防治方法奠定基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种用于防控香蕉枯萎病的纳米药物制剂，包括纳米介孔二氧化硅。

进一步地，所述纳米介孔二氧化硅的有效浓度为10-100mg/L。

本发明还提供一种用于防控香蕉枯萎病的纳米药物制剂组合物，包括纳米介孔二氧化硅和5x-2细菌发酵液乙醇萃取物。

进一步地，所述5x-2细菌发酵液乙醇萃取物装载于所述纳米介孔二氧化硅中。

进一步地，所述纳米介孔二氧化硅的有效浓度为10-100mg/L。

本发明还提供一种上述的纳米药物制剂在防控香蕉枯萎病中的应用。

本发明还提供一种上述的纳米药物制剂组合物在防控香蕉枯萎病中的应用。

进一步地，所述应用的方法包括浇灌或喷施。

进一步地，所述应用的方法为浇灌，浇灌量以纳米介孔二氧化硅计为10-100mg/L。

本发明公开了以下技术效果：

迄今对香蕉枯萎病的防治尚未有彻底、有效的方法。本发明发现MSNs和MSNs装载可显著降低香蕉枯萎病的发病率和病情指数，同时MSNs对香蕉枯萎病菌4号小种有一定的抑制作用(抑菌率为13.25％-16.55％)，但其机制尚不清楚；研究表明MSNs的抗真菌作用可能是由于其体积很小，可以通过其表面羟基与细胞壁的脂多糖之间形成氢键从而使细胞壁的破裂来实现。MSNs和MSNs装载处理可显著降低香蕉枯萎病的发病率和病情指数。MSNs处理香蕉枯萎病的发病率和病情指数比对照降分别降低了53.33％和30.83％；而MSNs装载处理香蕉枯萎病的发病率和病情指数比对照降分别降低了43.33％和25％。

本发明发现施用MSNs及装载5x-2细菌发酵液乙醇萃取物的MSNs不仅增加了其鲜/干重、株高和茎围，同时也提高了叶片叶绿素a和叶绿素b的含量，有利于香蕉苗的生长。

本发明发现，施用MSNs及装载5x-2细菌发酵液乙醇萃取物的MSNs显著降低了香蕉苗根系的MDA、H₂O₂及O₂ ^-含量，而SOD、POD、PAL、PPO酶活性显著提高，使香蕉根部枯萎病症状减轻。这也表明MSNs及其作为载体应用于香蕉枯萎病的防治有一定的效果。

生物防治目前是对香蕉枯萎病生物防治的研究重点，现阶段主要通过筛选拮抗菌，利用拮抗菌及其发酵产物对香蕉枯萎病进行防治；本发明采用5x-2细菌发酵液乙醇萃取物对香蕉枯萎病菌4号小种的抑菌率达到38.10％，但由于环境的复杂，会导致拮抗菌及其发酵产物对香蕉枯萎病防治效果不稳定，而MSNs具有孔径大、表面积大、毒性小、稳定性高、形貌可控、易于表面功能化等独特性能，因此可利用MSNs制备控释型农药，在传统农药中加入MSNs能吸附大量农药分子，形成农药-MSNs复合物，容易被植物叶片粗糙表面截留且在叶片上表现出较高的粘附性能；从而减少农药损失，为植物提供了有效的病害防治途径。

本发明通过比较装载乙醇萃取物MSNs与5x-2细菌发酵液乙醇萃取物的抑菌率，发现其在MSNs浓度为100mg/L时，其抑菌率并无显著性差异(p>0.05)，且经处理的上清液仍然具有较高的抑菌率(33.33％-35.48％)。MSNs和MSNs装载处理可显著降低香蕉枯萎病的发病率和病情指数。MSNs处理香蕉枯萎病的发病率和病情指数比对照降分别降低了53.33％和30.83％；而MSNs装载处理香蕉枯萎病的发病率和病情指数比对照降分别降低了43.33％和25％。为研制新型防控香蕉枯萎病纳米农药奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为不同浓度的MSNs对香蕉枯萎病菌4号小种的影响，其中，A.0mg/L；B.10mg/L；C.20mg/L；D.40mg/L；E.60mg/L；F.100mg/L；

图2为不同处理对香蕉枯萎病菌4号小种的抑菌效果，其中，A.对照；B.MSNs装载(20mg/L)；C.MSNs装载(100mg/L)；D.5x-2细菌发酵液乙醇萃取物；E.MSNs处理上清液(20mg/L)；F.MSNs处理上清液(100mg/L)；

图3为不同处理组90d的香蕉苗，其中，A.对照；B.MSNs处理组；C.MSNs装载处理组；

图4为不同处理下接种香蕉枯萎病蕉苗根的MDA的含量，图中*表示不同处理间差异显著(p<0.05)；

图5为不同处理下接种香蕉枯萎病蕉苗根系H₂O₂和O₂ ^-的含量，图中*表示不同处理间差异显著(p<0.05)；

图6为不同处理下接种香蕉枯萎病蕉苗根系SOD和POD酶活性的影响；

图7为不同处理下接种香蕉枯萎病蕉苗根系PAL和PPO酶活性的影响。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

本发明所述的香蕉枯萎病，是指由1号生理小种、热带4号生理小种或亚热带4号生理小种从香蕉的根系侵入球茎或假茎，进入维管束组织，阻塞水分及养分的供养，最终造成香蕉整株枯死的真菌性病害。本发明实施例以致病性最强的4号生理小种为例。

实施例1

1.材料与方法

1.1材料

供试拮抗细菌菌株5x-2，供试病原真菌：香蕉枯萎病菌4号小种，巴西香蕉苗及颗粒直径为20nm，介孔直径为3.0nm的MSNs均由中国热带农业科学院南亚热带作物研究所香蕉课题组提供。培养基：固体PDA培养基，固体/液体LB培养基。

1.2方法

1.2.1 MSNs的抑菌实验

将MSNs加入到PDA培养基中使其终浓度分别为0、10、20、40、60、100mg/L，超声1h后，在121℃条件下灭菌20min，然后进行10min超声处理倒板；指示菌为香蕉枯萎病菌4号小种Foc4，取香蕉枯萎病菌4号小种直径为5mm菌丝块接种于培养基中心位置，设3个重复，常温下培养5d，采用十字交叉法测量菌落大小，并计算其抑菌率(抑菌率＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落直径×100％)

1.2.2 5x-2发酵液乙醇萃取物提取

采用平板划线法活化纯化的5x-2菌株，常温培养24h，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃、180rpm/min振荡12h，制备种子液；按2％的接种量接种于相应的LB液体培养基中，37℃、180rpm/min振荡培养96h，分装离心得到发酵原液；在发酵原液中加入等体积的无水乙醇，4℃静止3d。于55℃旋蒸除去乙醇溶剂，再加入无菌水溶解，过滤器(0.22μm)除菌，备用。

1.2.3不同处理发酵液乙醇萃取物的抑菌实验

MSNs对发酵液乙醇萃取物的装载：称取0.01、0.1g的MSNs，在121℃条件下灭菌20min后，分别加入5ml发酵液乙醇萃取物，超声1h后，放入4℃冰箱过夜，然后8000rpm离心10min，分别保存上清液与沉淀；在沉淀中加入相应体积的水重悬、超声30min后备用；抑菌实验：采用平板打孔抑菌实验方法，以无菌水为对照，分别测定发酵液乙醇萃取物以及经不同浓度MSNs处理过的上清液的抑菌活性。将病原真菌置于平板中心位置，在距PDA平板中心的25mm处打孔，每孔加入100μL处理液，设3个重复。28℃培养5d后测量计算各处理的抑菌率和抑菌带宽度(抑菌带宽度＝(抑菌带外径的平均值-试样直径)/2)；将重悬过的沉淀分别加入相应体积50℃左右的PDA培养基中，使MSNs终浓度分别为10、100mg/L；然后进行10min超声处理倒板；取香蕉枯萎病菌4号小种直径为5mm菌丝块接种于培养基中心位置，设3个重复，常温下培养5d，采用十字交叉法测量菌落大小，并计算其抑菌率。

1.2.4盆栽实验

根据预实验设置实验组：处理1：MSNs 100mg/L；处理2：MSNs装载乙醇萃取物；对照组(CK)：伤根感染Foc4病原菌，施用清水；选取有5～6片叶子长势一致的巴西香蕉幼苗，用手术刀三个方向伤根，然后根际土壤处浇灌20mL的病原菌悬浮液(浓度为106CFU/mL)；进而按不同处理进行浇灌，每株100mL，CK施入等量清水；分别在3d、5d再重复施入各处理液，共计3次。分别在0、1、3、5、7d时取香蕉苗的根，清洗干净液氮速冻，存放于-80℃冰箱；测定丙二醛(MDA)、过氧化氢(H₂O₂)和超氧阴离子(O₂ ^-)含量，以及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)等酶活性。MDA含量、SOD、POD及PPO酶活采用史树德等^[21]方法测定；H₂O₂和O₂ ^-含量及PAL酶活性采用南京建成生物工程研究所研发的试剂盒。病情指数：根据Mak等的方法，可将香蕉枯萎病发病情况分为5级。0：无症状；1：有轻微条纹或者底部叶片黄化；2：出现条纹或者底部叶片大部分黄化；3：出现大量条纹或者几乎全部叶片黄化；4：整株死亡。发病率＝发病株数/总株数×100％；

1.2.5数据处理

采用Excel 2016、SPSS20.0统计软件进行数据分析比较。

2结果与分析

2.1 MSNs对香蕉枯萎病菌的影响

表1 MSNs对香蕉枯萎病菌4号小种的影响

注：表中数据为平均数±标准差，同列数据后不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

设置不同浓度的MSNs来测定其对香蕉枯萎病菌4号小种的抑菌率大小。MSNs对其抑菌率为13.72％～16.55％，而不同浓度之间抑菌率并无显著性差异(p>0.05)(表1、图1)；这说明MSNs对香蕉枯萎病菌4号小种有一定的抑菌作用。

2.2发酵液乙醇萃取物不同处理抑菌活性测定

经过MSNs装载或吸附处理，10mg/L MSNs的抑菌率显著低于乙醇萃取物抑菌率(p<0.05)，而其上清液的抑菌率与乙醇萃取物并无显著性差异(p>0.05)(表2、图3)；100mg/LMSNs的抑菌率与乙醇萃取物并无显著性差异(p>0.05)，但其上清液的抑菌率显著低于乙醇萃取物抑菌率(p<0.05)(表2、图3)；发酵液乙醇萃取物的不同处理均有抑菌活性，而经过MSNs装载会提高乙醇萃取物的利用率。

表2 不同处理对香蕉枯萎病菌4号小种的抑菌效果

2.3不同处理对香蕉植株生长的影响

表3 不同处理对香蕉植株生长的影响

由表3可知，MSNs及MSNs装载两个处理组香蕉苗的株高、茎围、鲜重、干重都显著高于CK组(p<0.05)；与CK组相比，MSNs处理组香蕉苗的株高、茎围、鲜重、干重分别增加了31.43％、28.48％、103.12％、98.63％；而MSNs装载处理组香蕉苗的株高、茎围、鲜重、干重分别增加了23.57％、20.61％、59.57％、56.16％；这也表明MSNs及MSNs装载对香蕉苗有促生作用；植物植株受到病原菌侵染，会破坏组织中的叶绿素或抑制叶绿素的合成，进而使植物的光合作用受阻进而影响其生长发育，由表3可知，叶绿素a及叶绿素b的含量两个处理组都显著高于CK；MSNs处理组叶绿素a和叶绿素b分别增加了47.83％、20.00％；而MSNs装载处理组分别增加了30.43％、20.00％。

2.4不同处理对香蕉枯萎病防效的影响

MSNs和MSNs装载处理组可显著降低香蕉枯萎病的发病率和病情指数(表4)，不同处理对香蕉枯萎病的防治效果有显著的差异。MSNs处理组香蕉枯萎病的发病率和病情指数显著低于其他处理，而防治效果显著高于MSNs装载处理组，其防治效果比MSNs装载处理组高23.30％。

表4 90d后不同处理对香蕉枯萎病的防效

2.5不同处理对接种香蕉枯萎病菌香蕉苗根系丙二醛(MDA)的影响

由图4可知，CK组在5次取样过程中MDA含量呈升高的趋势，在3d后，MDA含量显著高于MSNs处理组，表明该处理该时期香蕉苗受病原菌侵染严重。MSNs处理组在整个处理过程中，丙二醛含量始终处于一个较低水平，呈先升后下降趋势，在3d后显著低于CK；而MSNs装载处理组呈先升后降趋势，在7d时显著低于CK。在第7d时，两个处理组MDA的含量比CK组分别低38.93％、27.86％。

2.6不同处理对接种香蕉枯萎病菌香蕉苗根系H₂O₂和O₂ ^-含量的影响

由图5可知，CK组在5次取样过程中H₂O₂和O₂ ^-含量呈升高的趋势，在1d后，H₂O₂和O₂ ^-含量显著高于MSNs处理组(p<0.05)；MSNs和MSNs装载处理组在整个处理过程中，H₂O₂含量始终处于一个较低水平，呈先升后下降趋势。两个处理组H₂O₂和O₂ ^-的含量在第7d时都显著低于CK组(p<0.05)，MSNs处理组分别高53.45％、10.29％；MSNs装载处理组分别高50.00％、8.91％。

2.7不同处理对接种香蕉枯萎病香蕉苗根系防御酶活性的影响

2.7.1 SOD和POD酶活性

如图6所示，CK组、MSNs及MSNs装载处理组随着时间的增长，SOD和POD酶活性呈先升后降的趋势。在第0d时，各处理SOD和POD活性相差无几，基本趋于相等，而1d后MSNs处理组SOD和POD均显著高于CK处理组(p<0.05)；MSNs处理组在第5d时，其SOD和POD活性最大，分别为43.17U/(g FW)、337.78U/(g FW·min)，而MSNs装载处理组第3d时SOD和POD酶活性最高分别为39.60U/(g FW)、320U/(g FW·min)；在接菌7d后，MSNs处理组SOD和POD酶活性显著高于CK组，分别高19.31％、21.08％，MSNs装载处理组POD酶活性比CK组高50.60％，显著高于CK组。

2.7.2 PAL和PPO酶活性

如图7所示，在第0d时，各处理PPO与PAL活性相差无几，基本趋于相等。MSNs及MSNs装载处理组随着时间的增长，PPO与PAL活性呈先升后降的趋势；MSNs处理组在3d后均显著高于CK处理组，在第3d时，其PAL活性最大，为8.60U/(g FW)；MSNs装载处理组在1d后均显著高于CK处理组，在第3d时活性最高为10.33U/(g FW)；CK处理组随着时间的增长，PAL活性先升后降，在第1d时活性最大为6.24U/(g FW)。两个处理组PAL和PPO酶活性在第7d时都显著高于CK组(p<0.05)，MSNs处理组分别比CK组高42.80％、15.27％；MSNs装载处理组比CK组分别高21.40％、15.06％。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种用于防控香蕉枯萎病的纳米药物制剂，其特征在于，包括纳米介孔二氧化硅。

2.根据权利要求1所述的纳米药物制剂，其特征在于，所述纳米介孔二氧化硅的有效浓度为10-100mg/L。

3.一种用于防控香蕉枯萎病的纳米药物制剂组合物，其特征在于，包括纳米介孔二氧化硅和5x-2细菌发酵液乙醇萃取物。

4.根据权利要求3所述的纳米药物制剂组合物，其特征在于，所述5x-2细菌发酵液乙醇萃取物装载于所述纳米介孔二氧化硅中。

5.根据权利要求3所述的纳米药物制剂组合物，其特征在于，所述纳米介孔二氧化硅的有效浓度为10-100mg/L。

6.一种权利要求1或2所述的纳米药物制剂在防控香蕉枯萎病中的应用。

7.一种权利要求3-5任一项所述的纳米药物制剂组合物在防控香蕉枯萎病中的应用。

8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述应用的方法包括浇灌或喷施。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用的方法为浇灌，浇灌量以纳米介孔二氧化硅计为10-100mg/L。